MLPA多重连接探针扩增试剂盒
多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在自然流产样本检测中的应用
讨
论
孕 早 期 胚 胎 染 色 体 异 常 是 自然 流 产 的 重 要 原
因 。有 研 究 表 明 ， 自然 流 产 中 胚 胎 染 色 体 异 常 占
５ （ ） 左 右ｌ ＾ ］ 。 自 然 流 产 胚 胎 的 细 胞 遗 传 学 研 究 发 现， 由于 染 色 体 数 目异 常 所 致 的 胚 胎 发 育 不 良而 造 成 的妊 娠 中断 ， 是 自然 流 产 最 常 见 的 原 因 之 一 ［ ４ 。 受 精 卵 细 胞 的 正 常 分 裂 是 胚 胎 发 育 过 程 中 的 关 键 环
养， 少量标 本 即可进行 检测 ， 针 对 易 发 生 非 整 倍 性 改 变 的 染 色 体 上 的几 个 热 点 基 因 设 计 特 异 性 探 针 ， 根
据 特定 基 因拷 贝数 的改 变 ， 即可确 定 染 色 体数 目的
异常。
ＭＬ Ｐ Ａ 具有 高 度特 异性 ， 如 果靶 序 列 与探 针序
一
该染 色体增 多或 减 少 一条 ， 亦 即导 致 三体 性 或 单 体 性 。２ １ ＿ 三体在 活产 儿 中最常见 ， １ ３ － 三体 、 １ ８三体 也 偶尔 可见 ， 而其他 常染 色体 的三体 性 大多导 致流 产 ，
本 实 验 所 用 的 ＭＩ Ｐ Ａ Ｐ ２ ９ （ ） 试 剂 盒 主 要 用 于 检 测
８ ７ ． ５ ％。细胞 染 色 体 数 目异 常 在 群 体 中 发 生 率 约 ３ ， 在 前 ３个 月 的 自然 流 产 胚 胎 中发 生 率 可 高 达
５ （ ） ～６ （ ） ， 这 种 染 色 体 数 目异 常 的 改 变 主 要 有 常
知流产 密切 相关 的染 色 体 畸 变 ， 本 实 验 选 择 了组 合
多重连接探针扩增技术诊断鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症五例重点
测。纳入研究患儿临床表现：持续呕吐、口唇发紫，
昏迷，血氨升高等。所有检测均经过上海交通大学
医学院附属新华医院伦理委员会同意（批准文号：
ＸＨＥＣ．Ｄ－２０１２－０３５），并获得被检测者父母的知情 同意。 二、方法
果
ｐ。ｍｏｌ／Ｌ。串联质谱检测血瓜氨酸水平６例
１．实验室检测：（１）串联质谱检测方法：采集患
失。例２和例５由于患儿死亡，采母静脉血进行基
只需２０ ｎｇ基因组ＤＮＡ，最大特点仅扩增结合完好 的探针且一次反应可以检测４５个靶序列拷贝数的
因检测，对患儿进行推测，患儿母亲分别携带外显子
２～６和外显子１～４杂合重复。
表２ ＭＬＰＡ检测不同Ｊ＇ｌ－显子５例ＯＴＣＤ患儿或母亲 异常结果（检测者结果与正常值比值）
ｑｕｏｔｉｅｎｔｓ，ＤＱ）计算，ＤＱ＝０表示纯合缺失；０．４＜ＤＱ
＜０．６５表示杂合缺失；０．８＜ＤＱ＜１．２为正常；１．３ ＜ＤＱ＜１．６５为杂合重复；１．７５＜ＤＱ＜２．１５为纯合 重复。 结 一、实验室检查结果 ７例患儿血氨均＞２００ ｉｘｍｏｌ／Ｌ，其中１例最高 达２
５００
６岁时死亡，２例死亡患儿采母亲静脉血进行基因检
ｐｒｏｇｒａｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｇｒａｍ（２０１ ２ＢＡｌ０９８０４）
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０５７８－１３１０．２０１６．０６．０１０
作者单位：２０００９２上海交通大学医学院附属新华医院上海市儿科医学研究所内分泌／遗传科 通信作者：韩连书，Ｅｍａｉｌ：ｘｈｈａｎｌｓ＠１６３．ｃｏｎ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭＬＰＡ）进行检测。本研究对Ｓａｎｇｅｒ测
MLPA在常染色体显性遗传多囊肾病基因诊断中的应用
MLPA在常染色体显性遗传多囊肾病基因诊断中的应用于国鹏;齐隽;龙飞;黄驿晨;钱小强;陶炯;陈建华【摘要】目的探讨多重连接探针扩增技术(MLPA)在常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)基因诊断中的应用.方法采用MLPA对20例ADPKD患者的PKD1基因和PKD2基因进行检测.MLPA检测结果显示单-外显子扩增或疑似扩增者采用RT-PCR检测验证；MLPA检测结果显示单一外显子缺失或疑似缺失者采用PCR检测验证,存在扩增产物者进行测序验证.结果 MLPA检测显示:1例患者单一外显子缺失(PKD1 Exon40),5例单一外显子疑似缺失(PKD1 Exon1、PKD1 Exon25、PKD2 Exon8、PKD2 Exon8、PKD1 Exon25),3例单一外显子疑似扩增(PKD1 Exon6、PKD1Exon7、PKD1 Exon7).经RT-PCR检测验证,1例患者单一外显子扩增(PKD1 Exon6)；经PCR检测与测序验证,1例患者单一外显子错义突变(PKD1 Exon40),1例单一外显子缺失(PKD2 Exon8).结论 MLPA为ADPKD的基因诊断提供了一种新的方法.%Objective To investigate the application of multiplex ligation-dependent probe amplification ( MLPA) in the gene diagnosis of autosomal dominant poiycystic kidney disease (ADPKD). Methods MLPA was employed to detect the PKD1 gene and PKD2 gene in 20 patients with ADPKD. Verification with RT-PCR was performed for those with single exon duplication or suspected duplication detected by MLPA. Those with single exon deletion or suspected deletion detected by MLPA were verified with PCR, and sequencing analysis was conducted in those with amplification products. Results One patient with single exon deletion (PKD1 Exon40), 5 patients with single exon suspected deletion ( PKD1 Exonl, PKD1 Exon25, PKD2 ExonS, PKD2 ExonS and PKD1 Exon25) and 3 patients with singleexon suspected duplication ( PKD1 Exon6, PKD1 Exon7 and PKD1 Exon7) were detected by MLPA. One patient with single exon duplication (PKD1 Exon6) was verified by RT-PCR, and one patient with single exon missense mutation (PKD1 Exon40) and one patient with single exon deletion (PKD2 Exon8) were verified by PCR and sequencing analysis. Conclusion MLPA may serve as a new method for gene diagnosis of ADPKD.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(031)007【总页数】5页(P957-961)【关键词】常染色体显性遗传多囊肾病；基因突变；多重连接探针扩增技术【作者】于国鹏;齐隽;龙飞;黄驿晨;钱小强;陶炯;陈建华【作者单位】上海交通大学医学院附属新华医院泌尿外科，上海200092;上海交通大学医学院附属新华医院泌尿外科，上海200092;上海市儿科医学研究所细胞遗传室，上海200092;上海交通大学医学院附属新华医院泌尿外科，上海200092;上海交通大学医学院附属新华医院泌尿外科，上海200092;上海市儿科医学研究所细胞遗传室，上海200092;上海交通大学医学院附属新华医院泌尿外科，上海200092【正文语种】中文【中图分类】R692常染色体显性遗传多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是常见的先天性遗传性疾病，发病率约1/1 000～1/400，多发生于成人，60岁时50%的患者可发展为终末期肾病，约占晚期肾病的10%［1］。
多重连接依赖式探针扩增（MLPA）技术
多重连接依赖式探针扩增（MLPA）技术多重连接探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)是MRC-Holland在2002年开发的⼀种分⼦技术。
它是⼀种灵敏的技术，可以快速有效地定量核酸序列。
它在世界各地的许多实验室进⾏，可⽤于检测基因的拷贝数变化(如缺失或复制)，识别DNA的甲基化状态，检测单核苷酸多态性(SNPs)和点突变，量化mRNA。
因此，它被应⽤于许多研究和诊断领域，如细胞遗传学、癌症研究、⼈类遗传学等。
⼯作原理MLPA基本步骤如下，具体见图解1．变性2．杂交3．连接4．扩增（通过PCR）5．⽚段分离和数据分析详细解释变性和杂交变性涉及退⽕DNA链的分离，使双链DNA变成单链。
杂交即将DNA样本与特定探针杂交。
由于它是⼀种多路复⽤技术，可以同时使⽤多达60个探头分析每个样本，从⽽针对不同的位点。
这些探针具有引物序列，在扩增过程中与PCR -引物结合。
所有不同的探针都有相同的引物结合序列，此外，探针还具有与⽬标位点互补的杂交序列，使探针能够与DNA结合。
两种探针将在DNA链的相邻位点杂交。
这对探针中的⼀个包含⼀个填充序列，每个⽬标位点的填充序列长度不同。
填充序列的长度在不同的探针之间变化，允许多路复⽤。
所以每个放⼤产物都有⼀个唯⼀的长度。
连接连接步骤将两个探针结合在⼀起，在这个步骤中，使⽤⼀种叫DNA连接酶的特定的酶，它与已经在⽬标位点DNA链相邻位点杂交的探针结合。
MLPA中使⽤的连接酶是ligase-65，这是⼀种依赖于NAD的连接酶，在其他应⽤中也很有⽤。
如果我们的⽬标是连接两个探针，为什么它们⼀开始是分开的分⼦? 两种探针都含有PCR-引物的结合位点。
这意味着，如果我们将探针作为单个分⼦使⽤，即使没有DNA靶点，我们也可以得到扩增产物，从⽽得到⾮特异性扩增。
连接酶是⾮常特异性的，如果探针与⽬标位点不匹配，连接酶将⽆法与探针结合，也不会发⽣扩增。
MLPA多重连接探针扩增试剂盒概论
企业宗旨
公司以“自主创新、服务社会”宗旨，探索高科技产业发展之路，旨在不断超越自我，建立现代企业管 理制度，以科技创新创造社会价值，以诚挚服务提高人民健康水平，努力创建世界一流生物高科技企业。 发展战略：自主创新，合作共赢 企业宗旨：以人为本，服务社会
syndrome, DiGeorge syndrome, Cri du Chat, Pelizaeus-Merzbacher, CMT1, HNPP等；
● 亚端粒区域的拷贝数变化；
● 染色体非整倍体（包括羊水细胞样品）；
● 肿瘤诊断：如 ALL, CLL, oligodendrogliomas, melanomas, neuroblastomas的DNA拷贝数变化；
6
神经遗传学与智障
15
遗传性肿瘤与肿瘤表征
28
药物基因组学
44
甲基化检测
46
mRNA Analysis (RT-MLPA)
53
其它产品
55
附录1 样品处理
65
附录2 核酸提取系统
68
附录3 唾液收集器介绍
71
MLPA简介
®
MLPA 简介
®
MLPA 高效灵敏的基因组和甲基化分析方法
AGXT-GRHPR, LARGE, UBE3A, TPO-PAX8-FOXE1-TSHR, FCGR基因簇分析, BRCA2 确认试剂。
● 肿瘤：P335 IKZF1-ALL, P202 IKZF1, P370 BRAF失活-IDH 突变。
mlpa的原理介绍及结果解读
MLPA（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification）是一种用于检测基因突变和基因组重排的技术，它结合了DNA探针杂交和多重连接依赖探针扩增的原理。
MLPA技术是一种快速、精确且高通量的分子生物学方法，可以用于检测某些常见的遗传疾病、肿瘤基因的突变以及复杂疾病的基因组变异。
在本文中，我们将深入介绍MLPA的原理和应用，并对其结果进行解读。
一、原理介绍1. DNA探针杂交MLPA技术首先涉及到DNA探针的杂交。
DNA探针是一小段特异性的DNA序列，可以与目标DNA序列结合。
在MLPA中，DNA探针通常包括两部分：一个用于与目标DNA序列结合的特异性序列，以及一个用于扩增和检测的通用序列。
2. 多重连接依赖探针扩增在DNA探针杂交之后，MLPA技术利用DNA连接酶将相邻的两个DNA探针连接在一起，形成一个新的DNA分子。
随后，利用PCR扩增这些连接好的DNA分子，通过引入荧光标记或者其他检测标记，可以对扩增产物进行定量检测。
3. 结果解读通过MLPA技术得到的结果，可以通过测序仪或者其他相关仪器进行检测和定量分析。
根据扩增产品的数量和荧光信号的强度，可以对目标DNA序列的存在与否进行判断，从而检测出基因突变或基因组重排等变异情况。
二、应用和意义MLPA技术在临床诊断、基因组学研究和生物医学领域有着广泛的应用。
它可以用于检测单基因遗传病的突变，例如囊性纤维化等疾病；也可以用于检测肿瘤基因的突变，用于癌症的诊断和预后判断；MLPA 技术还可用于复杂性疾病的基因组变异研究，如精神病学和自闭症等方面。
三、结论通过MLPA技术，我们可以快速、准确地检测出目标DNA序列的存在与否，进而诊断疾病、研究基因突变和基因组重排。
它的高通量和高灵敏度，使得MLPA技术在基因检测领域具有重要的应用前景。
未来，随着生物技术的发展和MLPA技术的不断完善，相信它会在医学和生物学领域发挥更大的作用。
多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用
“Stuffer” sequence
SphI BsmI
EcoRV XbaI
PCR primer sequence
Hybridising sequence (clone: white plaques)
EcoRV
• 通过克隆获得单链 DNA。 • 将两个短的寡核苷酸序列与单链DNA退火， 从而获得带BsmI and EcoRV位点的双链 DNA。
300
350
400
450
450
9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000
0 20000 17500 15000 12500 10000
7500 5000 2500
0
TE, 98 oC.
100
150
200
250 S iz e ( n t )
300
350
400
多重连接探针扩增技术 及其应用
深圳市天大生物医疗器械 有限公司
苏海静 副总经理
主要内容
MLPA技术简介 MLPA技术工作流程 MLPA技术特点与主要应用领域 数据分析(Coffalyser的使用)
MLPA技术简介
MLPA:多重连接探针扩增技术
• 主要应用领域： 多重检测人类基因组序列中微小的拷贝数变异
X = 引物二聚体
每个MLPA 探针混合液都包括质控片段
90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000
0
P 2 7 5 n e w D Q X 2 0 n g m a le .C 0 4 _ 0 8
2x DNA Denaturation control
MLPA原理
三.探针特异化连接
连接后探针长度在130nt-480nt之间，相邻两探针相差6-9nt。
四.连接探针的扩增
MLPA技术的特色是：1.仅扩增连接完好的探针，而不是扩增样本
靶序列。 2.在一个反应体系中，所有连接探针的PCR
扩增用的是同一对引物。
MLPA目前的应用领域： 1.检测小的重排 2.检测大范围的染色体重排 3.检测亚端粒区的拷贝数改变。 4.检测染色体非整倍体改变。 5.肿瘤诊断 6.甲基化定量检测 7.mRNA分析细胞凋亡和炎症反应。
MLPA实验流程图
样本DNA变性
探针与检测分析
一.样本DNA变性 1.提取样本DNA。
MLPA技术原理
MLPA 多重连接依赖探针扩增技术 （multiplex ligation-dependent probe amplification） MLPA技术最早由荷兰学者Dr.Schouten JP于2002年提出, 是近几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分 析的新技术。MLPA可以快速同时鉴定几十个基因的缺失和插入， 可用于血液，肿瘤样本的DNA，mRNA的表达谱分析。而且，MLPA 方法可用于甲基化分析。该技术具有高效、特异性，可在同一反 应管内检测多达50个核苷酸序列的拷贝数变化。
2.DNA溶解后，冷却至室温，进行纯度及浓度检测。
二.探针与靶序列杂交
针对每个待测基因目标序列设计 了一对探针，这一对探针包括一 条经化学合成的短探针（5‘ 端 探针）和一条经M13 噬菌体衍生 法制备而来的长探针（3’ 端探 针）组成。
短探针长约50-60bp，长探针长约 60-450bp。
填充序列：长度特异填充片段， 由于填充片段长短不一而可以区 分不同的探针。
MLPA多重连接探针扩增试剂盒概论
®
®
3. MLPA 主要用于识别基因组的缺失或者插入，不大适合检测未知突变。尽管如此，MLPA 还是能够
检测已知（点）突变，如可以把突变位点设计在探针的连接位点，一旦发生突变，就是导致峰面积的下降。
®
4. MLPA 对于样品中的污染物（如少量残留的苯酚等PCR抑制剂）较普通PCR敏感。但是，此类污染很
2
®
从扩增产物的相对峰面积的降低看出来（图2）。MLPA 反应的探针浓度和杂交时间确保了与靶序列的完
®
全杂交。在一个典型的MLPA 反应中，探针的拷贝数为500,000,000个，而一个含有60ng人类基因组的样
品中仅有20,000拷贝的靶序列。延长杂交时间或者增加更多
的探针并不影响检测的结果，因此反应十分稳定。
®
只含有单个引物识别的序列，无法被扩增。因此，在MLPA 中并不需要除去未结合的探针。
尽管使用同一对引物，总有某些序列的扩增效率可能低1-2%，最终产生较低的峰面积。因此，一次
®
MLPA 扩增谱并不足以确定拷贝数变化，必须与参考样品对照后才能确定。通过与参考样品对照，扩增产
物的相对峰面积就能反映出探针靶序列的相对拷贝数。因此，病人样品中发生外显子的缺失，就很容易地
容易识别，因为此时那些峰面积较小的扩增产物（如长探针）会出现峰高降低，从福尔马林固定石蜡
包买的组织样品提取的DNA都能得到很好的检测。
®
®
5. 开发SALSA MLPA 试剂盒过程复杂，昂贵而且耗时：因为每一条探针都需要从M13噬菌体克隆出发
进行设计和制备，而且需要纯化和酶切，后者需要使用昂贵的限制性内切酶。然而，目前 M R C - H o l l a n d
厦 门 致 善 生 物 科 技 有 限 公 司 成 立 于2 0 1 0年2月 ， 位 于 厦 门 火 炬 （ 翔 安 ） 产 业 区 内 。 公 司 具 有 雄 厚 的 技 术 力量和丰富管理经营经验的专业人员，一流的科研开发团队为公司技术的持续创新提供了源源不断的动力。 目 前 公 司 建 有1 0 0 0多 平 方 米 的 标 准 洁 净 厂 房 ， 拥 有 完 善 的 生 产 技 术 和 仪 器 设 备 ， 并 建 立 了 高 标 准 规 范 化 的 体 外诊断试剂质量管理体系，为产品的质量提供坚实的保证。
【专题】脊髓型肌萎缩(SMA)检测方法-MLPA
【专题】脊髓型肌萎缩（SMA）检测⽅法-MLPA前⾯两期介绍了SMA疾病和基因，这⼀期我们来谈谈SMA的检测⽅法-MLPA。
MLPA原理多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)于2002年由Schouten等⾸先报道，是近⼏年发展起来的⼀种针对待检DNA序列进⾏定性和半定量分析的新技术。
该技术⾼效、特异，在⼀次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，⽬前已经应⽤于多个领域、多种疾病的研究。
MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进⾏杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过⽑细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进⾏分析最后得出结论。
每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸⽚段，⼀个由化学合成，⼀个由M13噬菌体衍⽣法制备;每个探针都包括⼀段引物序列和⼀段特异性序列。
在MLPA反应中，两个寡核苷酸⽚段都与靶序列进⾏杂交，之后使⽤连接酶连接两部分探针。
连接反应⾼度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成⼀条完整的核酸单链;反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有⼀个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应⽆法进⾏。
连接反应完成后，⽤⼀对通⽤引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯⼀的，范围在130~480bp。
最后，通过⽑细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。
只有当连接反应完成，才能进⾏随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发⽣点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。
检测SMA最常⽤的MLPA试剂盒共有两款，P060和P021。
MLPA-P060P060含有21个MLPA探针，其扩增产物在154和342nt之间，包括17个参考探针和4个检测探针，分别⽤于SMN1和SMN2的检测。
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3. MLPA 主要用于识别基因组的缺失或者插入，不大适合检测未知突变。尽管如此，MLPA 还是能够
检测已知（点）突变，如可以把突变位点设计在探针的连接位点，一旦发生突变，就是导致峰面积的下降。
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4. MLPA 对于样品中的污染物（如少量残留的苯酚等PCR抑制剂）较普通PCR敏感。但是，此类污染很
MLPA简介
MLPA®的工作原理
MLPA®采用多重PCR的方式进行检测核酸样品，可用一对引物同时扩增多达45个特异的核酸列。扩
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增产物可用测序仪检测。按照MLPA 的设计，每个扩增产物都有独一无二的长度，并按照6到9个核苷的梯
度逐步增加，总长度在120~500碱基之间。这一范围特别适合测序仪的有效分离和低背景检测。
AGXT-GRHPR, LARGE, UBE3A, TPO-PAX8-FOXE1-TSHR, FCGR基因簇分析, BRCA2 确认试剂。
● 肿瘤：P335 IKZF1-ALL, P202 IKZF1, P370 BRAF失活-IDH 突变。
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MLPA 的特点
● 检测一个样品中50个基因序列的拷贝 数变化，基于PCR反应。
厦 门 致 善 生 物 科 技 有 限 公 司 成 立 于2 0 1 0年2月 ， 位 于 厦 门 火 炬 （ 翔 安 ） 产 业 区 内 。 公 司 具 有 雄 厚 的 技 术 力量和丰富管理经营经验的专业人员，一流的科研开发团队为公司技术的持续创新提供了源源不断的动力。 目 前 公 司 建 有1 0 0 0多 平 方 米 的 标 准 洁 净 厂 房 ， 拥 有 完 善 的 生 产 技 术 和 仪 器 设 备 ， 并 建 立 了 高 标 准 规 范 化 的 体 外诊断试剂质量管理体系，为产品的质量提供坚实的保证。
95°C 温浴1分钟，然后于60°C杂交16小时； 3. 连接：加入连接酶混合液，于54°C温浴15分钟。再
于98°C加热5分钟使连接酶失活； 4. 加入引物，dNTPs和聚合酶，开始PCR扩增； 5. 毛细管电泳：将片段长度和峰面积输出到软件或
者表单上，分析结果。
R
MLPA 的优点
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1. MLPA 技术可用于多种检测体系中，不同体系之间
● 甲基化定量检测：涉及的疾病包括 Prader-Willi/Angelman, Beckwith Wiedemann, MGMT, MLH1,
Fragile X 以及抑癌基因的失活。
1
● mRNA分析：涉及细胞凋亡和炎症反应。
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目前MRC-Holland供应的SALSA MLPA 试剂盒已多达300多个品种，而且通过与全球科学家的合
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呢？对常规的多重PCR而言，这几乎是不可能的任务。MLPA 的窍门在于扩增的对象并非样DNA而是加
®
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入样品中的MLPA 探针。MLPA 探针包括一对寡核苷酸，后者含有引物的结合序列。只有当这两个探针与
靶序列杂交并连接，才能被PCR指数扩增。因此，探针连接产物的数目就取决于样品中靶序列的数目。例 如，如果定量检测50个序列，我们就向样品中加入50对不同的MLPA®探针。每一对都与待测的靶序列互
可靠和有效的方法，自2002年首次报道以来，该技术已在全球的900多家实验室得以应用，使用该技术
发表的论文已近千篇。
M L P A® 的 应 用 领 域
●小范围基因重组的检测：已检测的基因包括：BRCA1, BRCA2, MSH2, MLH1, DMD, APC, SMA,
NF1, NF2, VHL, TSC1/2, MECP2, NSD1, LDLR, FBN1, CFTR, DPYD,COL5A1, CACNA1A,PKHD1,
®
公司已经能够提供250多个MLPA 试剂盒，而且可以应客户要求设计新的探针组合。出于研究目的，
用户可以自行设计合成探针。有关指南和PCR引物信息见。
®
®
6. 与FISH相比，MLPA 不能对单个细胞进行分析。MLPA 的分析结果来自混合细胞中的基因组DNA，因
此 反 映 的 是 每 个 细 胞 的 平 均 拷 贝 数 。 对于肿瘤分析而言，当肿瘤细胞的含量低 于 5 0 %时 ， 某 些 基 因 变
BRIP1, SLC26A4, LMN1B, PRSS1, FRMD7, TPMT, FLCN, DNAI1, EP300, DNAH5, UBE3A, PCCA,
PCDH15 等；
● 大范围基因重组的检测：已检测的疾病类型包括：Williams syndrome, Prader-Willi/ Angelman
厦门致善生物科技有限公司
厦门火炬高新(翔安)产业区翔星路88号 台湾科技企业育成中心E401室 电话：（86）400-661-8810 （ 免费） 0592-7615088 传真：0592-7615089 邮编：361105 网址：
5761720
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从扩增产物的相对峰面积的降低看出来（图2）。MLPA 反应的探针浓度和杂交时间确保了与靶序列的完
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全杂交。在一个典型的MLPA 反应中，探针的拷贝数为500,000,000个，而一个含有60ng人类基因组的样
品中仅有20,000拷贝的靶序列。延长杂交时间或者增加更多
的探针并不影响检测的结果，因此反应十分稳定。
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多重连接依赖探针扩增（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA ）能够
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在一个简单的反应内检测多达50个核酸序列的拷贝数变化，因此能够检测大量基因的缺失和重复， MLPA
®
还可用于血液和肿瘤组织样品的DNA和mRNA谱的检测，并可分析甲基化。迄今， MLPA 已经公认为一种
补。 如前所述，每对MLPA®探针是紧挨着杂交的，并且每个探针都含有引物识别序列。杂交后，两个探
针被一个特异的连接酶催化连接成一条长的探针序列。需要指出的，此处的连接反应十分特异，即使存在
单个碱基的差异也能区别出来。
由于连接后的长片段里包含引物识别序列，就可以在PCR反应中被指数扩增。那些没有连接的探针，
对于普通的多重PCR而言，每一个片段都需要一对引物。大量引物的共存产生一系列的问题。首先，
由于不同引物之间的效率存在差异，难以对各个靶序列进行准确定量。其次，实验条件的微小差
异常常就会导致结果的巨大差别。
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MLPA 的最大好处就在于所有的片段都由一对引物扩增。如何实现用一对引物扩增50个不同的靶序列
企业资质
公司作为分子诊断教育部工程研究中心的产业化基地，已获得国家食品药品监督管理局颁发的《医疗器 械生产企业许可证》及《医疗器械经营企业许可证》，并通过了国家食品药品监督管理局体外诊断试剂生产 质量管理体系考核，具备体外诊断试剂产业化能力。
目录
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MLPA 简介
1
产前诊断与新生儿诊断
唯一的差异就是探针；
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2. MLPA 属于多重检测：一个反应可以提供多达50个
靶序列的信息。对于绝大多数应用而言，已经可
以满足医生的需求；
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3. MLPA 相对经济：每一个MLPA 试剂盒可以进行100
次检测，试剂盒提供了所有试剂（探针混合液、
缓冲溶液、连接酶、聚合酶、dNTPs和标记的PCR引物）；
M L PA多重连接探针扩增试剂盒
（multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA）
神经遗传学和智障
遗传性疾病
产前诊断
遗传药理学
新生儿诊断
肿瘤表征
甲基化检测
遗传性肿瘤
基础研究
mRNA Analysis
企业简介
作，新品种正在源源不断地开发出来。
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新近上市的SALSA MLPA 试剂盒
● 遗传性疾病：PKHD1, EHMT1, COL11A1, DPP6-CRKL, CYP4V2, SOX10-GFRA-EDNRB, VWF,
LRP5, SPRED1, POR, PKD1/PKD2, TCOF1, ACADVL, VPS13B, TCF4-FOXG1, NPC1, NPC2, SPRED1,
容易识别，因为此时那些峰面积较小的扩增产物（如长探针）会出现峰高降低，从福尔马林固定石蜡
包买的组织样品提取的DNA都能得到很好的检测。
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5. 开发SALSA MLPA 试剂盒过程复杂，昂贵而且耗时：因为每一条探针都需要从M13噬菌体克隆出发
进行设计和制备，而且需要纯化和酶切，后者需要使用昂贵的限制性内切酶。然而，目前 M R C - H o l l a n d
8. 投资少：所需的仪器包括一个普通的热循环仪和测序仪，两者都是多数分子生物的常规仪器。而
且价格相对的测序仪也不是必须的，可以用LICOR和 ABI373和377代替。
RБайду номын сангаас
MLPA 的局限性
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1. MLPA 只能检测探针覆盖序列的拷贝数变化。
2. 如果靶序列中发生突变或者多态性，会导致相对峰面积下降。
公司致力于新型第三代分子诊断试剂的研发生产，主要产品有：遗传病系列核酸检测试剂盒、传染病系 列核酸检测试剂盒、肿瘤系列核酸检测等系列试剂盒，以及可见光电泳透射仪、自动化核酸提取系统等，产 品已广泛应用于医院、疾控、科研、商检等多个领域。
企业宗旨
公司以“自主创新、服务社会”宗旨，探索高科技产业发展之路，旨在不断超越自我，建立现代企业管 理制度，以科技创新创造社会价值，以诚挚服务提高人民健康水平，努力创建世界一流生物高科技企业。 发展战略：自主创新，合作共赢 企业宗旨：以人为本，服务社会
如前所述，未连接的探针无法被扩增，也不会产生荧光信号。因此，扩增产物的相对信号强度就取决于