微生物学实验报告——双歧杆菌分离
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌实验操作双歧杆菌（Lactobacillus）是一种常见的革兰氏阳性菌，广泛存在于人体的肠道、口腔、阴道等部位，对人体具有重要的生理功能和健康益处。
在实验室中，通过培养双歧杆菌，我们可以进一步研究它的特性、代谢途径、功能以及应用价值。
以下是一个关于双歧杆菌实验操作的示例，包括菌株的分离、培养、保存和鉴定等步骤。
1.菌株的分离和纯化从人体标本或商业产品中获得含有双歧杆菌的样品，例如：粪便、口腔漱口水、乳制品等。
将样品悬浮于无菌PBS（磷酸盐缓冲溶液）中，并进行10倍序列稀释。
将适量的悬浮液均匀涂布在含有适宜培养温度和营养成分的琼脂平板上。
经过孵育后，从单个菌落中刺取分离得到的单菌株。
2.菌株的培养将分离得到的单菌株接种到含有适宜培养基（如MRS培养基）的液体培养物中。
培养条件包括适宜的温度（通常在30-37℃之间）、PH值和氧气供应等。
静态培养通常在试管中进行，而摇床培养则需提供常规的摇床条件。
3.菌株的保存为了长期保存双歧杆菌菌株，常常采用冷冻保存和干燥保存。
其中，冷冻保存利用甘油或液氮冷冻对菌株进行保藏。
干燥保存是将菌株培养物在适当的保护剂（如蔗糖、蛋白质）的作用下，通过真空或喷雾冻干处理。
冷冻保存要求贮存于低温（-70℃至-80℃）环境中，而干燥保存则可在室温下进行。
4.菌株的鉴定确定菌株是双歧杆菌的一种，需要通过鉴定方法进行确认。
传统的鉴定方法包括菌落形态观察、革兰氏染色、形态学特征、生理和生化试验等。
另外，分子生物学技术也可以用于鉴定双歧杆菌，如PCR扩增特定的双歧杆菌基因片段或测序分析菌株的16SrRNA基因序列。
5.功能研究在鉴定菌株后，可以进一步研究双歧杆菌的功能特性和代谢途径。
例如，可以采用培养基成分和环境参数的调整来研究双歧杆菌的生长条件。
也可以评估双歧杆菌在产生保健益生素、抑制致病菌、增强免疫等方面的功能。
总结：通过以上的实验操作，可以实现对双歧杆菌菌株的分离、培养、保存和鉴定。
食品微生物学检验 双歧杆菌检验
食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验1 范围本标准规定了食品用双歧杆菌（Bifidobacterium）的鉴定及计数方法。
本标准适用于食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。
本标准适用于食品中仅含有单一的双歧杆菌菌种的鉴定；以及食品中仅含有双歧杆菌属的计数，双歧杆菌属可包含一种或多种不同的双歧杆菌菌种。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.3 天平：感量0.1 g。
2.4 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
2.5 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及配套吸头。
2.6 无菌培养皿：直径90 mm。
3 培养基和试剂3.1 双歧杆菌培养基：见附录A.1。
3.2 PYG培养基：见附录A.2。
3.3 甲醇：分析纯。
3.4 三氯甲烷：分析纯。
3.5 冰乙酸：分析纯。
3.6 乳酸：分析纯。
3.7 乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1 mol/L。
3.8 乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1 mol/L。
4 检验程序双歧杆菌的检验程序见图1。
图1 双歧杆菌的检验程序5 操作步骤5.1无菌要求：全部操作均应遵循无菌操作程序。
5.2 食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数5.2.1 鉴定5.2.1.1 接种：半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板。
真空冷冻干燥菌种，先加适量灭菌生理盐水，溶解菌粉，然后接种在双歧杆菌琼脂平板。
平板在36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h±2 h。
5.2.1.2 涂片镜检：双歧杆菌为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢、无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。
双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究
双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究乌云;刘红霞;李洪亮;母智深【摘要】为丰富发酵剂及益生菌菌种资源,从内蒙古阿拉善盟采集7份新生婴儿粪便样品,在传统细菌分离方法的基础上,通过添加莫匹罗星锂盐和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)改良基础培养基,快速有效地分离获得双歧杆菌.结合全自动微生物分析系统和API20A试剂条鉴定菌种.结果共分离获得6株双歧杆菌,其中3株动物双歧杆菌,2株青春双歧杆菌,1株短双歧杆菌.试验验证甘油浓度为70%时冷冻保藏效果最佳.%In order to enrich more types of leavening agents and probiotics resources, faeces collected from sev-en infants(Alashan, Inner Mongolia) were investigated. On the basis of traditional bacterial separation method, Mupirocin lithium salt and X-Gal were added to the basic medium, to separate the bifidobacterium effectively. Automatic microorganism analytical system and API20A reagent strip were applied to identify the bifidobacteri-um. In total, six strains of bifidobacterium were obtained from infacts' faeces, among which three strains were Bifidobacterium lactis, two strains were Bifidobacterium adolescentis, and one strain was Bifidobacterium breve, and the optimum storage condition for the bifidobacterium is 70%glycerol.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)023【总页数】6页(P171-176)【关键词】双歧杆菌;全自动微生物分析系统;API20A试剂条;冷冻保藏【作者】乌云;刘红霞;李洪亮;母智深【作者单位】内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特011500【正文语种】中文双歧杆菌是存在于人体肠道中的益生菌，在长期进化过程中与宿主形成了互惠共存的关系，具有改善肠道健康、增强免疫功能、防治便秘腹泻、缓解乳糖不耐、促进营养物质吸收、降三高和抗肿瘤等多种保健功能[1-4]。
双歧杆菌的分离与鉴定_吴拥军
作者单位:贵州农学院食品科学系 贵阳 550025 中国收稿日期:1997-01-03双歧杆菌的分离与鉴定吴拥军 王嘉福 尹峻峰摘 要 研究了适宜的双歧杆菌分离方法,从婴儿、成人粪便中分离到36株疑似双歧杆菌,经过属和种的系统生化鉴定,确认为青春双歧杆菌(B if idobacterium adoles -centis )20株和长双歧杆菌(Bif idobacterium longum )6株。
关键词 双歧杆菌 分离 鉴定 双歧杆菌是人类肠道正常菌群中一种重要的微生物,它有益于健康的原因被逐渐弄清。
它以生成醋酸为主,同时生成乳酸和少量的甲酸,在肠道中造成低pH 环境,抑制肠道中有害菌和致病菌的生长[1]。
双歧杆菌不能使硝酸盐还原为亚硝酸盐,其代谢产物可抑制肠道中的硝酸盐还原细菌,可消除或显著减少亚硝酸盐致癌物质对人体的危害,并能合成多种维生素,促使酪蛋白消化,调节菌群失调,激活吞噬细胞活性,消除自由基、过氧化脂质及腐败菌产生的吲哚胺、氨、硫化氢有害物质[6]。
双歧杆菌为专性厌氧菌,对营养条件要求很高,对低pH 的抵抗能力极差,活性保持比较困难。
目前文献报道的方法[2][3][6]大多需要较高的实验条件或重复性差。
因此,研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 样品 分离样品采自贵阳地区婴儿、成人的粪便。
1.1.2 培养基分离培养基(%):蛋白胨2.0,酵母浸膏粉0.25,葡萄糖0.5,磷酸氢二钠0.25,氯化钠0.5,硫代乙醇酸钠0.1,L -半胱氨酸0.1,天冬氨酸0.01,重铬酸钾0.2,琼脂 1.5,牛肉汤50ml,肝汤50ml 。
调至p H7.5,0.7×105Pa 灭菌20min,冷至55℃加入5%～6%的无菌兔血或羊血制成培养皿平板。
增殖、纯化培养基:参照 1.2.1(不加兔血或羊血)。
糖发酵培养基(%):氯化钠0.5,蛋白胨 1.0,酵母浸膏0.25,硫代醇酸钠0.1,20%糖溶液 5.0m l,调节pH7.5,1kg /cm 2,30min 。
双歧杆菌的分类鉴定
双歧杆菌的分类鉴定双歧杆菌是一种常见的乳酸细菌，具有很多种类，其分类鉴定过程是微生物学中一个重要的部分。
下面将按照流程分步骤阐述双歧杆菌的分类鉴定。
第一步：样本收集首先，需要从目标样品中收集双歧杆菌。
样品可以来自不同的来源，包括人体肠道、动物肠道、泥土、水样等。
在收集样品时，要严格按照规定的方法进行，避免污染和杂质的干扰。
第二步：预处理样品收集到的样品可能包含大量杂质和其他微生物。
因此，在进行分类鉴定之前，必须对样品进行预处理。
处理过程中，需要对样品进行消毒、滤液、大肠杆菌的去除等。
只有经过预处理后的样品才能进行后续的分类鉴定工作。
第三步：菌落分离通过培养，将目标微生物分离出单个菌落。
在分离时要保证菌落的纯度，尽可能地去除其他细菌的干扰。
为了提高鉴定的准确性，建议在分离时同时留取多个单克隆，每一个都应该经过相同的操作来验证。
第四步：生理生化特性判定生理生化特性是鉴定双歧杆菌的关键部分。
常见的生理生化特性包括菌种的形态特征、代谢途径、对培养基的需求等。
对菌落气味、颜色和形态等方面进行观察，测量它们的生长特性。
这一步是识别双歧杆菌是否出现新物种的关键所在。
第五步：分子生物学检测为了提高鉴定的准确性，建议在第四步生理生化特性判定后进行分子生物学检测。
这包括测序、PCR等操作。
通过这些操作可进一步鉴定目标细菌的种类、品种。
在这一步中借助了现代的科研技术，为双歧杆菌的分类鉴定提供了非常有力的支持和助力。
综上所述，双歧杆菌的分类鉴定涉及许多步骤，包括样品的收集和预处理、分离菌落、生理生化特性分析和分子生物学检测等。
这一过程需要技术经验和实验操作配合，具有较高的技术难度和风险性。
只有通过严格流程的操作和准确安排，才能确保双歧杆菌的分类鉴定具有科学性、合法性和完整性。
双歧杆菌的分离与培养_秦玲玲
B 3种碳源质量比
1︰1︰1 1︰1︰2 1︰2︰1 2︰1︰1
C 酵母粉质量分数/%
0.3 0.5 0.7 0.9
注：4种氮源比例为：m（大豆蛋白胨）︰m（胰蛋白胨）︰m（酪蛋白水解物）︰m（牛肉浸膏）； 3种碳源比例为：m（葡萄糖）︰m（异麦芽糖）︰m（乳糖）。
2 结果
2.1 菌落与菌体形态特征 含有双歧杆菌的酸奶制品，经过系列稀释、涂布、分离纯
固定维生素、矿物质、L-半胱氨酸、吐温-80的用量，采用正交实验设计(L16(43))优化氮源（A）、碳源 （B）和酵母浸出粉（C）的用量，因素水平见表1。
表1 基础培养基优化正交实验因素水平表(L16(43))
水平
1 2 3 4
A 4种氮源质量比
1︰1︰1︰2 1︰1︰2︰1 1︰2︰1︰1 2︰1︰1︰1
双歧杆菌只生长在接种的穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性。
2.4 生长曲线的绘制
单一菌株的生长曲线如图 5 所示。
由图 5 可知，12 h 之前菌体数量大量增长，12 h 时达到对数生长期，随后菌体数量基本保持不变。 OD 值虽然不能直接准确地反映活菌数，但是可以大 致反映菌液中菌体的多少、菌液的浓度。OD 值越大 表明菌液中菌体含量越多。 2.5 培养基的优化
1︰1︰1
0.5
1.892
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌的分离与鉴定一、实验背景双歧杆菌( Bifidobacterium) 系1899 年巴斯德研究院的Tissier首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来[1]。
双歧杆菌是人体肠道内重要的益生菌之一，还具有抗肿瘤、抗衰老、营养等作用。
双歧杆菌为专性厌氧菌，对营养条件要求苛刻，活性保持相对比较困难。
因此，研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
为了丰富双歧杆菌菌种资源及开发双杆菌产品，本实验主要是了进行双歧杆菌分离、纯化、生化鉴定以及PCR检测，进行对双歧杆菌的分离与鉴定。
二、实验步骤（一）材料1、分离源母乳喂养的健康婴儿粪便2、培养基和试剂TPY培养基、生理盐水、革兰染料（结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红液）、厌氧袋（硼氢化钾、柠檬酸、碳酸氢钠）、生化鉴定试剂管（F6PPK 试验、乳糖、葡萄糖、硫化氢、纤维二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸盐、木糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、阿拉伯糖、过氧化氢、联苯胺）、双蒸水、TaKaRa Taq、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、16sRNA 90916 F、16sRNA 90916 R、3、设备PCR仪、紫外分光光度仪、凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱、厌氧罐、无菌操作台、冰箱、显微镜、接种环等微生物实验室所需的常规设备。
（二）实验内容1、样品的采集与处理（1）用灭菌棉签取母乳喂养的健康婴儿的粪便约l g，放入装有9ml生理盐水的无菌试管中，充分振荡摇匀，做成1∶10 的均匀稀释液。
另取1 mL 灭菌的移液管吸取1∶10 的稀释液注入到灭过菌的含有9 mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，做成1∶100 的均匀稀释液。
按上述操作顺序，依次做成1×10- 3～1×10- 7 梯度的均匀稀释液。
（2）分别取1×10- 1~1×10- 7 梯度的均匀稀释液在TPY培养基平板上进行划线分离（预实验），37℃厌氧培养24~48h观察哪几个梯度的双歧杆菌分离的比较好，然后进行试验。
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌的分离与鉴定一、实验背景双歧杆菌( Bifidobacterium) 系1899 年巴斯德研究院的Tissier首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来[1]。
双歧杆菌是人体肠道内重要的益生菌之一，还具有抗肿瘤、抗衰老、营养等作用。
双歧杆菌为专性厌氧菌，对营养条件要求苛刻，活性保持相对比较困难。
因此，研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。
为了丰富双歧杆菌菌种资源及开发双杆菌产品，本实验主要是了进行双歧杆菌分离、纯化、生化鉴定以及PCR检测，进行对双歧杆菌的分离与鉴定。
二、实验步骤（一）材料1、分离源母乳喂养的健康婴儿粪便2、培养基和试剂TPY培养基、生理盐水、革兰染料（结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红液）、厌氧袋（硼氢化钾、柠檬酸、碳酸氢钠）、生化鉴定试剂管（F6PPK 试验、乳糖、葡萄糖、硫化氢、纤维二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸盐、木糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、阿拉伯糖、过氧化氢、联苯胺）、双蒸水、TaKaRa Taq、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、16sRNA 90916 F、16sRNA 90916 R、3、设备PCR仪、紫外分光光度仪、凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱、厌氧罐、无菌操作台、冰箱、显微镜、接种环等微生物实验室所需的常规设备。
（二）实验内容1、样品的采集与处理（1）用灭菌棉签取母乳喂养的健康婴儿的粪便约l g，放入装有9ml生理盐水的无菌试管中，充分振荡摇匀，做成1∶10 的均匀稀释液。
另取1 mL 灭菌的移液管吸取1∶10 的稀释液注入到灭过菌的含有9 mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，做成1∶100 的均匀稀释液。
按上述操作顺序，依次做成1×10- 3～1×10- 7 梯度的均匀稀释液。
（2）分别取1×10- 1~1×10- 7 梯度的均匀稀释液在TPY培养基平板上进行划线分离（预实验），37℃厌氧培养24~48h观察哪几个梯度的双歧杆菌分离的比较好，然后进行试验。
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微生物学实验报告乳酸菌分离纯化——双歧杆菌的分离纯化2012/6/5实验目的：从酸奶等富含乳酸菌的物质中分离到具有活性的双歧杆菌并进行初步鉴定。
实验原理：双歧杆菌是动物体肠道内的正常优势生理细菌，革兰氏阳性，无芽孢，没有运动能力，最适生长温度37℃~41℃，专性厌氧。
双歧杆菌的细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。
单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。
双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(7)。
因为双歧杆菌是严格厌氧细菌，所以双歧杆菌的培养条件必须无氧，且培养基要具有低氧化还原电势。
培养双歧杆菌最常用的方法是亨盖特厌氧滚管法(1, 5, 7)，此外还有厌氧箱法，厌氧袋法和厌氧罐法等。
亨盖特厌氧滚管法是亨盖特（Hungate）于1950年发展起来的一套严格厌氧微生物的培养技术，主要原理是利用铜柱氧化除氧的滚管分离纯化法。
亨盖特厌氧滚管法的优点是可以实时检查培养物，无氧效果好且花费不高，但需要专门的仪器和技术性很强的操作。
本实验采用的简易厌氧罐法是一种操作简单且成本很低的方法，主要原理是利用焦性没食子酸除去厌氧罐内的氧气。
该方法的缺点是焦性没食子酸与NaOH反应过程中会产生一定量的NO，可能不利于细菌的生长；此外，过量的NaOH 会将厌氧罐中的CO2一起除掉，而CO2对多数厌氧菌的生长有促进作用。
另外，在同一个培养皿上接种好氧细菌（如大肠杆菌和枯草杆菌）能加强除氧的效果。
本实验所用的培养基参考了NPNL培养基(6)和BS培养基的配方，其中鱼粉、牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨的作用是提供氮源、维生素和生长因子，葡萄糖和乳糖为乳酸菌发酵提供糖类底物，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为酸碱缓冲剂，硫酸亚铁、硫酸锰为乳酸菌提供生长因子，氯化钠维持均衡的渗透压。
如果在培养基中加入一定浓度的抗生素，比如硫酸卡那霉素（75μg/ml）、硫酸新霉素（30-200μg/ml）、硫酸巴龙霉素（20-200μg/ml）、萘啶酮酸（15或80μg/ml）、氧化锂（3mg/ml）、丙酸钠（10或15g/L）、山梨酸（0.4g/L）等，培养基就成为双歧杆菌的选择性培养基(7)。
实验材料：蒙牛冠益乳（含bb-12双歧杆菌），伊利酸牛奶（ABLS益生菌），佳宝、光明原味酸牛奶，双歧杆菌乳酸菌三联活菌片（含长型双歧杆菌Bifidobacterium longum），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）实验方法：1.培养基双歧杆菌琼脂培养基【蛋白胨（鱼粉）10.0g，牛肝浸粉5.0g，牛肉膏3.0g，酵母浸粉5.0g，胰蛋白胨8.0g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾 1.0g，葡萄糖10.0g，乳糖3.0g，L-半胱氨酸0.5g，琼脂15g，吐温80 1g，溶液A （FeSO4·7H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 4.0g，MnSO4·4H2O 0.135g，NaCl 0.2g 于100ml蒸馏水定容）10ml，蒸馏水定容至1L】枯草芽孢杆菌LB琼脂培养基【胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，Nacl10g/L，琼脂粉15g/L】2.简易厌氧罐法将双歧杆菌琼脂培养基倒入培养皿中，待培养基冷却后，先用接种环取LB琼脂培养基上生长的枯草芽孢杆菌菌落接种在培养皿一侧，再于另一侧划线接种酸奶或三联活菌片的稀释液，按照每L容积1.0g 焦性没食子酸、10%NaOH溶液10ml加入厌氧罐后，立即以凡士林和胶带密封，置于37℃恒温培养2-3天。
图1. 实验中使用的简易厌氧罐实验结果：以双歧杆菌乳酸菌三联活菌片为菌源，在厌氧罐中经过72h 恒温培养得到了以双歧杆菌为主的单菌落。
因为双歧杆菌暴露在空气中短时间内即大量死亡，划线分离方法会使双歧杆菌活性大大降低，加之时间所限（由于需要摸索实验条件，寻找合适菌源，首次成功得到双歧杆菌单菌落已是第三周），最终没有获得双歧杆菌的纯培养和相关生化指标。
但仅从形态学特征(3)可以判断，该实验方法已经分离得到双歧杆菌（Bifidoubacterium sp.）。
所以本实验仅就双歧杆菌的形态学特征进行观察总结。
图2. 培养72h 后的双歧杆菌分离培养基。
左侧接种枯草杆菌，几乎没有形成明显的菌落；右侧接种三联活菌片稀释液，有大小不等乳白色半透明光滑圆形菌落，偏小的菌落多为双歧杆菌菌落。
图3. 双歧杆菌革兰氏染色照片（1000×），显示双歧杆菌具有多种特殊形态。
此外，视野中有细杆形杂菌。
图4. 局部放大后观察到的双歧杆菌形态。
可以看到双歧杆菌具有分支形态和末端膨大形态，分支长度和角度因个体而异，没有明显的一致性，末端膨大处最大直径约1μm。
图（a）中有“f”形个体，实为细胞中部向两侧分支的细胞。
图（b）下方的细胞分支较多，其中有三个为主要分支，较长的两个分支长度约5μm，在较长的分支上还有小分支。
图片上方有末端分支的细胞。
图（c）和图（d）显示了双歧杆菌典型的“Y”形分支。
一般具有这种典型形态的双歧杆菌细胞长度约3-4μm，分支长度在1μm左右。
实验反思：1. 成功培养双歧杆菌的关键条件之一是要保证菌源中含有足够数量的活双歧杆菌。
实验最初使用的菌源是市售各种品牌的酸牛奶，但是在对酸奶稀释液进行镜检时，所有的产品都没有看到疑似有双歧杆菌特征的细胞。
以蒙牛冠益乳为例，虽然奶盒标签上标明内含双歧杆菌BB-12的浓度不少于1×109CFU/ml，但镜检中发现链球菌的数量占绝大比例，此外还有少量长杆菌。
以蒙牛冠益乳为菌源，分别用涂布平板法和倾注平板法在厌氧罐中培养48h后，菌落经镜检鉴定几乎全部为链球菌菌落，没有发现双歧杆菌菌落，证明所用菌源中链球菌是绝对优势菌群。
以其它品牌酸牛奶为菌源也有类似情况，虽然链球菌和杆菌的比例不同，但都没有发现双歧杆菌。
考虑到当今技术条件下双歧杆菌的发酵培养并不十分困难，任何一家有资质的乳品企业都有能力保证出厂酸奶中双歧杆菌的添加量，而且像蒙牛冠益乳这样具有世界影响力（第十五届世界食品科技大会“全球食品工业奖”）的酸奶品牌应该没有质量问题，因此可以推测，市售酸奶中分离不到双歧杆菌的主要原因是酸奶出厂后在运输和销售途径中保存不当（主要是保存温度偏高），使绝大部分双歧杆菌失去活性。
所以，若要从添加双歧杆菌的酸奶中分离双歧杆菌，需要使用全程低温保鲜的新鲜酸奶。
相对于酸奶，药店中出售的双歧杆菌活菌片的生产和保存更加严格，而且药片的胶囊化也利于厌氧菌的保藏。
以本实验使用的双歧杆菌乳酸菌三联活菌片（Live Combined Bifidoubacterium and Lactobacillus Tablets）为例,药片中含有三种常见乳酸菌：长型双歧杆菌（1×107CFU/g），保加利亚乳杆菌（1×106CFU/g），嗜热链球菌（1×106CFU/g）。
经厌氧罐法涂布平板37℃恒温培养72h后，分离得到的菌落主要是保加利亚乳杆菌和双歧杆菌菌落（其中保加利亚乳杆菌菌落较多）。
所以用三联活菌药片作为菌源分离双歧杆菌是实际上可行的。
2. 成功培养双歧杆菌的另一个关键条件是要保证培养过程绝对无氧。
首先是接种时操作要尽量迅速，本实验的接种操作从药片溶解（药片溶解在无菌水中时不能剧烈震荡，以免双歧杆菌与大量氧气接触）到密封除氧不超过5min。
在加入除氧剂并以凡士林密封后，最好以胶带粘封厌氧罐边缘，保证培养过程中皿盖不会因振动滑移而破坏厌氧环境。
除氧剂的用量可以稍过量，以弥补封罐前的损失。
实验证明，焦性没食子酸除氧的效率很高，如果微微打开皿盖边缘，立即将划燃的火柴凑近皿盖边缘，火柴会在瞬间熄灭。
3. 实验在分离双歧杆菌的过程中先后分离到了大量嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的单菌落，虽然这两种细菌不是目的菌，但分别对两种菌的菌落和细胞形态的观察也发现了一些有趣的现象，一并整理在此报告中。
a b c d图5. 厌氧条件下从蒙牛冠益乳中分离得到的嗜热链球菌在琼脂培养基表面生长的形态。
可以看到链球菌单个球形细胞之间首尾相连形成弯曲折叠的长链。
该图片为直接观察培养基表面获得。
图6. 从双歧杆菌乳酸菌三联活菌片中分离到的保加利亚乳杆菌番红染色。
从图中可以看出，保加利亚乳杆菌为典型的长杆菌，个体间直径相差不大，都不足1μm，但长度相差较大，单个菌体最长可达30-40μm。
图7. 对保加利亚乳杆菌的革兰氏染色可以观察到个别菌体内有深染的颗粒状物质。
具有颗粒物的菌体比例和颗粒物的密度因菌落的不同而有明显差异。
猜测颗粒物的形成与菌体的代谢产物有关。
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