外源基因清除”技术(Gene-Deletor)原理、特点及其潜在应用前景
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
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Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
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外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
40
mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
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marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
生物工程中的基因转导技术与应用
生物工程中的基因转导技术与应用基因转导技术简介生物工程中的基因转导技术是指将外源的基因通过适当的方法导入到宿主细胞内，并使其能够稳定地表达出来。
目前广泛应用的基因转导技术主要包括转染法、病毒介导转导、基因枪法、微泡法等。
其中，转染法是直接将外源基因与一种具有催化功能的物质如聚乙烯亚胺（PEI）混合后作为载体，将混合物滴加到培养细胞上，让其通过细胞膜进入到细胞内，通过细胞内的代谢途径实现基因表达。
这种方法需要大量的外源DNA，而且转染效率较低。
病毒介导转导是指将外源基因与一种病毒蛋白质进行结合，制成一种嵌合病毒，通过感染细胞实现基因转导。
这种方法虽然转导效率高，但对安全性颇有争议，因为嵌合病毒的安全性较难保证。
基因枪法是通过在DNA颗粒场中加速DNA颗粒，使其能够穿透细胞膜并直接进入到细胞核内，实现基因转导。
这种方法相对较为简单，但需要额外的设备和对DNA颗粒的精细操作。
微泡法是近年来发展起来的一种基因转导技术，利用微泡的自然结构和表面的有效载体性质将DNA包裹在内，以达到高效率的基因转导。
这种方法因操作简便、效率高、安全性好等特点而逐渐成为研究热点。
基因转导技术的应用目前，基因转导技术已广泛应用于生物工程领域中的基因修饰、基因克隆、新药开发、基因治疗等方面。
基因修饰是指利用基因转导技术将外源基因导入到细胞内，使其编码的蛋白质与宿主细胞内的蛋白质发生相互作用或交换信息，从而实现基因修饰。
这种方法在生命科学、医学、农业等领域都有所应用。
基因克隆是指将特定的基因序列扩增出来，并对其进行重组、变异等处理，进而实现对基因功能的研究和利用。
基因转导技术在基因克隆研究中起到了至关重要的作用，它能够扩大特定基因序列的数量，并在特定的细胞内实现高效表达。
新药开发是指通过对疾病发生机制和新型药物作用机理的研究，在基因水平上探索新型药物的开发方向。
基因转导技术的应用可以帮助研究人员在基因水平上研究药物作用机理，为新药的开发提供重要的基础研究依据。
基因剪切技术的应用研究
基因剪切技术的应用研究基因剪切技术是一种重要的基因工程技术，已经成为了生命科学领域中的一个重要研究领域。
基因剪切技术可以对基因组进行定向编辑，从而改变基因组中的特定序列，使得某些基因表达被正常调控或者被抑制。
基因剪切技术在医学、农业和工业生产等领域的应用，对于人类的健康和生存，有重要的意义。
一、基因剪切技术的概念基因剪切技术又称基因编辑技术，是一种用于编辑染色体DNA序列的基因工程技术。
它可以对基因组进行精确的定向编辑，从而改变基因组中的特定序列，使某些基因表达被正常调控或被抑制。
基因剪切技术包括ZFNs、TALENs和CRISPR等技术。
二、基因剪切技术的原理基因剪切技术通过引入人工的核酸酶，对目标DNA序列进行裁剪或编辑。
这些核酸酶可以被设计成靶向特定的DNA序列，并引起双链断裂，从而触发DNA修复机制，在修复过程中对目标序列进行编辑或者剪切。
三、基因剪切技术的应用3.1 医学应用基因剪切技术在医学方面的应用主要涉及到基因治疗、癌症治疗和传染病治疗。
例如，基因剪切技术可以用于修复遗传病患者的病基因，恢复其正常的功能。
基因剪切技术还可以被用来治疗癌症。
许多肿瘤以及癌细胞都有着对基因维持生物活性的依赖，基因剪切技术可以通过针对癌细胞中的特定基因进行编程，从而有效地抑制肿瘤生长和扩散。
此外，对于一些传染病，例如HIV等病毒，利用基因剪切技术可以设计出新型的治疗方法。
3.2 农业应用基因剪切技术在农业领域的应用主要体现为通过剪切特定的基因，来调控植物的防御机制、促进植物生长和抗逆应变能力。
例如，在小麦的研究中，科学家们通过基因剪切技术使小麦种子中水分含量降低，从而提高小麦的耐旱性和保鲜能力。
基因剪切技术还可以被用来增强作物的抗病能力或者提高其营养含量，为农业生产提供更多有效的手段。
3.3 工业生产应用基因剪切技术在工业生产上也有广泛的应用。
比如，基因剪切技术可以被用来优化酵母、真菌等微生物的代谢途径，增强产生有用生产物的效率。
基因敲除技术的原理与应用
基因敲除技术的原理与应用
基因敲除技术是基因工程领域常用的一种技术手段，它通过干扰特定
目标基因的表达，来研究该基因在生物体中的功能、调控及其对生物现象
的影响。
基因敲除技术的原理与应用十分广泛，对于生物学研究、疾病治
疗和农业改良有着重要的意义。
1.生物学研究：基因敲除技术被广泛用于研究基因在生物体中的功能
以及其对生物现象的影响。
常用的模式生物如小鼠、果蝇、斑马鱼等，通
过基因敲除技术产生基因敲除动物模型，可以帮助科学家研究基因的功能、调控机制和疾病机理。
2.疾病治疗：基因敲除技术可以用于治疗一些与单基因遗传病相关的
疾病。
通过针对致病基因的敲除，可以恢复或改变细胞的功能，从而治疗
疾病。
举例来说，基因敲除技术已经成功用于治疗部分遗传性免疫缺陷病、囊性纤维化、血友病等疾病。
3.肿瘤治疗：在癌症治疗中，基因敲除技术可以用于针对癌细胞中的
致瘤基因进行敲除，从而抑制肿瘤的生长和扩散。
此外，还可以对肿瘤的
信号通路进行调控，达到治疗肿瘤的目的。
4.农业改良：基因敲除技术可以应用于农业领域，通过有针对性地敲
除一些基因来改良植物的性状，提高农作物抗病性、抗旱性和耐盐性。
以
水稻为例，基因敲除技术已经成功应用于提高水稻对稻瘟病、稻瘟病菌和
稻瘟霉素的抗性。
总之，基因敲除技术具有广泛的应用前景。
它可以对生命科学研究、
疾病治疗和农业改良等领域做出重要贡献。
随着技术的不断发展和优化，
基因敲除技术的应用将会更加广泛，为人类的健康和农业产业发展带来更多的福利。
基因敲除方法及其应用
【收稿日期】2008205220【作者简介】贺松(19822),男,硕士在读,从事基因工程菌的构建及其应用的研究,Email:jar m190@;张德纯,通讯作者,Email:zhangdechun46@s ohu .com文章编号:10052376X (2009)022*******【综 述】基因敲除方法及其应用贺松,张德纯(重庆医科大学病原生物学教研室,重庆 400016)【关键词】 基因敲除;基因打靶;同源重组;RNA 干扰【中图分类号】Q781 【文献标识码】A 基因(gene )是核酸分子中储存信息的遗传单位,是指储存有功能的蛋白质多肽链或RNA 序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。
基因敲除(Gene knockout )是指借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能;或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能,或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。
基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。
基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,此后经历了将近20年的推广和应用,直到2007年10月8日,美国科学家CAPECCH I 和OL I V ER S M I TH I ES 、英国科学家EV 2ANS 因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因进行定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖,基因打靶技术才获得诺贝尔奖评审委员会的关注和肯定。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA 干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。
外源基因清除”技术(Gene-Deletor)原理、特点及其潜在应用前景
用转基因产品。许多科学家也在探索解决转基因安 物器官的细胞基因组中全部清除。
全性的技术，已经提出了一系列生物技术手段如转 基因花粉不育技术(Paoletti and Pimentel, 1996)、种子
and Ow, 2004)。“外源基因清除”技术综合应用了两 套系统(Li et al., 2007)，其原理如图 1 所示：创造了一 个 loxP 和 FRT 的融合识别位点 LF (LoxP-FRT)，获 得了一个高效基因清除系统。特异启动子驱动重组 酶 FLP 或者 Cre 在适当的时间和部位表达，重组酶 识别融合识别位点 LF，两个融合识别位点之间的序 列(包括重组酶的基因序列)在特定的时期、从特定植
全性的恐惧和担忧，各国都有管理转基因研究和转 基因产品释放的专门法规。尽管在美国调查显示大 多数人认为转基因作物是安全的，但是，美国对转基
过重组酶识别特定的重组位点将插入该位点间的所
有外源基因删除。Cre/LoxP 和 FLP/FRT 系统己经分 别用于删除转基因植物的筛选标记序列(Srivastava
The Gene-Deletor Technology: Principle and Potential Application in Genetically Engineered Agriculture
Zhao Degang 1* Lv Litang 1 He Aigong 1 Luo Keming 2 Duan Hui 3 Zheng Xuelian 4 Deng Wei 5 Chen Yongqin 6 An Xinmin 7 He Mingyang 8
摘 要 “外源基因清除”技术(Gene-Deletor)是美国康涅狄格大学华裔教授李义领导的研究小组发展起来 的，有望成为解决转基因植物环境安全性和食品安全性问题的有力工具。象计算机“卸载”应用软件一样， “外源基因清除”技术利用器官特异或诱导型启动子、重组酶及融合识别位点构建基因表达元件，能将转基因 植物中的全部外源基因在完成其功能作用后自动地从花粉、种子和果实中彻底清除。最近，美国著名“社会 技术”公司公布了未来 20 年对社会最具影响力、最有前景的技术创新领域一系列 12 个简报，其中第 10 个专 题推介了“外源基因清除”技术。本文综述了“外源基因清除”技术的原理和技术优点，介绍并讨论了李义对 该技术在作物有性繁殖中的应用以及在解决食品安全性问题上的应用方略。 关键词 外源基因清除技术, 转基因植物, 食品安全性, 环境安全性, 植物
农杆菌介导柑橘遗传转化体系的优化.doc
农杆菌介导柑橘遗传转化体系的优化农杆菌介导的柑橘遗传转化效率一直不高,为进一步提高柑橘的遗传转化效率,本研究以金柑、糖橙及柠檬实生苗上胚轴节间茎段为试材,比较系统地研究影响其再生及转化效率的各种因素,完善它了们的遗传转化技术体系。
同时,在优化遗传转化技术体系的基础上,成功将“外源基因清除系统”(Gene-Deletor)以及“果实无核化”基因导入金柑和糖橙橙中,同时将YFP基因导入柠檬中。
主要研究结果如下：1金柑再生及遗传转化技术体系的建立以35d苗龄金柑(完全暗培养)的实生苗上胚轴节间茎段为外植体,水平放置培养于不定芽再生培养基(MS+3mg·L-16-BA)上培养50d左右,不定芽再生率可达到90%；切下不定芽放置于生根培养基(1/2MS+3mg·L-1IBA+1g· L-1AC)上,不定芽生根率可达86%。
以35d苗龄(暗培养25d+光照10d)的金柑实生苗上胚轴节间茎段为遗传转化的外植体,用液体共培养培养基(MS+2mg·L-6-BA+1mg·L-1NAA+1mg·L-1KT+20mg·L-1AS, pH=5.4)重悬农杆菌菌液至OD600=0.3后,侵染30min,转入共培养基中,25℃黑暗条件下首尾相连培养3d,再转入筛选培养基(MS+3mg·L-16-BA+50mg·L-1kan+400mg·L-1cef)进行阳性芽的筛选,可获得较高的GUS阳性率。
应用以上优化的遗传转化体系,成功将‘’Gene-deletor"和“果实无核化”基因导入金柑细胞中,获得23株转基因株系,转化效率可达6.07%。
2糖橙遗传转化技术体系的优化以30d苗龄(暗培养20d+光照10d)的糖橙实生苗上胚轴节间茎段为外植体,在共培养基(MS+3mg·L-16-BA+20mg·L-1AS, pH值5.7)上,19℃C共培养条件下共培养3d后转移到筛选培养基中,最后获得GUS阳性率为29.4%。
基因工程复习提纲
1、有关基因工程 PPT 中出现的概念术语的英文写法需掌握genetic engineering 基因工程open reading frame, ORF 开放读码框exon 外显子intron 内含子recombination 重组replication 复制transcription 转录translation 翻译expression 表达purpose gene 目的基因functional cloning 功能克隆phenotypical cloning 表型克隆differential screening 差异筛选法subtractive hybridization, SH 差减杂交法DDRT-PCR mRNA 差别显示技术representative differentiation analysis, RAD代表性差异分析suppression subtractive hybridization, SSH抑制性差减杂交mapbased gene cloning 图位克隆transposon tagging cloning 转座子标签克隆denaturation 变性anealling 退火extension 延伸polymerase chain reaction PCR 聚合酶链反应anchored PCR 锚定PCR Inverse PCR 反向PCR gene library 基因文库vector 载体restriction endonuclease 限制性内切酶ligase 连接酶intermediate expression vector 中间表达载体chimeric gene 嵌合基因disarmed vector 卸甲载体Co-integrated vector 共整合载体Cis-vector 顺式载体binary vector 双元载体trans vector 反式载体green fluorescent protein,GFP 绿色荧光蛋白Part4purpose gene 目的基因totipotency 全能性vitrification 玻璃化agrobacterium- mediated 农杆菌介导genetic transformation 基因转化leaf disc transformation 叶盘转化法DNA-Direct Introduction DNA 直接导入liposome 脂质体liposome fusion 脂质体融合法liposome injection 脂质体注射法electroporation 电穿孔法gene gun, particle gun, biolistics,biological ballstics, microprojectile 基因枪法germ line transformation 种质转化microinjection 显微注射法direct injection or macroinjection 直接注射法pollen–tube pathway 花粉管通道法Part5transgenic plant 转基因植物total DNA 植物细胞总DNA CTAB (cetyltriethylammonium bromide)十六烷基三乙基溴化铵SDS (Sodiumn-Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠gus β- 葡萄糖苷酸酶基因gfp 绿色荧光蛋白基因antigen 抗原antibody 抗体ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay):酶联免疫吸附法Part6GMOs 转基因生物gene transfer 基因逃逸via gene-deletor technology 外源基因清除male sterility 雄性不育seed sterility 种子不育marker free 无标记2、第一章绪论中关于基因工程发展历史中关于理论发现和技术发明的几个重要事件、全球转基因作物现状概况理论发现：(1)遗传物质的化学本质是DNA (Avery等，1944)(2)DNA双螺旋结构模型和半保留复制机制(Watson and Crick, 1953)(3)遗传密码的破译(Nirenberg等，1964)和“中心法则”(Crick, 1957)技术发明：(1)限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割技术(Smith和Wilcox, 1970)、(2)DNA连接酶的发现(Weiss和Richardson，1966)与DNA片段的连接(Berg和Jackson, 1972)、(3)基因工程载体的发现与应用(Cohen,1973)为基因工程技术提供了技术保障。
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全性的恐惧和担忧，各国都有管理转基因研究和转 基因产品释放的专门法规。尽管在美国调查显示大 多数人认为转基因作物是安全的，但是，美国对转基
过重组酶识别特定的重组位点将插入该位点间的所
有外源基因删除。Cre/LoxP 和 FLP/FRT 系统己经分 别用于删除转基因植物的筛选标记序列(Srivastava
赵德刚 1* 吕立堂 1 贺爱公 1 罗克明 2 Hui Duan 3 郑雪莲 4 邓伟 5 陈永勤 6 安新民 7 贺明阳 8
1 贵州大学生命科学学院贵州省农业生物工程重点实验室, 贵阳, 550025; 2 西南大学生命科学学院, 重庆, 400716; 3 Department of Cell and Structural Biology, University of Illinois, Urbana, Illinois, 61801, USA; 4 西南大学生物技术中心, 重庆, 400716; 5 重庆大学生物工程学院, 重庆, 400044; 6 湖北大学生命科学学院, 武汉, 430062; 7 北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点实验室, 北京, 100083; 8 西北农林科技大学农 业部西北园艺植物种质资源与遗传改良重点开放实验室, 杨凌, 712100 * 通讯作者, degangzhao@
分子植物育种，2008 年，第 6 卷，第 3 期，第 413-418 页 Molecular Plant Breeding, 2008, Vol.6, No.3, 413-418
专题评述 Invited Review
“外源基因清除”技术(Gene-Deletor)原理、特点及其潜在应用前景
用转基因产品。许多科学家也在探索解决转基因安 物器官的细胞基因组中全部清除。
全性的技术，已经提出了一系列生物技术手段如转 基因花粉不育技术(Paoletti and Pimentel, 1996)、种子
Abstract The Washington DC-based, well known research and consulting firm Social Technologies recently released a series of 12 briefs that shed light on the top areas for technology innovation through 2025. The tenth trend on engineered agriculture in the series emphasizes the gene-deletor technology. The gene deletor technology was developed by Professor Yi Li laboratory at the US-based University of Connecticut. The technology can be used to eliminate all transgenes in target organs such as pollens, seeds, fruits, or any organs or entire plants when the functions of transgenes are no longer needed or their presence in the plant may cause concerns, similar to a pieces of “uninstall”software used in computer. The technology offers a powerful tool to make genetically modified crop safer to grow and to consume. The gene-deletor technology has been recognized as a true revolution in the transgenic research and industrial field. This paper describes the principle and advantages of the gene-deletor technology and also discusses applications of the gene-deletor technology to produce non-transgenic organs or plants from transgenic plants. Keywords Gene-deletor, Genetically modified crops, Food safety, Environmental safety, Plants
基金项目：本研究由科技部国际科技合作项目(2007DFA31260)和国家科技支撑计划项目(2007BAD59B06)资助
分子植物育种 414 Molecular Plant Breeding
转基因技术可提高作物产量，改善品质，减少除 育)。而且，关于转基因作物和以转基因作物为原料 从根本上解决转基因植物环境安全性问题，也没有 制造的转基因食品对人体的影响一直争论不休，在世 解决人们对转基因食品安全性的担心。
界一些国家和地区，如欧洲和日本等地，对转基因产
美国康涅狄格大学李义教授领导的研究组 2007
品抵触的人数比例较大，2006 年在欧洲调查的人群 中有 58%的人认为转基因食品“不应该被鼓励”。人们 对转基因植物安全性问题的争论和担忧严重地影响 转基因植物的商业化推广和应用。除非解决了人们对
年 3 月在《Plant Biotechnology Journal》杂志上发表的 “外源基因清除”技术(现称“Gene-Deletor”, 原为“GMGene-Deletor”) (Luo et al., 2007)，为解决转基因植物 的安全性问题提供了一条目前最为有效的途径。
转基因植物和转基因食品的恐惧和担忧问题，否则公 1“外源基因清除”技术的原理
and Ow, 2004)。“外源基因清除”技术综合应用了两 套系统(Li et al., 2007)，其原理如图 1 所示：创造了一 个 loxP 和 FRT 的融合识别位点 LF (LoxP-FRT)，获 得了一个高效基因清除系统。特异启动子驱动重组 酶 FLP 或者 Cre 在适当的时间和部位表达，重组酶 识别融合识别位点 LF，两个融合识别位点之间的序 列(包括重组酶的基因序列)在特定的时期、从特定植
1 Guizhou Key Laboratory of Agro-Bioengineering, College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang, 550025; 2 College of Life Science, Southwest University, Chongqing, 400716; 3 Department of Cell and Structural Biology, University of Illinois, Urbana, Illinois, 61801, USA; 4 Biotechnology Research Center, Southwest University, Chongqing, 400716; 5 College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing, 400044; 6 College of Life Science, Hubei University, Wuhan, 430062; 7 Key Laboratory for Genetics and Breeding of Forest Trees and Ornamental Plants, Ministry of Education, Beijing Forestry University, Beijing, 100083; 8 Key laboratory of Northwest Horticulture Plant Germplasm and Genetic Improvement of Ministry of Agriculture, College of Horticulture, NWSUAF, Yangling, 712100 * Corresponding author, degangzhao@
The Gene-Deletor Technology: Principle and Potential Application in Genetically Engineered Agriculture
Zhao Degang 1* Lv Litang 1 He Aigong 1 Luo Keming 2 Duan Hui 3 Zheng Xuelian 4 Deng Wei 5 Chen Yongqin 6 An Xinmin 7 He Mingyang 8
众对应用新型生物技术的抵触，将会严重阻碍农业生
物工程的 进一 步发 展 (2008, /News.aspx)。
为了解决人们对转基因植物生态安全和食品安
“外源基因清除”技术综合利用了两套位点特异 重组酶的元件，即来源于细菌噬菌体的 Cre/LoxP 系 统和来自于酵母的 FLP/FRT 系统，这两套系统均通
摘 要 “外源基因清除”技术(Gene-Deletor)是美国康涅狄格大学华裔教授李义领导的研究小组发展起来 的，有望成为解决转基因植物环境安全性和食品安全性问题的有力工具。象计算机“卸载”应用软件一样， “外源基因清除”技术利用器官特异或诱导型启动子、重组酶及融合识别位点构建基因表达元件，能将转基因 植物中的全部外源基因在完成其功能作用后自动地从花粉、种子和果实中彻底清除。最近，美国著名“社会 技术”公司公布了未来 20 年对社会最具影响力、最有前景的技术创新领域一系列 12 个简报，其中第 10 个专 题推介了“外源基因清除”技术。本文综述了“外源基因清除”技术的原理和技术优点，介绍并讨论了李义对 该技术在作物有性繁殖中的应用以及在解决食品安全性问题上的应用方略。 关键词 外源基因清除技术, 转基因植物, 食品安全性, 环境安全性, 植物