防腐挑战性实验方法

防腐挑战性实验规程

一、目的

本方法及标准摘自欧盟标准BP2002 XVIC EFFICAIY OF ANTIMICROBIAL PRESERVATION,测定化妆品抵抗微生物的能力。

二、材料及工具

1.待检样品600g（实际操作中常用300g以节约样品）；

2.电子秤1台、不锈钢勺子、200ml烧杯、10ml试管、150ml三角烧瓶、酒精灯1盏、1ml移液枪（100～1000μL）、1ml移液枪枪尖、灭菌培养皿、0.85%灭菌生理盐水；

3.适量普通营养琼脂培养基、虎红培养基；

4.金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠艾希氏菌、黑曲霉、白色念珠霉菌的菌种各1支，其菌种传代次数<5代。

三、步骤

1.标准悬液的配制

1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3倍稀释。

2.细菌菌悬液的配制

将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×108cfu/ml）相同为止；

此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。

3.霉菌菌悬液的配制

将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；

用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们

所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。

4.分别称取待测样品100g，倒入5个烧杯中，分别标记大、金、绿、黑、白及日期。

5.分别在5个烧杯中，对应加入1ml浓度为1×107～1×108cfu/ml的细菌菌悬液及霉菌菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5±2.5℃的培养箱中培养，霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养。

6.水溶性样品

10g加入90ml无菌生理盐水，稀释后取1ml样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml样液加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。

7.油溶性样品

取10g样品，加入10ml无菌吐温-80和10ml无菌白矿油，再加70ml无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀；

吸取1ml已稀释的样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。

8.培养

细菌放在32.5±2.5℃的培养箱中培养48h；

霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养5天。

9.分别在2天、7天、14天、28天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。

10.菌落计数的标准方法

①先选取平均菌落数在30～300之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选取平均菌落数在5～50之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；

②有两个稀释度在30～300之间，求比值。若比值≤2，报告平均数；若比值>2，以其中较小的稀释度计算细菌总数；

③所有稀释度都大于300，以稀释度最高的平均菌落数计算；

④所有稀释度都小于30，以稀释度最低的平均菌落数计算；

⑤所有稀释度均在30～300之外，其中一个大于300，而相邻的加一稀释度小于30，则以最接近30或300的平均菌落数计算；

⑥若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；

⑦若片状菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均匀，则可将此平皿菌落计数后×2，以报告全皿菌落数。

例表1：

四、注意事项

1.由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入培养皿后，应尽快倒入熔化并冷却至45℃左右培养基，立即摇匀；

2.实验结束后，所有与菌接触之物品，必须在121℃灭菌45min后处理，人员用75%酒精消毒；

3.如遇停电，应将培养箱中培养皿放入冰箱，待情况正常后再放入培养箱，如出现上述情况没有及时处理则重新实验。

五、结果标准

将活的细菌和活的霉菌计数后取lg，检验标准如下：

注：①这里是以10为底的lg，而非以自然对数e=2.718为底的log；

② lg(ab)=lg(a)+lg(b)

lg (a/b)=lg(a)-lg(b) lg(a-b)≠lg(a)-lg(b)

lg(a b)=b *lg(a)

六、实例

1.合格的实验记录

2.不合格的实验记录

七、实验需求设备、器具清单

注：此配置为常规性配置，其他缺少之器具可于后期购置。