双荧光素酶报告基因检测原理
双荧光素酶报告基因 ppt课件
ppt课件
8
在这个过程中：
1.“基因剪刀”
剪切DNA的酶就像一把“基因剪刀”
2.“缝纫针”
连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使 二者连在一起
3.“交通工具”
使用载体好比一辆车子
4.“乘客”
有用基因如IL2好比乘客，车子把乘客送进理想天堂 （宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产
品或开展基因治疗（IL2/LAppKt课→件 抗癌）。
9
一、目的基因的获取
1. 直接从染色体DNA中分离 2. 通过mRNA反的基因 5. PCR扩增目的基因 6. 人工体外合成基因片段
ppt课件
10
ppt课件
11
PUC8 PBUDCE41 YE
pGEX-4T M13 pAdV5
(1)M13 (2)plasmid (3)λ phage (4)casmid (5)BAC (6)YAC 13
常用的报告基因载体类型： 1）basic 载体：不含 P/E,用于检测启动 子活性。 2）control载体：含启动子，用于检测增 强子或沉默子的活性。
受态 2 加入重组质粒，冰浴30分钟，不要震荡 3 42℃水浴60~90S，热休克 4 马上冰浴
ppt课件
17
第七节 筛
抗药性筛选：ampr tetr kanr 插入表达筛选: 蓝白斑筛选： 测序 菌落或噬菌斑杂交筛选 酶切鉴定：插入否？插入方向？
ppt课件
18
转染 ：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新 的遗传标志的过程 。 若此DNA未与宿主细胞DNA整合而获表达，称 “瞬时转染(transient transfection)”； 若与宿主细胞DNA整合并随后者的复制而复制 称“稳定转染(stable transfection)”。
双荧光素酶报告
双荧光素酶报告引言。
双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告是一种常用的生物化学技术，用于研究基因表达调控、信号转导和蛋白质相互作用等生物学过程。
该技术利用荧光素酶和荧光素酶作为报告基因，通过检测其荧光信号的强度来研究基因表达水平和转录因子活性。
双荧光素酶报告技术具有高灵敏度、高通量和高精度的特点，被广泛应用于生物医学研究、药物筛选和基因治疗等领域。
一、双荧光素酶报告的基本原理。
双荧光素酶报告技术是基于荧光素酶和荧光素酶的反应原理。
荧光素酶（Firefly luciferase）是一种生物发光蛋白，它能够氧化荧光素底物产生强烈的荧光信号。
荧光素酶（Renilla luciferase）是另一种生物发光蛋白，它也能够氧化荧光素底物产生荧光信号，但其光谱特性与荧光素酶不同。
利用这两种生物发光蛋白的不同特性，可以同时检测两种基因表达水平或蛋白质相互作用的活性。
二、双荧光素酶报告的实验步骤。
1. 克隆报告基因，首先需要将荧光素酶和荧光素酶的基因分别克隆到适当的表达载体中，以便在细胞中进行表达。
2. 转染细胞，将表达荧光素酶和荧光素酶的载体转染到目标细胞中，使其表达报告基因。
3. 应用底物，添加荧光素底物到转染的细胞中，观察荧光信号的强度。
4. 测量荧光信号，利用荧光素酶检测系统测量荧光信号的强度，得到荧光素酶和荧光素酶的活性。
三、双荧光素酶报告的应用。
1. 研究基因表达调控，双荧光素酶报告技术可以用于研究转录因子对基因表达的调控机制，从而揭示基因调控网络的结构和功能。
2. 研究信号转导通路，双荧光素酶报告技术可以用于研究细胞信号转导通路的活性和调控机制，从而揭示细胞内信号传递的分子机制。
3. 药物筛选，双荧光素酶报告技术可以用于筛选药物对基因表达和信号转导的影响，从而寻找潜在的药物靶点和药物候选物。
4. 基因治疗，双荧光素酶报告技术可以用于评估基因治疗载体的转染效率和基因表达水平，从而优化基因治疗的疗效和安全性。
双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因引言。
双荧光素酶报告基因是一种常用的生物标记物，用于研究基因表达和调控。
它具有高灵敏度、快速检测和定量分析等优点，因此在生物医学研究和药物开发领域得到了广泛应用。
本文将从双荧光素酶报告基因的原理、应用和未来发展等方面进行综述，以期为相关研究提供参考。
一、双荧光素酶报告基因的原理。
双荧光素酶报告基因是一种能够产生荧光信号的基因，它通常由双荧光素酶（Dual-Luciferase）和报告基因组成。
双荧光素酶包括火榴石荧光素酶（Renilla luciferase）和荧光素酶（Firefly luciferase），它们分别与不同的底物反应产生荧光信号。
报告基因则是研究对象的基因序列，它与双荧光素酶组成一个转录单元，用于研究基因表达水平和调控机制。
双荧光素酶报告基因的原理是利用荧光素酶和火榴石荧光素酶分别与其底物反应产生荧光信号，通过检测这两种荧光信号的强度来分析报告基因的表达水平。
这种双荧光素酶系统具有高灵敏度和宽线性范围，能够准确测定低至飞阿尔茨海默病荧光素酶单位的荧光信号。
二、双荧光素酶报告基因的应用。
1. 基因表达调控研究。
双荧光素酶报告基因广泛应用于基因表达调控研究中，可以通过构建报告基因的启动子激活元件来分析转录因子的结合位点和调控机制。
研究人员可以利用双荧光素酶报告基因系统来研究基因的转录调控网络，揭示基因表达的调控机制。
2. 药物筛选和毒性评价。
双荧光素酶报告基因系统在药物筛选和毒性评价方面也有广泛应用。
研究人员可以利用该系统来筛选具有调控作用的化合物，评估药物的毒性和副作用，为药物研发提供重要参考。
3. 细胞信号转导研究。
双荧光素酶报告基因系统还可以用于细胞信号转导研究，通过构建信号通路相关基因的报告基因来分析细胞信号传导的机制和调控网络，为疾病治疗和药物开发提供理论基础。
4. 生物传感器开发。
双荧光素酶报告基因系统还可以应用于生物传感器的开发，通过构建特定的报告基因来实现对特定生物分子的高灵敏度检测，为环境监测和生物医学诊断提供新的手段。
双荧光素酶报告数据分析(3篇)
第1篇摘要：双荧光素酶报告系统（Dual Luciferase Reporter Assays, DLRA）是一种广泛应用于生物科学研究中的细胞功能检测技术。
通过分析荧光素酶的活性，可以评估细胞内信号通路的激活情况，从而研究基因表达调控、细胞增殖、细胞凋亡等多种生物学过程。
本文将对双荧光素酶报告数据分析的方法、注意事项以及结果解读进行详细阐述。
一、引言双荧光素酶报告系统是一种基于荧光素酶活性的细胞功能检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
荧光素酶是一种在细胞内自然存在的酶，能够将荧光素底物催化生成荧光物质。
在双荧光素酶报告系统中，通常使用两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, FL）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase, RL）。
FL的荧光强度通常作为报告基因的活性，而RL的荧光强度则作为内参基因，用于校正实验误差和细胞活力。
二、实验原理双荧光素酶报告系统的基本原理是：将目的基因与荧光素酶基因（FL或RL）的启动子连接，构建报告基因质粒。
将报告基因质粒转染到细胞中，细胞内荧光素酶的活性与目的基因的表达水平成正比。
通过检测细胞内两种荧光素酶的荧光强度，可以评估目的基因的表达水平。
三、实验方法1. 构建报告基因质粒（1）设计荧光素酶基因（FL或RL）的启动子序列，并与目的基因序列连接。
（2）将连接好的基因序列克隆到载体质粒中，构建报告基因质粒。
2. 细胞培养与转染（1）培养细胞至对数生长期。
（2）用脂质体或电穿孔等方法将报告基因质粒转染到细胞中。
3. 荧光素酶活性检测（1）收集转染后的细胞，用荧光素酶底物进行孵育。
（2）使用荧光光度计检测细胞内FL和RL的荧光强度。
4. 数据分析（1）计算FL和RL的相对荧光强度（RFU）。
（2）计算目的基因的表达水平（FL/Rlu）。
四、数据分析方法1. 相对荧光强度（RFU）计算RFU = 荧光强度 / 标准曲线斜率2. 目的基因表达水平计算目的基因表达水平 = FL/Rlu其中，FL为FL的相对荧光强度，Rlu为RL的相对荧光强度。
双荧光素酶报告原理
双荧光素酶报告原理
双荧光素酶报告原理是一种常用的基因表达分析方法，其适用于实时监测和定量分析基因的转录水平。
该方法利用双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告基因系统，通过测量荧光信号的强度来反映目标基因的表达情况。
该系统通常由两种荧光素酶组成，一种是火萤酶（Firefly luciferase），另一种是海洋荧光素酶（Renilla luciferase）。
实验中，将目标基因的启动子区域与火萤酶基因或海洋荧光素酶基因连接，然后转染到细胞中。
当目标基因的转录水平发生变化时，火萤酶或海洋荧光素酶基因也会受到影响。
因此，通过检测这两种荧光素酶的活性，可以间接反映出目标基因的表达水平。
在双荧光素酶报告系统中，实验通常分为两个步骤。
首先，加入火萤酶底物（如D-luciferin），使火萤酶在酶催化下产生荧光信号。
然后，加入终止剂，使火萤酶反应停止，并加入海洋荧光素酶底物（如coelenterazine），使海洋荧光素酶产生荧光信号。
通过荧光检测仪测量这两种荧光素酶的信号强度，可以定量分析目标基因的表达水平。
值得注意的是，在实验设计中，常常会加入内参基因（如β-actin），用以校正实验中的差异。
内参基因是一个稳定表达的基因，在实验中其转录水平不受处理的影响，可以作为表达平衡的参考。
通过将内参基因与目标基因共转染到细胞中，可以通过内参基因的表达水平来校正目标基因的表达水平，提高实验结果的准确性。
总的来说，双荧光素酶报告原理是通过测量火萤酶和海洋荧光素酶的活性来间接反映目标基因的转录水平。
该方法简单、灵敏、可定量，广泛应用于基因表达研究和高通量筛选等领域。
双荧光素酶报告实验详细原理
双荧光素酶报告实验是一种重要的生物技术手段，主要用于基因表达调控研究。
其详细原理如下：
双荧光素酶报告实验主要利用萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海洋腔肠荧光素酶（如Renilla luciferase）这两种具有不同底物和发光颜色的酶。
在实验中，Firefly luciferase和Renilla luciferase被用作报告基因，通过检测它们产生的荧光信号，可以监控和证实微观层面上的分子间相互作用。
实验开始时，将靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR区或lncRNA结合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游。
这样，Firefly luciferase的表达就会受到靶基因转录调控元件的调控，从而反映靶基因的表达情况。
同时，为了消除实验中的误差，如细胞转染效率的差异等，通常会引入包含Renilla luciferase基因的TK载体作为内参。
Renilla luciferase的表达不受靶基因的影响，因此其荧光信号可以作为实验的基准，用于校正其他因素引起的变化。
在实验过程中，给予细胞不同的处理后，裂解细胞并加入底物荧光素（luciferin）。
Firefly luciferase和Renilla luciferase能催化荧光素发出荧光，其发光强度与酶的表达量成正比。
通过检测两种荧光信号的强度，可以判断不同处理组对靶基因转录调控元件的影响。
综上，双荧光素酶报告实验通过结合萤火虫荧光素酶和海洋腔肠荧光素酶的特性，提供了一种高灵敏度和高特异性的方法，用于研究基因表达调控的微观机制。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒
双荧光素酶报告基因检测试剂盒基因检测是一种用于检测个体基因组中特定基因或基因组变异的技术。
它可以用于疾病风险评估、个体药物反应预测、亲子鉴定、疾病诊断和治疗选择等方面。
随着基因检测技术的不断发展，各种基因检测试剂盒也应运而生，其中双荧光素酶报告基因检测试剂盒是其中的一种。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一种用于检测基因变异的试剂盒，它利用双荧光素酶报告系统对基因变异进行定量检测。
双荧光素酶报告系统是一种常用的生物报告系统，它利用双荧光素酶（Luciferase）和荧光素酶（Fluorescein）作为报告基因，通过测定其活性来定量检测目标基因的表达水平或基因变异情况。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒的工作原理是将待检样品中的DNA或RNA提取出来，然后利用特定的引物和探针对目标基因进行扩增和检测。
扩增反应结束后，将扩增产物与双荧光素酶和荧光素酶的底物一起加入检测体系中，通过检测双荧光素酶和荧光素酶的活性来确定目标基因的表达水平或基因变异情况。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简便、结果可靠等特点，广泛应用于临床诊断、科研实验室和药物研发等领域。
它可以用于检测单个基因的变异，也可以用于检测多个基因的变异，满足不同研究和临床需求。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒的应用范围非常广泛，例如在肿瘤领域，可以用于检测肿瘤相关基因的变异情况，评估肿瘤的易感性和预后；在遗传疾病领域，可以用于进行遗传病的基因诊断和风险评估；在药物研发领域，可以用于筛选药物靶点和评估药物的疗效和安全性等。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒的选择和使用需要根据具体的研究目的和样品特点来确定。
在选择试剂盒时，需要考虑目标基因的特点、样品的来源和数量、实验条件和设备的要求等因素；在使用试剂盒时，需要严格按照说明书的操作步骤进行，确保实验的准确性和可重复性。
总之，双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一种重要的基因检测工具，它在临床诊断、科研实验室和药物研发等领域发挥着重要作用。
双荧光素酶报告实验
13
03
参考案例
1
案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLOCADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别 共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶 报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性 。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为 相对荧光素酶活性。实验重复3次。
报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性
。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100
Step2：共转染 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为
14
03
参考案例
1
案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLOCADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别
Step1：构建载体 共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
双荧光素酶报告基因检测原理
荧光素酶（英文名称：Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyralis的萤火虫体内的荧光素酶。
在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。
没有荧光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况相似）。
双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。
检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。
通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。
报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。
通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。
理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。
这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。
相反 , 结合萤火虫 ( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠 ( Renilla reniformis ) 双荧光素酶的系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。
双荧光素酶报告基因检测原理：
将目的基因3’UTR区域或者lncRNA序列构建至载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。
然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。
结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
常用荧光素酶报告基因载体：
1、pRL-TK这个载体是由Promega开发的，pRL-TK是海肾荧光素酶报告载体，含有SV40增强子，质粒图谱如下所示：
2、pGL3-Basic是萤火虫荧光报告载体，图谱如下图所示：
从这两个图谱中可以发现，ppGL3-Basic这个载体主要是用于评估miRNA与靶基因3’UTR的结合，靶基因的3’UTR放在荧光素酶的后面，这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶，而pRL-TK这个载体则表达海肾荧光素酶，将这两个质粒共同转染进入293细胞中来检测荧光时，pRL-TK这个质粒起到一个内参的作用。
3、pmir-GLO将荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶构建到一个载体上，偏差更小且单质粒转染比双质粒共转染更简单。
该质粒也是由promega公司开发的，图谱如下所示：
实验基本流程：
1、重组质粒制备: 制备含有待检测基因Luc/Rluc的重组质粒；
2、共转染: 将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转染，通常24-48h；（选择转染效率较高的HEK-293T细胞或原代细胞等）
3、细胞处理: 双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；
4、荧光检测: 使用酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测
5、数据分析
实验案例：
CDK9是miR-206的靶标(a)，但是CDK9突变型不是miR-206的靶标(b)。
通过构建出荧光素酶报告载体，将荧光素酶与CDK9基因连接(b)，然后转染到细胞内进行检测。
结果表明，miR-206 inhibitor 显著的提高了WT-CDK9的相对荧光素酶活性，但是对MUT-CDK9没有明显的影响(c)。
qPCR测量了CDK9在不同细胞内的表达水平，经过miR-206 inhibitor处理后，CDK9的mRNA表达水平均有明显上升(d)。
以上结果说明，miR-206可以结合CDK9，对CDK9的表达水平进行调控，进而影响细胞周期。