最新免疫测定室内质控血清的应用
体外免疫分析室内质量控制
体外免疫分析室内质量控制一、质量控制的目的质量控制方法是用于监测检验方法的分析性能，警告检验人员存在的问题。
质量控制一般通过检测质控品来实行。
根据统计量判断检验结果的质量，是否需要做系统的纠正，患者检验结果是否可接受。
室内质量控制主要是控制每次检测的重复性，即精密度；通过对常规工作进行质量控制，监测测定方法或检测系统的稳定性，按规定的指标对每次测定的质量做出评估，并决定测定结果的取舍，以保证标记免疫分析的精密度和可比性，及时发现和克服造成误差的原因，提高检测的质量。
为此，必须建立检测项目操作规程，完善标本采集、运输、接受与保存过程，严格检测报告核对签发制度，加强仪器与试剂的管理，严格工作分区、制订工作制度，对相关人员制订业务学习与培训计划，完善质量管理记录。
二、质量控制的计划1.规定质量要求根据允许总误差规定质量要求。
允许误差包括随机误差和系统误差，即方法的不精密度和偏倚。
超过此限说明检验质量不可接受。
2.确定方法性能确定分析方法的关键指标：不精密度和偏倚。
除了这两者外，还需了解方法的不稳定性，如：分析误差预期的类型、大小和产生的频率。
对质控品进行重复检测可求出不精密度。
可以根据美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）EP5-A求出不精密度。
在实际工作中，可以测定值与室间质评/能力验证（PT）的均值作为偏倚的估计。
3.制定质量控制策略应确定：检测不同浓度质控品的种类及每种的次数；质控品放置的位置；选择的质控规则。
4.预测质量控制的性能质量控制性能的指标是指误差检出概率和假失控概率。
可根据功效函数图预测不同质量控制规则在不同质控测定结果个数时的误差检出概率和假失控概率。
5.设定质量控制的性能根据预测出的不同质量控制规则的多种特性，结合临床要求和检验工作实际情况，可选定出合适的误差检出概率和假失控概率。
6.选择合适的质量控制规则基于功能函数图、临界误差图和操作过程规范图选择适当质量控制规则、质控品的测定数。
免疫项目实验室内质量控制
精密度
定性测定精密度质量要求
定性免疫测定精密度分析质量指标为C5~C95区间 浓度范围≤C50±20%
精密度
以COI或S/CO比值表示结果的定性免疫测定的精密度
同生化定量试验精密度。 批内精密度（重复性） 批间精密度（中间精密度）
定性测定精密度质要求
批内精密度要求： CV≤10%，且批内CV≤（1+10%）*CV1 注：CV1为试剂盒说明书规定的批内CV
意义 准确度 准确度 测定下限 交叉反应 准确度
准确度
准确度（accuracy）：分析物的测定结果与真实结果之间的接 近程度。准确度的定义在定性测定，是指样本阳性或阴性测定 结果与其真实结果的一致性程度。通常通过方法学比较来实现。
精密度
定性测定的精密度 以COI或S/CO比值表示结果的定性免疫测定的
可重复检测 出待测物质 的最低浓度 水平。不同 类型标本检 测下限可能 不同。
一种检测方 法仅对样本 中的待测物 质反应，而 与其他物质 不发生反应 的能力。
当特定疾病 存在时，患 者标本检测 结果为阳性 或超过正常 值范围的比 率。
当特定疾病 不存在时， 患者标本检 测结果为阴 性或者在正 常值范围内 的比率。
3. 分析敏感性（检出下限） 4. 对转化血清盘的检测能力 5. 分析特异性（交叉反应） 6. 干扰因素
敏感性 特异性 分析敏感性 分析特异性 临床敏感性 临床特异性
概念
当分析物 存在时， 其检测结 果呈阳性 或超过正 常值范围 的比率。
当分析物 不存在时 ，其检测 结果呈阴 性或者在 正常范围 内的比率 。
特异性：TN/（TN+FP）*100% （分析物阴性中，检测结果呈阴性的比
免疫测定的室内质量控制
Levey-Jennings质控图方法
也称Shewhart质控图，是由美国的 Shewhart于1924年首先提出，并用 于工业产品的质量控制。后来（二十 世纪五十年代初），Levey-Jennings 将其引入临床检验的质量控制 。经 Henry和Segalove的改良，即为目前 常用的Levey-Jennings质控图。
免疫测定的室内质量控制
卫生部临床检验中心 李金明
免疫测定技术的发展
（1）以抗原抗体的结合反应所致的沉淀或凝集现象判断 结果的免疫测定技术，如单双扩，免疫电泳，玻片凝集， 胶乳凝集，红细胞凝集试验等； （2）固相标记免疫测定技术，如放射免疫试验，酶免疫 试验，荧光免疫试验等； （3）均相免疫测定技术，如酶放大免疫测定技术 （EMIT），克隆酶供体免疫测定（CEDIA）等； （4）以单克隆抗体为基础的免疫测定技术的发展； （5） 以基因工程技术为基础的免疫测定技术发展时期； （6）免疫测定的自动化； （7）生物芯片技术（免疫测定的集成化和微型化）。
实验室设施：温湿度控制设备、稳压或不 间断电源
仪器设备及管理：酶标仪、洗板机、全自 动免疫分析仪、加样器等应建立技术档案， 并定期维护和校准
标准操作程序（SOP）的建立
统计质控方法
定性免疫测定质控物浓度的选择 Levey-Jennings质控图方法 “即刻法”质控方法 免疫测定IQC的特殊性 质控图在不同批试剂间的连续
13.210
0.820
0.0
0.333
0.2
1.095
0.5
1.914
1.0
3.771
0.337
2.0
6.809
0.388
5.0
10.095
1.196
ELISA检测HIV抗体室内质控血清的制备与应用分析
ELISA检测HIV抗体室内质控血清的制备与应用分析目的探讨分析ELISA检测HIV抗体室内质控血清的制备与临床应用。
方法应用ELISA对我血库收集的血液标本32000份进行HIV抗体检测；同时选择正常人群血清与试剂盒内HIV阳性血清混合稀释，混合恰当比例，冷藏保存使用；同时将自制的质控血清保存1～12个月，对其均匀性、精确性及稳定性进行评价。
结果ELISA法检测结果显示阳性115例，阳性率为0.36%，实际上HIV 抗体为阳性共120例，漏诊率为0.016%；研究结果显示正常人群的血清与试剂盒内HIV阳性血清以10：1的比例进行混合最为恰当；对自制的质控血清为期1～12个月的观察，发现其均匀性、S/CO值、准确性12个月的差异不显著（P＜0.05），无统计学意义。
结论ELISA在HIV抗体的检测中具有较高的准确度，且检测结果能够在短时间内反映，值得临床推广应用；同时发现自制质控血清经济方便，且具有稳定性高的优点，具有较大的应用前景。
标签：ELISA；HIV抗体；质控血清HIV指人类免疫缺陷病毒，HIV病毒对人体的免疫系统造成破坏进而削弱机体的免疫抵抗力，造成健康人群患上获得性免疫缺陷综合征，感染HIV的途径主要包括血液传染、性交、母婴传播。
现阶段，临床上对于艾滋病的治疗尚无显著进展，患者大都以死亡告终，其对人类的身体健康和生命安全产生极大的威脅，引起了国内外医学的高度重视[1]。
目前，艾滋病主要以早发现及早控制为主，ELISA法在HIV抗体的检测中作用显著，然而有诸多因素会导致其检测结果出现偏差，故进行室内控制十分有必要，本文旨在探讨分析ELISA检测HIV抗体室内质控血清的制备与临床应用，具体信息如下。
1 资料与方法1.1一般资料由上海纪宁实业有限公司提供的人抗人类免疫缺陷病毒抗体（HIV）酶联免疫试剂盒；由北京万泰生物药业有限公司提供的HIV抗体试剂盒，批准文号：国药准字S2*******；由卫生部临检中心提供的临界值质控血清，批号为NCCL 070049；由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供的酶标仪。
ELISA检测HIV抗体室内质控血清的制备与应用
［］壶垂亘！变垂蚴：ｉ墨墼！鳗生！亘塑圆亟匦画［］
由于很多因素都会影响到ＥＬＩＳＡ法检测结果的准确性． 所以每次检测都应进行室内质控【ｌｌ。我们试制了抗一ＨＩＶ室内 质控血清．并与卫生部临床检测中心生产的ＨＩＶ抗体室内质 控血清进行了对照．考核了其精密性、均匀性和稳定性。现报
告如下．
血清稀释成低值弱阳性．分别以每管０．５ｍ１分装，置一２０℃保 存备用。检测方法分别按照说明书操作步骤严格执行。 １．３统计学处理采用统计学软件ＳＰＳＳ １２．０建立数据库． 通过ｔ检验和卡方检验，以Ｐ＜Ｏ．０５差异有统计学意义。
近的弱阳性外部对照质控血清，反应强度的变化很容易观俨＞ｏ．０５）。提示自制质控血清和标准质控血清的准确性无明 测，并且能指示出改变的检测能力，即能显示半定最分析或 定性分析上的假阴性结果或误差。为了确保ＨＩＶ抗体检测的 显差异。通过两种试剂盒对随机抽取的ｌＯ支自制质控血清 进行测定，ＣＶ分别为１２．１％和１０．８％。与标准（下转第５６８页）
万方数据
・５６８・
第２７卷第５期
２００９年ｌＯ月
实
验
与
检
验
医
学
ＭＥＤＩＣＩＮＥ
Ｖ０１．２７ Ｎｏ．５ Ｏｃｔ．２００９
ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ
ＡＮＤ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
正常的上呼吸道有许多常居菌寄生。如鼻咽部的大量甲 型溶血性链球菌、奈瑟氏菌属、类白喉棒状杆菌、卡他布兰汉 菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡葡球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈 瑟菌、流感嗜血杆菌及真菌等。在正常情况下．这些细菌是不 致病的。但是在机体全身或局部抵抗力减低或其他外因影响 下。它们可以致病，并可以侵入下呼吸道引起感染。另外，在 上呼吸道标本的微生物学检验中．几乎每一份日Ｉ！Ｉ拭子都是有 菌的．分离出来的病原微生物是否与疾病有关．需要临床医 生和微生物学检验人员共同根据病原微生物的特点及其检 出数量，病人的临床症状等各方匝综合分折．以作出正确判 断１１Ｉ。 新生儿由于本身的特点．非特异性免疫及特异性免疫功 能均有一定的缺陷。与成年人相比．新生儿的抵抗力较弱．对 细菌、病毒等医院感染不易局限．此诸多方面造成新生儿的 易感性。胎儿和新生儿对感染的高度易感性主要是免疫功能 发育不全１２ｌ：新生儿呼吸道管腔狭窄、黏膜柔软、衄管丰富、纤 毛运动差。易致气管阻塞、感染：呼吸困难及拒乳；同时皮肤 黏膜薄弱易损伤、脐残端未完全闭合．离血管近，细菌易进入
免疫学检验室内质量控制的标准操作程序
目的：室内质量控制〔IQC〕是由实验室的工作人员采用一系列的方法，连续的评价实验室工作的可靠程度，确立报告能否发出。
旨在检测、控制本室常规工作的精密度，并检测其准确度的改变，提高本室常规工作中批间、批内标本检测的一致性。
2.0分析前质控:人员培训: 实验是人操作的，因此检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识：检验项目的基本原理〔ELISA原理〕；临床意义；熟悉检测技巧，了解易出过失的环节及难点；熟悉检测试剂性能〔包括试剂盒组成，包被片段及其组成〕；熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识。
某些特殊项目的检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。
2.2 室内质控血清：采用卫生部或省临床检验中心制备的质控血清卫生部规定乙肝试剂，丙肝试剂，艾滋病试剂，梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格，并贴有防伪标签的产品。
2.4试剂盒评价:试剂评价需要有权威的血清考核盘〔Panel〕进行检测，价格昂贵，操作繁琐，一般实验室不易开展，可以通过以下信息，了解试剂质量。
根据该试剂生物制品鉴定所的批批检定报告，了解其质量水平，按照质量计划选择灵敏度高的或特异性高的试剂；2.4.2通过询问试剂包被物的组成，如原料来源〔基因工程或合成多肽〕，片段的组合〔按比例混合或化学合成〕，片段的长短等判断试剂的优劣；参考室间质评报告中对试剂的评价结果，了解不同试剂的质控成绩。
根据权威部门发布的试剂评价结果，了解市场上试剂的质量优劣。
2.5仪器质控:移液器：ELISA加样量小〔5-100ｕl〕，其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±10%以内；水浴箱：经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中〔或温箱内〕实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul ，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞；酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。
免疫测定质控血清和标准物质的应用
现 1I U/ ml ≈0. 5ng/ ml
HBsAg室 内 质 控 品 的 选 用
定值
适用试剂
0.2IU/ml Murex， 生 物 梅 里 埃 试 剂
0.5IU/ml 1IU/ml
Ortho， Bio-Rad试 剂 ， 雅 培 i2000和 Axsym检 测 系 统和配套试剂
国 产 试 剂 盒 （ 万 泰 、新 创 、科 华 … … ） ， 血 站 和 医院用
现1NCU/ml≈0.25NCU/ml
适用试剂
国 产 试 剂 盒 （ 新 创 、科 华 、 GBI… … ） 万泰
进 口 试 剂 及 /或 配 套 仪 器 RPR、TRUST
抗 HIV质 控 血 清 定 值 的 调 整 及 选 用
定值 （调 整前）
1NCU/ml 2NCU/ml 4NCU/ml
定值 （调 整后）
• 参 考 文 献 ： Comparison of a measurement result with the certified value
• http://www.irmm.jrc.be/html/reference_materials_catalogue/user_support/us e.htm
免疫测定质 控 血 清和标准物质 的应用
张瑞 卫生部 临 床检验 中心
免疫测定用 室 内质 控 血 清的调 整
HBsAg、抗-HCV和抗HIV-1定值质控血 清被批准为国家二级标准物质 调整含量 改进包装
现有 的室内质 控血 清
项目 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb HBc IgM HAV IgM 抗 HCV 抗 HIV 梅毒螺 旋体抗 体
免疫测定用 室 内质 控 血 清的调 整
临床免疫测定的室内质量控制
洗涤
洗涤是ELISA不同于均相免疫学检测技术的一大特征， 其目的是去除反应体系中与反应无关的成分，包括未 结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相 载体的干扰物质。洗涤液Tween 20 是一种非离子去 垢剂，既含亲水基团，又含疏水基团，在洗涤中的作 用机制是借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸 附于聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基团形成疏水键， 从而削弱蛋白分子与固相的吸附。
温育
温育的温度：育常采用的温度有43 、37℃、室温或 4℃等。37℃是实验室中常用的温育温度，也是大多 数抗原抗体结合的最适反应温度。抗原抗体反应一般 在37℃经1～2 h 产物的生成可达顶峰，为加速反应， 可在一定范围内提高反应的温度并在反应过程中连续 振荡来增加抗原抗体接触的概率。抗原抗体反应在 4℃更为彻底，形成的产物更多、更稳定，但因所需 时间太长，在ELISA检测中一般不予采用。
应加强检测仪器的质量控制
如定量移液器要定期校准；检查吸液和注液速 度，关机运行冲洗程序（双蒸水），清洗吸针 及水箱，仪器外观清洁；酶标仪要定期检查滤 光片是否合格，光源是否稳定，机械系统是否 有故障，保持外观清洁，并定期请厂家工程师 进行保养维修；水浴箱及存放试剂的冰箱要每 天监测温度，并有记录等。
显色 HRP 和碱性磷酸酶（ALP）。HRP可催化的底物为过
氧化氢，参加反应的显色供氢体有邻苯二胺（OPD）、 邻联甲苯胺（OT）及四甲基联苯胺（TMB）等。 TMB 的反应产物为蓝色，目视对比鲜明，其性质稳定， 对人体无毒。若选用各类酸性终止液，则会使蓝色转 变为黄色。TMB作底物时的产物检测波长为450 nm ， ALP 作为标记物，其底物一般采用对硝基苯磷酸酯 （pNPP），产物为黄色的对硝基酚，吸收波长是405 nm。为了保证结果的稳定性，必须要严格按照试剂盒 说明书中规定的温度和时间操作。
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Hook效应
梅毒螺旋体抗体血清盘
原倍 1：10 1：20 1：40 1：80 1：160 1 3.357 2.946 2.099 1.428 0.936 0.490 4 2.277 2.256 1.970 1.615 1.060 0.603 7 1.703 3.066 2.938 3.023 3.125 2.289 23 2.360 3.089 2.884 2.975 2.258 1.481
谢 谢！
36
0.5-1.0
1.6
37
0.5-1.0
1.1
38
约0.2
0.6
39
0.2-0.5
0.2
B（S/CO)
0.4 0.7 37.6 43.9 1.5 7.7 0.3 1.6 1.3 0.8 0.6
C（S/CO) D （S/CO)
0.4
9.5
0.4
9.8
36.2
27.1
41.0
47.1
0.4
0.7
19.2
1.367
+
+++
33
+
+
+
++
0.160 0.082
1.329
0.90
0.027
0.662
+
–
IgM抗体漏检
使用方法
质控血清都经过灭活处理，但仍应按照有潜在生物传 染性样本对待。 HBsAg，抗HCV，抗HIV，梅毒螺旋体抗体的质控血清加 样时按待测病人原始样本对待，依照试剂盒说明书进 行操作。 实验室收到血清后应将血清保存在–18℃以下，保质 期为1年。使用时将血清在室温复融，应注意待血清完 全融化后平衡至室温并充分混匀。复融后的血清如果 当日未使用完且无污染，可保存在2–8℃，限1周内用 完，避免反复冻融和重新分装质控血清样本。
HBsAg血清盘
灵敏度 特异性 HBsAg变异的检测能力：如G145R等 Hook效应导致的假阴性
HBsAg血清盘
样本 编号
含量(IU/ml)
A（S/CO)
1
6~8
0.2
2
8~10
1.0
10 ﹥2000000
40.8
16 约1600000
40.08阴性源自20.919阴性
9.4
27
阴性
16.6
1、4、7、23号血清稀释结果显示存在hook效应。
梅毒螺旋体抗体血清盘
TP14
TP17
TP45
TP47
EUIg M
EUIgG
A (OD值)
B
C (OD值)
D (OD值)
RPR 胶体金
1
+
++
++
+
0.09 0.736 3.199 27.35 3.776
3.604 ++ +++
4
++++ +
++++
++++
++++ ++
0.335
0.96
7
++++ +
++++
++++
++++ ++
0.256
1.12
23
++++ +/-
++++
++++ +/-
++++ +
0.225
1.13
4.041 27.61 2.169 0.654 31.24 1.215 3.948 30.24 1.897
2.006 ++ +++ 0.978 ++ +++
0.4
0.8
0.5
2.9
7.3
3.0
3.8
1.8
2.4
0.9
1.1
E （S/CO)
7.3 14.9 24.1 35.0 0.7 0.4 0.6 8.5 6.8 3.9 3.0
抗HCV血清盘
不同试剂厂家的ELISA试剂盒所用包被抗原的差异：
目前抗HCV检测ELISA试剂盒均采用HCV的基因工程或合成多肽 抗原（核心区、NS3、NS4和NS5等）包被固相，以间接法进行 测定，上述HCV抗原的组合、来源及用量等方面的差异而造成 检测结果不一致。
• 定值质控物不适合评价试剂盒整体性 能是否合格,但可用于试剂的批内、批 间变异和测定下限的评价质检。如果 需要对试剂进行比较评价和全面质检 请选用相应项目的临床考核血清盘。
临床考核血清盘
项目 HBsAg
规格 支数/套 0.5ml/支 40
抗HCV 0.25ml/支 40
梅毒螺旋体 0.5ml/支 40 抗体
免疫测定室内质控血清的应用
免疫测定用室内质控血清的调整
随着临床实验室检验水平的不断提 高和检测试剂质量的不断改进，原有的室 内质控物已经不能满足室内质控工作的需 要，因此部中心对免疫测定用室内质控血 清的含量进行了调整，同时改进了包装。
注意事项
• 室内质控物仅用于相应项目的室内质 量控制，不能用于阴阳性结果的判断。
梅毒螺旋体抗体血清盘
TP14
TP17
TP45
TP47
EUIgM
EUIgG
A (OD值)
B
C (OD值
)
D (OD值)
RP R
胶体金
1+
++ ++
+
0.09 0.736 3.199 27.35 3.776 3.604 ++ +++
4
++++ +
++++
++++
++++ ++
0.335
0.96
4.041 27.61 2.169
15 2.42 0.82 0.55 0.65 0.5 0.5 0.5 – – – –
梅毒螺旋体抗体血清盘
检测方法 1.检测非特异性抗体----使用类脂质抗
原的血清学试验 ：RPR、TRUST 2.检测特异性抗体----使用密螺旋体抗
原的血清学试验：FTA-ABS、TPHA、 TPPA 、ELISA 、WB
抗HCV ELISA出现假阳性的主要原因有：
1.类风湿因子（RF）的干扰 2.高免疫球蛋白血症 3.标本中超氧化物歧化酶（SOD）的干扰 4.用于固相包被的HCV基因工程抗原不纯
抗HCV血清盘
样本 A
B
C
D
E
编号
FG
RIBA
NS4 NS3 C NS5
28 1.22 1.87 0.65 0.78 0.77 0.67 <0.3 –
+
±
+
33 7.83 11.9 6.32 4.28 6.2 4.76 0.62 ± ++ – –
34 0.92 0.68 0.61 0.84 1.14 0.65 <0.3 +
+
–
±
35 6.41 4.11 1.86 2.99 2.81 2.04 0.34 –
+
+
–
38 1.6 2.06 1.86 0.68 1.68 2.05 1.38 ± + ± ±
2.006
++
+++
7
++++ +
++++
++++
++++ ++
0.256
1.12
0.654 31.24 1.215
0.978
++
+++
23
++++ +/-
++++
++++ +/-
++++ +
0.225
1.13
3.948 30.24 1.897
1.367
+
+++
33 +
+
+
++ 0.160 0.082 1.329 0.90 0.027 0.662 +