多重连接依赖式探针扩增技术
多重连接依赖性探针扩增技术在产前诊断中的应用
多重连接依赖性探针扩增技术在产前诊断中的应用产前诊断是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患胎的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术是在多重扩增探针杂交(MAPH)技术的基础上改进而来，基本原理是针对基因组内拷贝数变异(CNV)对可与样本DNA正确杂交并被连接酶连接的探针进行扩增和半定量分析，具有精确度高、重复性好、操作简便及通量大等特点。
MLPA已广泛应用于染色体数目异常、遗传性疾病基因缺失重复、单核苷酸多态性、甲基化等多个研究领域等。
随着MLPA不断被改进，目前已成为临床上常用的产前诊断工具之一，因此本文就其在产前诊断中的应用做一总结。
1 MLPA原理MLPA是集DNA杂交技术、PCR技术、连接酶反应技术和毛细管电泳技术与一体，具有高特异性、高灵敏性和高通量的一种分子生物学技术。
MLPA最大特点在于探针的设计。
探针包括两个长短不一的荧光标记寡核苷酸片段。
短探针(5' 端探针)为化学合成而来，长约50-60bp，包括一段3'端与靶序列完全互补的杂交序列和一段5' 端长19 nt的共同PCR上游引物互补序列。
长探针(3'端探针)是经M13噬菌体衍生法制备而来，长约60-450bp，包括一段5'端与靶序列完全互补的杂交序列和一段3'端23nt共同PCR下游引物相互补序列及一段长度不一的中间填充序列。
由于填充序列长短不一，连接后总长度在130 nt-480nt之间，相邻两探针扩增产物长度相差6-9 nt，因而能在一个反应体系中，仅用一对引物即可扩增达45个不同的核苷酸序列。
由此可见，MLPA所得到了产物不是直接针对原始样本中存在的序列，而是由两条探针经连接反应形成的片段。
连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，连接反应才能进行，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。
MLPA技术原理2解读
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
多重连接探针扩增技术融合了 DNA 探针杂交和 PCR 技术的特点，且 发扬了其连接依赖的特色，优点如下：
自动化程度高
耗时短，24 h 内即可出结果
Add
所需样本量小，最 少仅需 20 ng DNA Your Text 即可完成检测
针对每一个待测靶基因序 列，均有一对 MLPA 探针，由一 个短的化学合成寡核苷酸片段 和一个长的通过磁珠法制备的 寡核苷酸片段组成。检测时先使 待测双链 DNA 变性解链，加入 连接酶，调节连接温度。若待测 核酸中含有靶序列，则两个探针 与待测核酸互补良好，连接反应 可进行，反之，若其中一条探针 的序列与待测靶基因序列不完 全互补，甚至只有一个碱基不互 补，也会使杂交不完全而使连接 反应无法进行。
MLPA 技术原理
针对每一个待测靶基因序列 ，均有一对 MLPA 探针，由 一个短的化学合成寡核苷酸 片段和一个长的通过磁珠法 制备的寡核苷酸片段组成。 检测时先使待测双链 DNA 变 性解链，加入连接酶，调节 连接温度。若待测核酸中含 有靶序列，则两个探针与待 测核酸互补良好，连接反应 可进行，反之，若其中一条 探针的序列与待测靶基因序 列不完全互补，甚至只有一 个碱基不互补，也会使杂交 不完全而使连接反应无法进 行。
MLPA 技术原理
该技术主要包括：探针与靶序列的 杂交、探针的特异化连接、连接探针 的扩增和结果的检测分析。针对每一 个待测靶基因序列，均有一对 MLPA 探针，其由一个短的寡核苷酸片段（ 短探针）和一个长的寡核苷酸片段（ 长探针）组成。该技术的特色之一是 仅扩增连接完好的探针，而不是扩增 样本靶序列。MLPA 技术原理MLP Nhomakorabea技术原理
多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在自然流产样本检测中的应用
讨
论
孕 早 期 胚 胎 染 色 体 异 常 是 自然 流 产 的 重 要 原
因 。有 研 究 表 明 ， 自然 流 产 中 胚 胎 染 色 体 异 常 占
５ （ ） 左 右ｌ ＾ ］ 。 自 然 流 产 胚 胎 的 细 胞 遗 传 学 研 究 发 现， 由于 染 色 体 数 目异 常 所 致 的 胚 胎 发 育 不 良而 造 成 的妊 娠 中断 ， 是 自然 流 产 最 常 见 的 原 因 之 一 ［ ４ 。 受 精 卵 细 胞 的 正 常 分 裂 是 胚 胎 发 育 过 程 中 的 关 键 环
养， 少量标 本 即可进行 检测 ， 针 对 易 发 生 非 整 倍 性 改 变 的 染 色 体 上 的几 个 热 点 基 因 设 计 特 异 性 探 针 ， 根
据 特定 基 因拷 贝数 的改 变 ， 即可确 定 染 色 体数 目的
异常。
ＭＬ Ｐ Ａ 具有 高 度特 异性 ， 如 果靶 序 列 与探 针序
一
该染 色体增 多或 减 少 一条 ， 亦 即导 致 三体 性 或 单 体 性 。２ １ ＿ 三体在 活产 儿 中最常见 ， １ ３ － 三体 、 １ ８三体 也 偶尔 可见 ， 而其他 常染 色体 的三体 性 大多导 致流 产 ，
本 实 验 所 用 的 ＭＩ Ｐ Ａ Ｐ ２ ９ （ ） 试 剂 盒 主 要 用 于 检 测
８ ７ ． ５ ％。细胞 染 色 体 数 目异 常 在 群 体 中 发 生 率 约 ３ ， 在 前 ３个 月 的 自然 流 产 胚 胎 中发 生 率 可 高 达
５ （ ） ～６ （ ） ， 这 种 染 色 体 数 目异 常 的 改 变 主 要 有 常
知流产 密切 相关 的染 色 体 畸 变 ， 本 实 验 选 择 了组 合
多重连接探针扩增技术诊断鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症五例重点
测。纳入研究患儿临床表现：持续呕吐、口唇发紫，
昏迷，血氨升高等。所有检测均经过上海交通大学
医学院附属新华医院伦理委员会同意（批准文号：
ＸＨＥＣ．Ｄ－２０１２－０３５），并获得被检测者父母的知情 同意。 二、方法
果
ｐ。ｍｏｌ／Ｌ。串联质谱检测血瓜氨酸水平６例
１．实验室检测：（１）串联质谱检测方法：采集患
失。例２和例５由于患儿死亡，采母静脉血进行基
只需２０ ｎｇ基因组ＤＮＡ，最大特点仅扩增结合完好 的探针且一次反应可以检测４５个靶序列拷贝数的
因检测，对患儿进行推测，患儿母亲分别携带外显子
２～６和外显子１～４杂合重复。
表２ ＭＬＰＡ检测不同Ｊ＇ｌ－显子５例ＯＴＣＤ患儿或母亲 异常结果（检测者结果与正常值比值）
ｑｕｏｔｉｅｎｔｓ，ＤＱ）计算，ＤＱ＝０表示纯合缺失；０．４＜ＤＱ
＜０．６５表示杂合缺失；０．８＜ＤＱ＜１．２为正常；１．３ ＜ＤＱ＜１．６５为杂合重复；１．７５＜ＤＱ＜２．１５为纯合 重复。 结 一、实验室检查结果 ７例患儿血氨均＞２００ ｉｘｍｏｌ／Ｌ，其中１例最高 达２
５００
６岁时死亡，２例死亡患儿采母亲静脉血进行基因检
ｐｒｏｇｒａｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｇｒａｍ（２０１ ２ＢＡｌ０９８０４）
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０５７８－１３１０．２０１６．０６．０１０
作者单位：２０００９２上海交通大学医学院附属新华医院上海市儿科医学研究所内分泌／遗传科 通信作者：韩连书，Ｅｍａｉｌ：ｘｈｈａｎｌｓ＠１６３．ｃｏｎ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭＬＰＡ）进行检测。本研究对Ｓａｎｇｅｒ测
多重连接依赖式探针扩增（MLPA）技术
多重连接依赖式探针扩增（MLPA）技术多重连接探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)是MRC-Holland在2002年开发的⼀种分⼦技术。
它是⼀种灵敏的技术，可以快速有效地定量核酸序列。
它在世界各地的许多实验室进⾏，可⽤于检测基因的拷贝数变化(如缺失或复制)，识别DNA的甲基化状态，检测单核苷酸多态性(SNPs)和点突变，量化mRNA。
因此，它被应⽤于许多研究和诊断领域，如细胞遗传学、癌症研究、⼈类遗传学等。
⼯作原理MLPA基本步骤如下，具体见图解1．变性2．杂交3．连接4．扩增（通过PCR）5．⽚段分离和数据分析详细解释变性和杂交变性涉及退⽕DNA链的分离，使双链DNA变成单链。
杂交即将DNA样本与特定探针杂交。
由于它是⼀种多路复⽤技术，可以同时使⽤多达60个探头分析每个样本，从⽽针对不同的位点。
这些探针具有引物序列，在扩增过程中与PCR -引物结合。
所有不同的探针都有相同的引物结合序列，此外，探针还具有与⽬标位点互补的杂交序列，使探针能够与DNA结合。
两种探针将在DNA链的相邻位点杂交。
这对探针中的⼀个包含⼀个填充序列，每个⽬标位点的填充序列长度不同。
填充序列的长度在不同的探针之间变化，允许多路复⽤。
所以每个放⼤产物都有⼀个唯⼀的长度。
连接连接步骤将两个探针结合在⼀起，在这个步骤中，使⽤⼀种叫DNA连接酶的特定的酶，它与已经在⽬标位点DNA链相邻位点杂交的探针结合。
MLPA中使⽤的连接酶是ligase-65，这是⼀种依赖于NAD的连接酶，在其他应⽤中也很有⽤。
如果我们的⽬标是连接两个探针，为什么它们⼀开始是分开的分⼦? 两种探针都含有PCR-引物的结合位点。
这意味着，如果我们将探针作为单个分⼦使⽤，即使没有DNA靶点，我们也可以得到扩增产物，从⽽得到⾮特异性扩增。
连接酶是⾮常特异性的，如果探针与⽬标位点不匹配，连接酶将⽆法与探针结合，也不会发⽣扩增。
多重探针连接依赖式扩增技术在常见非整倍体染色体异常快速产前诊断中的应用研究——附407例检测报告
［ 关键词］ 多重探针连接依赖式扩增技术；非整倍体染色体异常；快速产前诊断；
染 色体核 型分析 Ｓｕ ｙｏ ｓ ｇ ｍｕｔ ｌ ｇ ｔ ｎｄ ｐ ｎ ｅ ｔｐ ｏ ｅａ ｌ ｃｔ ｎ （ Ｐ ｔｄ ｎ ｕ ｉ ｌｐｅ ｌ ａｉ ・ｅ ｅ ｄ ｎ ｒｂ ｍｐｉ ａｉ ｎ ｉ ｘｉ ｏ ｉ ｆ ｏ ＭＬ Ａ）ｉ ａ ｉ ｒｎ ｔｌｄａ ｎ ｓ ｆ ｎ ｒ ｐｄ ｐ ｅ ａａ ｉｇ ｏｉ ｏ ｓ
及 ｘ 单 体 １ ，与羊水 细胞培 养 染 色体 Ｇ 显 带核 型 分析 结 果 一致 。ＭＬ Ａ检 测 出的 １例 ｘ单 体 ． 例 Ｐ 疑似样 本 ，经核 型 分 析 结 果 验 证 为 正 常 核 型 。ＭＬ Ａ 检 测 非 整 倍 体 性 染 色体 异 常 的敏 感 度 为 Ｐ １０ ，特 异度 为 ９．５ ，阳性 预测值 为 ９ ％ 。结论 ： Ｐ ０％ ９７ ％ ０ ＭＬ Ａ分析技 术 作 为一项 快速产 前诊 断技
ｏ ｏ ｆ ｃ ｍｍｏ ｈ ｏ ｓ ｍｅ ａ ｕ ｌ ｉｙ ｎ ｃ ｒ ｍｏ ｏ ｎｅ ｐ ｏ ｄ ．Ｍ ｅ ｈｏ ：Ｆ ｕ ｕ ｄ ｅ ｎ ｅ ｅ ａ ｅ ｆａ ｉ ｔ ｕ ｄ ｓ ｍｐ ｅ ｒ ｔｃ ｔ ｄｓ ｏ ｒｈ ｎ ｒ ｄ ａ ｄ ｓ ｖ ｎ ｃ ｓ ｓｏ ｍｎ ｏｉ ｆ ｉ ａ ｌｓｗｅ ｅｄｅｅ － ｃｌ
７４ １
新医学 ２ １ ０ ２年 １ ０月第 ４ ３卷第 ｌ ０期
论 著
多重探 针 连 接依 赖 式扩 增技 术在 常见 非整 倍体 染 色体 异 常 快 速产 前诊 断 中的应 用 研 究
— —
附４ ７例检测报告 ０
钧 王 青青 林俊伟 叶燕绸 侯 红瑛
多重链接探针扩增技术的原理及应用
多重链接探针扩增技术的原理及应用史喜菊;郝俊虎;柏亚铎;马贵平;乔彩霞;刘全国;李炎鑫;李冰玲【摘要】多重链接探针扩增技术是将核酸杂交和PCR链式扩增相结合的一项高通量检测技术.该技术特异性强、敏感性高,可以实现多达50个靶分子的同步检测.自2002年被报道以来,该技术取得了很大进展,目前已广泛用于遗传性疾病的基因检测、肿瘤预后及传染病高通量检测领域.本文就多重链接探针扩增技术的原理、优缺点及应用等进行了探讨.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2015(032)011【总页数】4页(P66-68,71)【关键词】多重链接探针扩增技术;原理;应用【作者】史喜菊;郝俊虎;柏亚铎;马贵平;乔彩霞;刘全国;李炎鑫;李冰玲【作者单位】北京出入境检验检疫局,北京100026;宁夏出入境检验检疫局,宁夏银川750001;北京出入境检验检疫局,北京100026;北京出入境检验检疫局,北京100026;北京出入境检验检疫局,北京100026;北京出入境检验检疫局,北京100026;北京出入境检验检疫局,北京100026;北京出入境检验检疫局,北京100026【正文语种】中文【中图分类】S851.3多重链接探针扩增技术（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）最早是由荷兰的Schouten博士于2002年发明的，是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行检测和分析的新技术［1］。
该技术仅需20 ng/μL模板DNA或RNA，即可通过简单的探针杂交、连接及PCR扩增和电泳步骤，在同一反应管中对多达50个不同的靶基因进行检测和分析。
该技术经过短短几年的发展，目前已经在遗传疾病、基因甲基化分析等多个领域中得到了广泛应用［2-3］。
MLPA技术是将核酸的杂交检测和PCR链式扩增相结合，从而实现多对靶分子的高效特异性分析。
其核心技术是设计与目的靶序列高度特异性的长探针和短探针，发生MLPA反应时，这两段探针首先分别与模板序列杂交，之后通过连接酶将两段探针进行连接。
多重连接依赖式探针扩增技术在遗传病分子诊断中的应用
多重连接依赖式探针扩增技术在遗传病分子诊断中的应用黄际卫;商璇【摘要】多重连接依赖式探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)是近年发展起来的基因检测新技术,可通过简单的杂交( hybridization)、连接(ligation)及PCR( polymerasechain reaction)扩增反应于同一管内同时检测出多达40种基因组DNA或RNA拷贝数变化.凭借其操作简单、高通量、稳定可靠等特点,该技术在遗传病的分子诊断等领域的应用已得到迅速的推广,本文就MLPA技术的原理、特点以及在遗传病分子诊断中的实际应用等作一综述.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2012(004)004【总页数】5页(P274-278)【关键词】多重连接依赖式探针扩增;遗传病;分子诊断【作者】黄际卫;商璇【作者单位】南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室,广东,广州510515;南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室,广东,广州510515【正文语种】中文多重连接依赖式探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）是荷兰学者Schoute等[1]于2002年研发的一种高灵敏度的基因序列相对定量技术，该技术一次反应最少可对20 ng DNA或10 ng RNA进行检测，为Southern杂交及微阵列（micro-arrays）反应所需模板量的1/100～1/1000；此技术操作简单，24小时内可出结果，自动化程度高，有相应的数据分析程序；其检测结果稳定可靠；此方法也适用于石蜡包埋或福尔马林浸泡过的标本。
近来由MLPA延伸出另外两种技术，一种是逆转录酶多重连接探针扩增法（reverse transcript MLPA），用于mRNA的表达检测[2]；另一种是甲基化特异性多重连接探针扩增法（methylation-specific MLPA），同时适用于拷贝数定量和甲基化特异性扫描[3]。
MLPA多重连接探针扩增试剂盒概论
企业宗旨
公司以“自主创新、服务社会”宗旨，探索高科技产业发展之路，旨在不断超越自我，建立现代企业管 理制度，以科技创新创造社会价值，以诚挚服务提高人民健康水平，努力创建世界一流生物高科技企业。 发展战略：自主创新，合作共赢 企业宗旨：以人为本，服务社会
syndrome, DiGeorge syndrome, Cri du Chat, Pelizaeus-Merzbacher, CMT1, HNPP等；
● 亚端粒区域的拷贝数变化；
● 染色体非整倍体（包括羊水细胞样品）；
● 肿瘤诊断：如 ALL, CLL, oligodendrogliomas, melanomas, neuroblastomas的DNA拷贝数变化；
6
神经遗传学与智障
15
遗传性肿瘤与肿瘤表征
28
药物基因组学
44
甲基化检测
46
mRNA Analysis (RT-MLPA)
53
其它产品
55
附录1 样品处理
65
附录2 核酸提取系统
68
附录3 唾液收集器介绍
71
MLPA简介
®
MLPA 简介
®
MLPA 高效灵敏的基因组和甲基化分析方法
AGXT-GRHPR, LARGE, UBE3A, TPO-PAX8-FOXE1-TSHR, FCGR基因簇分析, BRCA2 确认试剂。
● 肿瘤：P335 IKZF1-ALL, P202 IKZF1, P370 BRAF失活-IDH 突变。
mlpa的原理介绍及结果解读
MLPA（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification）是一种用于检测基因突变和基因组重排的技术，它结合了DNA探针杂交和多重连接依赖探针扩增的原理。
MLPA技术是一种快速、精确且高通量的分子生物学方法，可以用于检测某些常见的遗传疾病、肿瘤基因的突变以及复杂疾病的基因组变异。
在本文中，我们将深入介绍MLPA的原理和应用，并对其结果进行解读。
一、原理介绍1. DNA探针杂交MLPA技术首先涉及到DNA探针的杂交。
DNA探针是一小段特异性的DNA序列，可以与目标DNA序列结合。
在MLPA中，DNA探针通常包括两部分：一个用于与目标DNA序列结合的特异性序列，以及一个用于扩增和检测的通用序列。
2. 多重连接依赖探针扩增在DNA探针杂交之后，MLPA技术利用DNA连接酶将相邻的两个DNA探针连接在一起，形成一个新的DNA分子。
随后，利用PCR扩增这些连接好的DNA分子，通过引入荧光标记或者其他检测标记，可以对扩增产物进行定量检测。
3. 结果解读通过MLPA技术得到的结果，可以通过测序仪或者其他相关仪器进行检测和定量分析。
根据扩增产品的数量和荧光信号的强度，可以对目标DNA序列的存在与否进行判断，从而检测出基因突变或基因组重排等变异情况。
二、应用和意义MLPA技术在临床诊断、基因组学研究和生物医学领域有着广泛的应用。
它可以用于检测单基因遗传病的突变，例如囊性纤维化等疾病；也可以用于检测肿瘤基因的突变，用于癌症的诊断和预后判断；MLPA 技术还可用于复杂性疾病的基因组变异研究，如精神病学和自闭症等方面。
三、结论通过MLPA技术，我们可以快速、准确地检测出目标DNA序列的存在与否，进而诊断疾病、研究基因突变和基因组重排。
它的高通量和高灵敏度，使得MLPA技术在基因检测领域具有重要的应用前景。
未来，随着生物技术的发展和MLPA技术的不断完善，相信它会在医学和生物学领域发挥更大的作用。
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扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳或通过毛细管电泳等进行分离。 电泳结果经软件（ Genemapper ， GeneMarker ， coffalyser ）分析，得出的探 针峰信号缺失或增高、降低都表示该靶基因拷贝数异常。
灵敏度高 特异性高 精准度高 重复性强
操作简便
高通量检测
不能用于单个细胞的检测 不能用于检测短串联重复序列多态性 ( STR)
不能检测染色体的平衡易位
检测染色体数目异常 检测人类基因或基因片段的缺失与重排 基因甲基化检测（MS-MLPA） 肿瘤诊断与治疗方面的应用
Байду номын сангаас
探针结构 MLPA 最大的特点在于探针的设计，因而能在一个反应体系中，仅用 一对引物即可扩增45 个不同的核苷酸序列。 针对每个待测基因靶序列设计了一对探针，这一对探针包括一条经化 学合成的短探针（5' 端探针）和一条经M13 噬菌体衍生法制备而来的 长探针（3' 端探针）。
短探针长约50-60 bp，包括一个位于其3' 端幵与靶序列完全互补的杂交序列和一个位于其 5' 末端19 nt 的共同序列，该共同序列与标记的PCR 引物相同。 长探针长约60-450 bp，包括一个位于其5' 末端幵与靶序列完全互补的杂交序列和一个位 于其3' 末端23 nt 的共同序列及两序列间的长度特异填充片段，其共同序列与未标记的PCR 引物相互补。 由于填充片段长短不一而可以区分不同的探针。连接后探针长度在130nt-480nt 之间，相 邻两探针相差6-9 nt。因此可同时检测基因组多达 40种不同靶基因。
MLPA技术最早由荷兰学者 Dr . Schouten JP于 2002年提出 ,是一种高通 量、 针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术 ,它利用简 单的杂合 ( hydriation)、 连接 ( ligation)及 PCR扩增 ( PCR amplication)反 应 ,于单一反应管內可同时检测 40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。 到目前为止广泛的应用于基因检测及基因诊断等多个领域 ,如染色体 数目异常 ( Trisomy13、18 & 21)、 遗传性疾病基因缺失重复 (如 DMD、 HNPCC等 )、 基因甲基化检测等。
该技术的特色之一是仅扩增连接完好的探针 ,而不是扩增样本靶序列。 扩增环节仅需 2条引物一是标记的引物 Y,另一是未标记的引物 X。 PCR 反应以连接的探针为模板由一对通用引物进行扩增。
在所有的短探针的 5‘ 端均有一段 19 nt的共同序列 ,该序列与标记的引物Y的核酸序 列相同;在所有长探针的 3‘ 端均有一段 25～43 nt的共同序列 ,该序列与未标记的引 物 X的核酸序列互补。因此 ,所有连接探针的 PCR扩增所用的是同一对引物。若两探 针连接 ,则扩增可进行;若两探针未连接 ,则扩增无法进行。