染色体病快速产前诊断技术的研究进展

染色体病快速产前诊断技术的研究进展发表时间：2016-10-09T15:14:10.213Z 来源：《系统医学》2016年12期作者：程丹丹姚伟红[导读] 本文主要对这些技术在染色体病快速产前诊断中的研究进展做一综述。

大庆医学高等专科学校 163453【摘要】染色体病是由于染色体数目或结构畸变而引起的疾病，目前尚无有效的治疗方法。

产前诊断是防止染色体病患儿出生的有效方法。

为了快速、准确的诊断染色体病，一系列的分子细胞遗传学技术如荧光原位杂交（FISH）、定量荧光聚合酶链式反应（QF-PCR）、多重连接依赖探针扩增（MLPA）、微阵列比较基因组杂交（aCGH）等被广泛应用于产前诊断。

本文主要对这些技术在染色体病快速产前诊断中的研究进展做一综述。

【关键词】染色体病；快速产前诊断; 研究进展【中图分类号】R714.5 【文献标识码】A 【文章编号】2096-0867（2016）12-189-02产前诊断又称宫内诊断，是指在遗传咨询、诊断基础上，对高风险和严重危害性的胚胎或胎儿，在出生前对可识别的遗传性疾病进行检测，最大限度减少遗传病的出现，做出准确诊断[1]。

产前诊断的范畴包括染色体病、单基因病、多基因病以及各种环境致畸因子所致的先天畸形。

其中染色体病是由于染色体异常所引起的一类遗传性疾病，在新生儿中发病率约占0.5%。

传统的产前诊断方法是对羊膜腔穿刺获得羊水细胞或是绒毛抽吸获得的绒毛细胞进行培养，对染色体有丝分裂期的核分裂相进行核型分析，从而准确地诊断各种染色体数目和结构异常。

但是常规的染色体核型分析方法存在细胞培养时间长、易受培养条件限制、技术难度大等局限性。

随着分子细胞遗传学技术的迅速发展，更快速、高效的分子产前诊断技术正在逐渐应用于临床。

本文就目前临床应用最广泛的荧光原位杂交（FISH）、定量荧光PCR 技术（QF-PCR）、多重连接依赖探针扩增技术（MLPA）、微阵列比较基因组杂交（aCGH）等技术的研究进展做一综述。

1 荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）FISH 技术是细胞遗传学、分子生物学及免疫学相结合的基础上发展起来的一种新技术。

1992年Klinger等[1]首次研究报道使用FISH技术对未培养的羊水间期细胞进行了染色体非整倍性异常检测，将产前诊断时间缩短到24~28h。

FISH技术的基本原理是采用特殊荧光标记的DNA序列探针与样本DNA杂交后，在荧光显微镜下观察荧光杂交信号来检测样本的数目和结构异常。

FISH技术与传统的核型分析方法相比，被检测的样本并不局限于羊水细胞和绒毛细胞，还可以是胎儿有核红细胞或单个卵裂球细胞等[2-5]。

检测的样本无需进行细胞培养，间期细胞也可以用于杂交分析，并且具有特异性好，灵敏度高的特点，在获取样本1~2d后即可出结果，比核型分析所需的10~14d时间明显缩短。

大量的研究证明，FISH商品化试剂盒用于间期核检测，敏感性和特异性均较高[6]。

但FISH技术也有一定的局限性，因受特异性探针的限制，只能检测已知的染色体异常，仅仅能提供有限的染色体信息，目前该技术在临床主要用于检测13、18、21、X和Y等最常见的染色体数目异常；由于一种探针往往只能检测出一种异常，对同时存在多种异常染色体需采用多个探针进行检测，将增加检测成本；FISH对相互易位等染色体结构异常无法检出，这是由于断裂点的不可预见性很难制备适宜的探针；FISH还存在一定的假阴性率和假阳性率，嵌合体及母体细胞污染等问题也无有效的解决方法[7]。

因此，FISH技术不可能完全代替常规染色体核型分析，当FISH结果不确定时，还需要与经典的核型分析相结合对染色体病进行产前诊断。

2. 定量荧光聚合酶链式反应（quantitative fluorescent polymerase chain resction，QF-PCR）QF-PCR是将荧光能量传递技术应用于PCR中，利用荧光引物对染色体上特异的短串联重复序列进行扩增，不同的染色体上STR位点的序列因碱基重复数不同导致扩增片段长短不同，经毛细管电泳即可进行判断。

QF-PCR不需要细胞培养，操作相对简便，省时省力，24h即可出结果，消除了95%夫妇等待核型分析结果所造成的焦虑[8]，并且在产前诊断中具有敏感性、准确性高的优点。

通过扩增非多态的Amelogenin基因（AMXY），该位点可在X、Y染色体上扩增出长度不一的特异性片段，可检测胎儿性染色体数目异常（如47，XXY；47，XYY；48，XXXY）[9-10]。

QF-PCR产前诊断的成本较低，可同时检测大批标本，已在很多产前诊断中心常规应用，特别是在欧洲地区。

但是QF-PCR也存在自身局限性，如只能检测多个拷贝的基因位点的有无，而无法检测具体的拷贝数的改变，而且需要找到多个位点进行复合扩增，才能保证检测结果的准确性。

另外，即使检测结果正常也不能排除染色体畸形的风险，如染色体嵌合型和易位型。

因此，QF-PCR仍不能完全替代细胞遗传学诊断技术。

3. 多重连接依赖探针扩增（multiplex ligation-dependent Amplification，MLPA）MLPA是一种基于PCR的非整倍体检测方法，于2002年首次报道。

MLPA的基本原理是将被扩增且定量化的探针加入样本中，利用杂交、连接和PCR扩增，扩增产物经毛细管电泳分离，分析软件对收集到的数据进行分析，可实现在一个反应管里同时检测50种不同基因组DNA或RNA序列的异常拷贝数变化[11]，是一种多重PCR。

MLPA结合了PCR扩增和DNA探针杂交技术，具有以下几方面特点：①高效性，一次反应可以检测50个核苷酸序列的拷贝数变化；②快速性，一次检测可以在24h内完成；③特异性，可以针对单一位点进行点突变检测；④简便性，多采用试剂盒进行检测，操作简便容易掌握。

目前MLPA用于检测非整倍体常用的试剂盒是SALSA P095，在13、18、21、X染色体上各有8个探针，Y染色体有4个探针，通过检测待测样本与对照样本探针各位点对比，根据比值判断被检测样本的染色体数目。

Van Opstal等[12]、Boormans等[13]应用P095试剂盒对收集的羊水样本和绒毛样本进行产前诊断的结果表明，MLPA可以准确的判断非嵌合样本的13、18、21、X和Y染色体的拷贝数，部分嵌合体也能检测出来。

基于MLPA的可靠性，一些产前诊断中心已单纯根据MLPA结论终止妊娠而不用进行核型分析进一步验证。

但是MLPA也存在一定局限性，不能用于单个细胞的检测，只能检测已知的基因缺失或重复，不能检测未知的畸变，也不能检测染色体平衡易位，因而不能对染色体结构异常进行检测。

4 微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，aCGH）aCGH是在FISH基础上发展起来的一种能够检测全基因组染色体拷贝数不平衡改变的一种技术。

aCGH的基本原理是利用基因芯片技术将大量探针分子固定在支持物上与待测样本分子进行杂交，通过计算机分析数据软件对两种信号的荧光强度比率进行分析，确定待测样本全基因组DNA拷贝数变异（copy number variation，CNV）。

aCGH检测不需要进行羊水或绒毛细胞培养，且对冰冻组织、陈旧组织等储存样本也能检测，解决了临床上自然流产组织样本培养失败率高和不能及时检测的问题。

aCGH具有高通量、高分辨率、高准确率、高灵敏度、高自动化及快速的优点。

aCGH可在一张芯片上实现全基因组检测，在染色体微结构畸变、追溯标记染色体来源等方面具有明显的优势，几乎可以检测出除基因突变或染色体平衡易位以外的基因组失衡[14]。

但aCGH也有其局限性，不能检测染色体平衡易位及多倍体，并且检测的费用高，数据分析较难，对数据分析者要求高，因此临床上多采用联合传统的核型分析技术进行诊断。

综上所述，染色体病快速产前诊断新技术各有优势，同时也存在着局限性。

如何选择和应用这些新技术，建立完善的遗传学诊断体系，探索适合我国国情的产前诊断技术方法，是目前需要广大产前诊断工作者亟待解决的问题。

相信随着分子细胞遗传学的不断发展和创新，产前诊断新技术理论知识的不断完善，不久的将来一定会有高分辨率、高特异性、低成本、快速的检测方法，为防止出生缺陷，提高我国人口素质做出巨大贡献。

参考文献[1] Klinger K, Landes G, Shook Dn, et al. Rapid detection of chromosome aneuploidies in uncultured amniocytes by using fluorescence in situ hybridization(FISH) [J]. Am J Med Genet, 1992, 51(1):55-65.[2] Moatter T, Khilji Z, Murad F, et al. Analysis of amniotic fluid specimens for common chromosome disorders using interphase fluorescence in situhybridization[J]. J Pak Med Assoc, 2007, 57(4):189-192.[3] Lau KT, Leung YT, Fung YT, et al. Outcome of 1355 consecutive transabdominal corionic villus samplings in 1351 patients[J]. Chin Med J, 2005, 20(1):1-4.[4] Krabchi K, Gadij M, Samassekou O, et al. Quantification of fetal nucleated cells inmaterna lblood of pregnant women with amale trisomy 21 fetus using molecular cytogenetic techniques[J]. Prenatdiagn, 2006, 26(1):28-34.[5] Chong SS, Gore-Langton RE, Hughes MR, e tal. Single-cell DNA and FISH analysis for application to preimplanta- tion genetic diagnosis[J]. Curr Protoc Hum Genet, 2010, 9:9-10.[6] Shaffer LG, Bui TH. Molecular cytogenetic and rapid aneuploidy detection methods in prenatal diagnosis[J]. Am J Med Genet C Semin Med Genet, 2007, 145C(1):87-98.[7] 刘鸿春, 桂俊豪. 荧光原位杂交技术在非整倍体产前诊断中的应用进展[J]. 中国优生与遗传杂志, 2011, 19(6):5-6.[8] Faas BH, Cirigliano V, Bui TH. Rapid methods for targeted prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies[J]. Semin Fetal Neonatal Med, 2011, 16(2):81-87.[9] Cirigliano V, Voglino G, Canadas MP, et al. Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF- PCR.Assessment on 18,000 consecutive clinical samples[J]. Mol Hum Reprod, 2004, 10(11):839-846.[10] Cirigliano V, Voglino G, Adinolfi M. Non-invasive screening and rapid QF-PCR assay can greatly reduce the need for conventional cytogenetic analyses in prenatal diagnosis[J]. Reprod Biomed Online, 2005, 11(6):671-673.[11] Schouten JP, Mcelgunn C J, Waaijer R, et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification[J]. Nucleic Acids Res, 2002, 30(12):e57.[12] Van Opstal D, Boter M, de Jong D, et al. Rapid aneuploidy detection with multiplex ligation-dependent probe amplification:a prospective study of 4000 amniotic fluid samples[J]. Eur J Hum Genet, 2009, 17(1):112-121.[13] Boormans EM, Birnie E, Oepkes D, et al. Comparison of multiplex ligation-dependent probe amplification and karyotyping in prenatal diagnosis[J]. Obstet Gynecol, 2010, 115(2 Pt 1):297-303.[14] 钱欣, 王建莉. 遗传性疾病产前诊断方法及其进展[J]. 中国产前诊断杂志（电子版）, 2014, 6(3):49-53. 【基金】黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助(项目批准号:12525004), 作者简介：程丹丹；性别：女出生年月：1983年4月文化程度：硕士现有职称：讲师就业单位：大庆医学高等科学校，研究方向：医学遗传学。