K-B纸片扩散法药敏试验
杀菌动力学
9．测量抑菌环孵育后，手持平皿，从背面目测检查每块平板，用卡尺测量每个抑制环直径(包含纸片的直径)，并以mm为单位记录大小。
10．结果判断参照表6-3—1标准，根据抑菌环大小作出判断，分敏感、中介和耐药三级报告结果。
3. 接种方法将试验菌稀释成107CFU／ml细菌浓度，取一环(约2μg)接种到含有一系列抗生素的琼脂平板上。接种前平板必须相当干燥，从低浓度琼脂平板开始，在30分钟内完成接种，每次试验需点种一个不含抗生素M—H平板以及质控菌株(ATCC．25922)作质控对照。
4. 培养接种好的平板，放置室温让接种液被充分吸干后，置(35±2)℃孵箱内16～20小时，读取结果。
2. 培养基制备M．H琼脂 配制时加水量要减少1／10，以备添加稀释好的抗生素溶液。琼脂培养基经121℃灭菌15分钟，于水浴中冷却至45～50℃；在每个直径9cm平皿中，加 M—H培养基25ml，稀释好抗生素溶液2.5ml，充分混合，制备含有抗生素的琼脂平板，密封在塑料袋，4～8℃冰箱保存，可使用一周。
5．接种菌液制备? ①增菌法：选择琼脂平板上形态相同的菌落至少4～5个，用接种环挑其顶部，移种到4～5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中，35℃培养2～6小时，菌液浓度达 到或超过0.5单位麦氏比浊管浓度，用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至与麦氏单位标准比浊管相同[约(1～2)×108CFU／m1]。②细菌直接悬液法： 可直接用过夜培养的菌落在盐水或肉汤中制备接种菌液，浓度调至0.5麦氏单位标准比浊管。
1．纸片扩散法(K—B 法)药敏试验把含有抗菌药物的圆纸片放在均匀地接种了实验细菌的琼脂平板上，抗生素的浓度梯度通过从圆纸片上扩散而形成。试验细菌的生长在圆纸周围一定距 离处被抑制，抑菌圈的大小与细菌的敏感性有直接关系。回归曲线表明MIC的对数与抑菌圈的直径呈直线关系。
纸片扩散法药物敏感试验
纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。
而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。
WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。
但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
试验方法：一、试验材料：(一)培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。
琼脂凝固后，应测一下pH。
琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。
每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。
MH琼脂培养基配方(1L)：Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。
K_B纸片扩散法药敏试验_谭瑶
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实验 抗菌药物敏感性试验 PPT课件
（三）结果
• 2.结果解释：用毫米尺量取抑菌圈直径，参 照标准判读结果。按敏感（S）、中介（I）、 耐药（R）报告。 • 3.质量控制：标准菌株的抑菌圈应落在预期 范围内。如果超出该范围，应视为失控而不 发报告，须及时查找原因，予以纠正。
影响结果的因素
• • • • 培养基 抗菌药物纸片 菌量 操作质量
•
•
药敏纸片的选择
待测菌 金黄色葡萄球菌 ATCC25923 大肠埃希菌 ATCC25922 药物
AMK、 PEN、OXA、 VAN、GEN 、CIP
AMK、FTX、GEN、PIP、 CIP、IPM AMK、FTX、GEN、PIP、 CIP、IPM
铜绿假单胞菌 ATCC27853
（三）结果
• 1.结果判读： 平板置黑色无反光背景上，测量抑菌环的 直径。 抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长 为限。 有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环； 磺胺药在抑菌环内会出现轻微生长，这些 都不作为抑菌环的边缘。
步骤和方法
• （一）原理 • （二）方法 • （三）结果
（一）原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接 种检测菌的琼脂平板上。在纸片周围区 域扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周 围抑菌浓度范围内检测菌的生长被抑制， 形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映 检测菌对测定药物的敏感程度，并与该 药对检测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负 相关关系，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
培养基
• pH：7.2～7.4最适宜，碱性扩大氨基糖 苷类药物的抑菌环，酸性扩大四环素类 药物的抑菌环。 • 琼脂含量：影响抑菌环的大小。 • 厚度：影响抑菌环的大小，以4mm为宜。
抗菌药物纸片
• 纸片含药量：与纸片的重量、吸水性、 直径等有关，影响抑菌环的大小，批量 制备。 • 纸片的保存：须在有干燥剂的容器内低 温(-10℃以下)保存。只拿出少量放4℃ 备日常工作用。装纸片的容器从冰箱取 出后，必须在室内温暖l0分钟以上才可 打开。
实验三：药敏
纸片扩散法（K-B法）
器材与试剂
菌种： 金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色 葡萄球菌临床种的6小时肉汤培养物，调整浓 度至0.5麦氏比浊管（相当于1.5×108CFU/ml)； 或挑新鲜培养的单个菌落，在无菌生理盐水中 研磨，校正其浓度至0.5麦氏比浊管。 培养基：水解酪蛋白培养基（MH琼脂）。 其他：无菌棉签、抗菌纸片、镊子、直尺等。
原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上， 纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解，不断向纸片周围区域 扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌 生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测定 药物的敏感程度。
方法:（4人一组，2人做金葡菌标准种，2人做 临床种，每种菌选4个不同的药物纸片）
(80单位）
金葡菌
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
结果
细菌生长
-- - -- ++
++
青霉素浓度 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 对照--
结果判断:抑制肉眼可见生长的最低药物浓度
为该药对检测菌的MIC
影响因素？临床意义？
思考题： 影响因素？ 1、培养基的质量：双层抑菌圈的出现？ 2、纸片质量 3、接种细菌的菌量 4、孵育的温度和时间 5、操作因素
稀释法
微量稀释法 常量稀释法（试管稀释法）
常量稀释法（试管稀释法）
1、实验目的： 用于测量某种药物对测试菌的最小抑菌浓
度（MIC） 2、实验原理：
将抗菌药物混合于肉汤中作一系列的稀释， 再加入定量的测试菌，经一定时间和温度培养 后，无细菌生长的最低药物浓度即为该药对此 菌的MIC。
K-B纸片法
第二部分
实验方法
实验方法
培养基制备 药敏纸片制备 细菌制备 接种
培养基制备
培养基的种类： 进行细菌药敏试验所用的培养基种类较多。M—H 培养 基琼脂浓度越大、抑菌圈直径越小。有研究证明3种丌同 M—H 培养基进行纸片扩散法，实验结果相同。 浓度1．0 ～ 2．0 、pH 7．4左右 培养基的质量： 4 mm 厚平板，允许±1mm误差，如此控制平板厚度即 可满足试验要求。有研究证明，平板每增厚或减薄1mm， 抑菌圈相应减小或增大0．7mm。
药敏纸片制备
实验常觃抗菌药物选择： 在标准中分成A、B、C 、U四组, A组所列的抗生素 为常觃首选药敏试验药物,B组为临床使用主要抗生素, 尤其在医院感染时使用的抗生素，可在下列情况下使 用：①对A组同类抗生素耐药；②标本来源丌同时， 如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶 唑使用于尿道分离的细菌；③多种微生物感染；④多 部位感染；⑤感染流行的控制；⑤对A组抗生素 过敏、耐受或无反应。
药敏纸片制备
C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或 对A组药物过敏的病人和某些丌常见的细菌 （如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠 球菌）。 U组仅用于尿道中分离的细菌，丌作为尿道 外分离菌的常觃药敏试验。
药敏纸片制备
以大肠杆菌为例 ①纸片制备 ：选择优质滤纸，用打孔器制成直径 6mm圆形滤纸片。经120℃2h灭菌后备用 ②药物稀释 每张以吸入20μL药液为标准，如纸片薄，药物原液 需作调整。根据纸片内各种抗菌药物的丌同浓度配制 药物原液。 药液浓度见下表。 ③课埻的实验中仅使用了青霉素 链霉素 氯霉素
结果判定
第四部分
实验优缺点
K—B纸片法优点
药敏试 验具有重复性较好 、操作简便 、试验成本相 对较低 、结果直观 、容易判读、便于基层开展的优 点。
K-B 纸片扩散法测定抗生素敏感试验
平板霉素类似物生物活性评价平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。
抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。
最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。
通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。
纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：1.原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
2.仪器及试剂仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台试剂：样品溶液、培养基3.菌液的配置从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。
4.接种平板在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。
吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝固。
5.粘贴药敏纸片用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。
抗菌药物敏感性试验药敏试验
稀释法
定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌
浓度（MIC） 将MIC与机体血清或体液中可获得药物浓度
相比较来确定恰当的临床疗效
MIC的对数与抑菌环直径关系 ——近似线性负相关
CLSI药物选择原则
A组 常规和首选药物，其结果应常规报告 B组 首选试验选择性报告。包含一些临床
报告方式
常规报告 敏感
菌株能被使用推荐剂量在感染部位达 到的抗菌药物浓度所抑制
中介
被测菌株对该药物的MIC接近于血液、组 织中通常可达到的浓度而治疗反应率可能 低于敏感株。意味着可通过提高剂量或在 药物被生理浓集的部位发挥临床效力。
耐药
被测菌不能被该抗菌药物的常用剂量在组 织或血液内达到的浓度所抑制
磺胺异恶唑
所有菌属
所有磺胺类
萘啶酸（敏感） 肠杆菌科
头孢噻吩/头孢 肠杆菌科 唑啉（敏感）
所有喹诺酮类敏感 所有头孢菌素敏感
万古霉素 氨苄西林
革兰阳性杆菌 肠球菌属
替考拉宁 青霉素
B组药物
细菌对A组同类药物耐药，可选择性报告 报告指征
特定的标本来源 多种细菌感染 多部位感染 对A组药过敏、耐受或无效 以流行病学调查为目的向感染控制部门报告
生长法
挑选琼脂平板上3~5个形态特征一致的 菌落，用接种环接触每个菌落顶部
转移至4~5mL 适宜的液体培养基中 （如胰酶消化大豆胨肉汤）
置35℃孵育2-6 h 用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至
0.5号麦氏管
直接调制菌悬液法 生长法的简便替代法
从孵育16-24h 的非选择性琼脂培养基 上用接种环挑取单个新鲜菌落，悬浮 于生理盐水或肉汤中震荡混匀
K-B纸片琼脂扩散法检测细菌药物敏感试验的影响因素分析
２ ． 治疗 阴道炎 ．５ ２
陈 晓飞等 ” 取新 鲜车 前草 煎 汁 ，对 ４ 例 阴道 炎 患者 进行 浸 泡治 ８
疗 ，结果 ２例外阴湿疹患者 全部痊愈 ，１ ９ ３ 例非特异性 阴道炎及６ 老年 例 性 阴道炎 患者 ，治疗后症状 明显 减轻。 ２． ．６治疗 急性乳腺炎 ２ 急性乳腺 炎为初产妇 的常见 病 ，分 为未 化脓 型和化脓 型两种 。陈 福 仁等 将 捣烂 的车 前草 捏 成鼻 孔 大小 的 圆锥 状 ，塞 入患 者 鼻 腔 ， １ｂ次 ，最多经 ３ ５／ ． 次治疗 后 ，３ 例未化 脓型者均可痊 愈 ，但该法对 化 １ 脓性 乳腺炎 无 效。王 寿 昌等 在 ｌ 年 期 间对 ２ 例 患者 使用拍 打 尺 Ｏ １
泽穴加外敷车前 草治疗急性乳腺炎 ，效果亦较好 。
２． ． ７其他 研究 发现 ，车前草 还可用 来治疗 运动性 血 红蛋 白尿 】 ２ 、角 膜翳 、痢疾 ” 以及小 儿迁 延性肺 炎、尿血 、 胃肠 性感 冒等儿科
病症 ，均取得 了满意 的结果。 ３小 结
【２ １】陈剑 屏 ， 霞 ． 前草 汤 治疗 慢性 活 动肝 炎 ２２ ［ ． 海 中医 袁启 车 ３ 例 Ｊ上 】
药杂 志 ， ０ ，１ ８１． ２ ２１： －９ ０ １
［３ １】青俐 ． 车前草穴位 贴敷 治疗产后尿潴 留叨． 中医２０， （ ： － ． 四川 ０１９６２ ２ １ ）２ ２
［４ １］金顺 英 ， 家 ， 世英 ， ． 前草 治疗 单 纯血 尿 ［ ． 张兴 张 等车 Ｊ 长春 中医 学 ］
院学 报，９ ７ｌ （） ６ １９ ， ６： ． ３ １
车 前草资源 丰富 ，用途 广泛 ，且毒副作用 小 ，随着现代技 术 的不 断发展 以及各 学科 间的不断完善 ，车前草会 给人类 带来更大 的经济和
抗菌药物敏感试验实验
无菌试管、刻稀释法
K-B法操作方法
操作注意事项：
菌液应在15分钟内接种完毕 接种后，平板放置时间不要超过5min 注意纸片距离
肉汤稀释法操作方法
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M-H肉汤(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
抗生素(ml) 菌液(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2弃 －
去
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
35℃孵育16~18h，观察结果
实验内容
第二次 1.观察K-B法的结果 2.观察肉汤稀释法的结果
K-B法结果解释
测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验结果判断
大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验结果判断
实验目的 1.掌握纸片扩散法（K-B法）和肉汤稀释法
的原理、操作方法、结果的判读及其临床 意义。 2.掌握纸片扩散法和肉汤稀释法的质量控制。
实验内容 纸片琼脂扩散法（K-B法） 肉汤稀释法
实验器材
1. 菌种： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 2. 培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、MH肉汤 3. 抗菌纸片：青霉素（PEN）、庆大霉素（GEN）、
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万方数据
万方数据
K-B纸片扩散法药敏试验
作者：谭瑶， 赵清
作者单位：第三军医大学军事预防医学院环境卫生教研室,重庆,400038
刊名：
检验医学与临床
英文刊名：LABORATORY MEDICINE AND CLINIC
年，卷(期)：2010,07(20)
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本文链接：/Periodical_jyyxylc201020070.aspx。