细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)
干细胞冻存及复苏步骤
干细胞冻存及复苏步骤
细胞冻存（缓存）
1、0.25％trypsin（或＋0.02％EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可
吹打脱落。
1、800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）
2、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:7
3、50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。
4、冻存步骤：4℃1h——－20℃1h——-－80℃1h——- -196℃液氮冻存。
（冻存细胞程
序性降温，4℃放置时间40min以上，3h以内，－20℃对细胞损伤最大，1h左右为
宜。
）
细胞复苏（速溶）
冻存管直接投入37℃水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。
根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。
计算存活率
取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率。
（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100％。
细胞复苏标准操作规程
细胞复苏标准操作规程一、准备工作在进行细胞复苏之前，需要做好以下准备工作：1.准备细胞复苏所需器材和试剂，包括细胞培养瓶、细胞复苏试剂、培养基、离心管、移液管、离心机等。
2.清洗实验器材，消毒处理，确保无菌环境。
3.计算细胞复苏所需剂量和浓度，为后续操作做好准备。
二、细胞复苏前消毒在进行细胞复苏之前，需要对细胞培养基和器材进行消毒处理，以确保细胞生存环境的安全：1.将细胞培养基和器材放入高压锅中进行高温高压消毒。
2.清洗干净细胞培养瓶，确保无残留物。
3.加入适量细胞复苏试剂，以备后续使用。
三、细胞复苏细胞复苏是将冷冻保存的细胞进行复苏解冻的过程，具体操作如下：1.将细胞培养瓶放入37℃恒温水浴中，轻轻晃动培养瓶，使试剂与细胞充分接触。
2.放置于适宜温度下培养，一般需要培养至细胞融合完全。
四、细胞计数和存活率检测在细胞复苏后，需要对细胞进行计数和存活率检测，以了解细胞的生长状态和存活情况：1.收获培养好的细胞，用离心机进行离心分离。
2.计数细胞并检测存活率，可以使用血球计数板或流式细胞仪进行计数和存活率检测。
3.记录所得数据，包括细胞数量、存活率等。
五、细胞传代和扩增在细胞生长至融合完全后，可以进行细胞的传代和扩增，以获得更多的细胞数量：1.将部分细胞进行传代培养，加入适量细胞培养基，置入37℃恒温水浴中。
2.培养一段时间，至细胞融合完全。
3.继续进行细胞的传代和扩增，直至达到所需的细胞数量。
六、细胞质量检测在细胞传代和扩增过程中，需要对细胞的形态、结构和数量进行检测，以评估细胞的质量：1.观察细胞的形态和结构，包括细胞的形状、大小、边缘等特征。
2.对细胞的生长和繁殖情况进行观察和分析，包括细胞的分裂速度、生长曲线等。
3.通过检测细胞的各项指标，综合评估细胞的质量和适用性。
七、记录和整理在细胞复苏、传代和扩增过程中，需要对各项数据进行记录和整理，以便对细胞的生长状态和质量进行评估：1.对每一步操作进行详细记录，包括操作时间、操作人员、操作步骤等。
细胞生物操作规程(3篇)
第1篇一、引言细胞生物学实验是现代生物学研究的重要手段之一。
为了确保实验结果的准确性和可靠性，特制定本操作规程。
本规程适用于所有进行细胞生物学实验的人员。
二、实验前准备1. 实验室环境：实验室应保持整洁、安静、通风良好，实验台面清洁，无菌操作区域明确。
2. 实验材料：根据实验需求准备相应的细胞、试剂、仪器等，确保材料质量合格。
3. 实验设备：检查实验设备是否正常，如显微镜、离心机、培养箱、净化工作台等。
4. 实验操作人员：实验操作人员应具备一定的细胞生物学实验技能，熟悉实验操作规程。
三、细胞培养1. 细胞复苏：将冻存的细胞按照细胞冻存和复苏标准操作规程进行复苏。
2. 细胞传代：根据细胞生长状态，定期进行细胞传代。
传代过程中，注意无菌操作，避免污染。
3. 细胞培养条件：保持细胞培养箱温度、湿度、CO2浓度等参数稳定，确保细胞生长良好。
4. 细胞观察：定期观察细胞生长状态，如细胞形态、密度等，必要时进行拍照记录。
四、细胞染色与观察1. 细胞染色：根据实验需求，选择合适的染色方法对细胞进行染色。
2. 显微镜观察：使用显微镜观察染色后的细胞，注意调整光圈、焦距等参数，确保观察效果。
3. 图像采集：使用图像采集系统对细胞进行拍照，记录实验结果。
五、细胞分离与纯化1. 细胞分离：根据实验需求，采用酶消化、离心等方法分离细胞。
2. 细胞纯化：通过流式细胞术、磁珠分离等方法对分离的细胞进行纯化。
六、细胞转染与表达1. 细胞转染：根据实验需求，选择合适的转染方法对细胞进行转染。
2. 转染效率检测：通过荧光素酶报告基因、荧光显微镜等方法检测转染效率。
3. 基因表达分析：通过RT-qPCR、Western blot等方法检测转染细胞的基因表达水平。
七、实验记录与报告1. 实验记录：详细记录实验过程、操作步骤、结果等，确保实验数据的真实性。
2. 实验报告：整理实验结果，撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果、讨论等。
八、实验安全与环保1. 生物安全：严格遵守生物安全操作规程，避免生物危害。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞复苏与冻存
慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。
3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。
4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。
细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。
2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。
4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。
细胞冷冻及复苏操作流程
细胞冷冻及复苏操作流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by the editor. I hope that after you download them, they can help yousolve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts,other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!细胞冷冻及复苏操作流程对于细胞保存和研究具有至关重要的意义。
细胞冻存与复苏 步骤PDF.pdf
书山有路细胞冻存一、实验用品：二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25%含EDTA 的胰蛋白酶、移液器、枪头、玻璃离心管、冻存管二、实验方法1、配细胞冻存液（培养液+保护剂）：DMEM培养基：胎牛血清：DMSO=7:2:1，配成1ml2、过程（1）对数生长期细胞，弃去旧培养液；（2）PBS洗清2-3次细胞（3）0.25%含EDTA胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清液；（4）加入冻存液，轻轻吹吸均匀（5）按每管1.0ml的量，分装入冻存管，拧紧管盖；（6）在冻存管上做标记，包括细胞代号及冻存日期；（7）分级冷冻：4℃冰箱内30-40min，转入-20℃冰箱60min，放入-80℃冰箱，将冻存管放入-196℃液氮罐中保存。
细胞复苏一、实验用品离心管、培养瓶、尖吸管、无菌试管，胎牛血清，DMEM培养基、大镊子、无菌纱布、二、细胞复苏1、准备工作：（1）将恒温水浴箱中的水温调至37℃（2）离心管、培养瓶，瓶口均过火（3）尖吸管，过火处理后插入无菌试管中（4）配培养液，放入超净台，瓶口过火，盖拧松，待用。
2、复苏和培养：迅速取出冻存管（1）大镊子夹其盖部，在37℃温水中快速摇动，待有残留小冰核时，快速用含有消毒水的纱布擦拭，放入超净台（2）冻存管迅速过火开盖，手持无菌尖吸管将其底部的细胞轻轻吹打起来，转移至刻度离心管中，用过的尖吸管插回原试管中（3）培养瓶盖子打开过火，用另一尖吸管往离心管中加入培养液，拧上盖子，过火（4）1000r/min离心5min（5）离心管管口过火，拧开，过火，液体倒入废液缸，再过火，加入适度含20%的FBS的DMEM新鲜培养液，轻轻吹打离心管底部的细胞，随后将其转移至培养瓶中（6）观察细胞状态，放入5%CO2培养箱中培养1。
细胞冻存与复苏 步骤
细胞冻存一、实验用品：二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25%含EDTA 的胰蛋白酶、移液器、枪头、玻璃离心管、冻存管二、实验方法1、配细胞冻存液（培养液+保护剂）：DMEM培养基：胎牛血清：DMSO=7:2:1，配成1ml2、过程（1）对数生长期细胞，弃去旧培养液；（2）PBS洗清2-3次细胞（3）0.25%含EDTA胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，1000r/min 离心5min，弃上清液；（4）加入冻存液，轻轻吹吸均匀（5）按每管1.0ml的量，分装入冻存管，拧紧管盖；（6）在冻存管上做标记，包括细胞代号及冻存日期；（7）分级冷冻：4℃冰箱内30-40min，转入-20℃冰箱60min，放入-80℃冰箱，将冻存管放入-196℃液氮罐中保存。
细胞复苏一、实验用品离心管、培养瓶、尖吸管、无菌试管，胎牛血清，DMEM培养基、大镊子、无菌纱布、二、细胞复苏1、准备工作：（1）将恒温水浴箱中的水温调至37℃（2）离心管、培养瓶，瓶口均过火（3）尖吸管，过火处理后插入无菌试管中（4）配培养液，放入超净台，瓶口过火，盖拧松，待用。
2、复苏和培养：迅速取出冻存管（1）大镊子夹其盖部，在37℃温水中快速摇动，待有残留小冰核时，快速用含有消毒水的纱布擦拭，放入超净台（2）冻存管迅速过火开盖，手持无菌尖吸管将其底部的细胞轻轻吹打起来，转移至刻度离心管中，用过的尖吸管插回原试管中（3）培养瓶盖子打开过火，用另一尖吸管往离心管中加入培养液，拧上盖子，过火（4）1000r/min离心5min（5）离心管管口过火，拧开，过火，液体倒入废液缸，再过火，加入适度含20%的FBS的DMEM新鲜培养液，轻轻吹打离心管底部的细胞，随后将其转移至培养瓶中（6）观察细胞状态，放入5%CO2培养箱中培养。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
背景知识：
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
原理：
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容（操作步骤）：
一、材料
（一）仪器
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱
7. 液氮冰箱
易生物仪器库：/yp/product-list-42.html
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头、直头）
2. 培养瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 废液缸
（三）塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 移液管（10ml）
5. 15ml离心管
6. 冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
3. 记号笔
4. 医用橡皮膏
5. 移液枪
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培养液
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油
易生物试剂库：/yp/product-list-43.html
二、操作步骤
（一）细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；
3. 离心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107 /ml；
5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/
min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二）细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心，1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
三、注意事项
1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。
在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
四、细胞复苏
在细胞复苏过程中，有多次复苏失败，最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复苏成功，现将细胞复苏的操作程序和注意事项总结如下，望能为同行提供些参考。
【材料】
1.常规细胞培养仪器设备、恒温水浴振荡器。
2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）。
【操作程序】
1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。
2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。
3.二甲基亚砜（DMSO)在4度冰箱中冷藏30min，备用。
4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入40度水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。
6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放培养箱中培养。
7.记录复苏日期。
【注意事项】
1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。
此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在1-2min 内使冻存液完全融化。
如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。
3. 离心前须加入少量培养液。
细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。
4. 离心问题：目前主要有两种见解。
一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。
因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。
此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。
另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。
我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无异常。
5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。
所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。