野生型p53调控结肠癌细胞代谢转换的研究
免疫营养素应用于肿瘤治疗的研究进展
·专家述评· 免疫营养素应用于肿瘤治疗的研究进展中国医学科学院北京协和医院 柳欣欣，于健春在营养配方中添加特异的免疫营养素，不仅能预防和纠正患者的营养不良，而且还能刺激免疫细胞，增强应答功能，维持正常适度的免疫反应，调控细胞因子的产生和释放，减轻有害或过度的炎性反应，维护肠黏膜屏障功能。
近年来，随着免疫营养研究的不断深入，其在肿瘤综合治疗中所发挥着的重要作用已不断被人们所认识。
鉴于体外试验对细胞系及荷瘤小鼠作用机制的不同，我们对相应的文献证据进行了分类，希望能对免疫营养素的作用机制作相应的探讨。
以下重点讨论谷氨酰胺（Gln）、多不饱和脂肪酸（PUFA）和精氨酸（Arg）对肿瘤本身和化疗的作用。
1谷氨酰胺1.1Gln抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭性：目前，尚无证据表明Gln本身具有明确抗肿瘤活性，但Gln 与肿瘤关系密切。
1.1.1细胞系实验：Gln是各种细胞生长所必需的物质，肿瘤细胞也不例外。
许多实验证实，Gln可促进肿瘤细胞生长。
早在1955年，Eagle[1]在培养的Hela细胞（一种恶性子宫颈细胞）Gln浓度＞1mmol/L 的环境中增殖较快。
人肝癌细胞SMMC-7721体外培养24h后，培养液中的Gln水平显著下降[2]。
Fu等[3]研究了Gln对两种前列腺非依赖型前列腺癌细胞侵袭能力的影响，发现无Gln的培养环境可抑制DU145细胞的侵袭，但却对PC3细胞无影响。
1.1.2荷瘤鼠实验：肿瘤生长消耗大量的Gln，并且Gln利用率与肿瘤生长平行[4-5]。
特别是对于快速生长的肿瘤细胞，由于肿瘤对Gln的大量消耗，有人把肿瘤描述成“氮陷阱”[6]。
Gln是包括肿瘤细胞在内的各种细胞生长和生命活动所必需的物质。
许多实验证实，Gln可促进肿瘤细胞的生长。
那么，外源性补充Gln是否会促进体内肿瘤细胞的生长是一个关注的焦点。
Klimberg等[7]在实验中发现，大鼠进食含Gln 的饮食后，肌肉Gln含量提高60%，但体内肿瘤的重量、DNA含量、Gln酶均相似，说明补充Gln并未促进肿瘤细胞生长以及肿瘤细胞对Gln的利用。
肿瘤细胞能量代谢特点及其研究进展
肿瘤细胞能量代谢特点及其研究进展李其响;张配;刘浩【摘要】肿瘤细胞能量代谢依赖于糖酵解和氧化磷酸化,肿瘤细胞由于其生长迅速,常常出现葡萄糖等营养物质摄取增多、糖酵解增加等现象.近年来,针对肿瘤细胞能量代谢的研究受到了广泛的关注.该文总结了肿瘤细胞能量代谢过程中所需要的营养物质、调控网络以及治疗靶点,为后续研究和临床治疗提供重要参考.%Tumor cell energy metabolism is dependent on glycolysis and oxidative phosphorylation.Tumor cells,because of its rapid growth,often show increased intake of glucose and other nutrients,increased glycolysis and so on.In recent years,the study on energy metabolism of tumor cells has received extensive attention.This paper summarizes the required nutrients,regulatory networks and therapeutic targets in the energy metabolism of tumor cells,and provides important reference for future research and clinical treatment.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2017(033)011【总页数】4页(P1499-1502)【关键词】肿瘤细胞;能量代谢;营养物质;调控网络;治疗靶点;瓦博格效应【作者】李其响;张配;刘浩【作者单位】蚌埠医学院药学院,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院药学院,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院药学院,安徽蚌埠233030【正文语种】中文【中图分类】R-05;R329.24;R333.6;R343;R730.25能量代谢是指有机体在物质代谢过程中能量的产生、释放、转换及利用的过程。
重组P53的研究与开发
P53单克隆抗体的制备 及其免疫活性分析
1.P53单克隆抗体的制备和纯化
采用经典的杂交瘤技术，筛选可稳定分泌 抗P53单克隆抗体的杂交瘤细胞。将细胞分 别注射到小鼠腹腔内，收集产生的腹水，将 腹水稀释，离心，取上清液过滤。处理后的 样品与等体积结合缓冲液混合，层析柱4℃条 件下反复上样5次。以结合缓冲液洗脱杂蛋白， 用甘氨酸洗脱液洗脱抗体，收集含有抗体的 馏分，并迅速用Tris-HCl将pH值调至约7.5， 置于结合缓冲液中4℃透析。用十二烷基磺酸 钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析抗体纯度，再测 定蛋白浓度。
今又生治疗恶性肿瘤有以下优点：
总结临床应用结果，今又生治疗恶性肿 瘤有以下优点： 1）基本生物学机制非常明确 2) 多途经多方面抗肿瘤作用 3) 广谱的抗肿瘤作用，多数恶性肿瘤有 p53基因突变
研究现状
重组人p53腺病毒(rAd-p53)是一种广谱 抗癌制品。自1995年在美国批准进入临床试 验，目前已有51项各种临床试验方案在世界 各国实施，涉及到多种类型的肿瘤治疗。所 有临床试验用rAd-p53制品均来源于美国和 中国的三家公司即Introgen、ScheringPlough（先灵葆雅 ）和深圳市赛百诺基因技 术有限公司（SiBiono），这也是目前世界上 具有重组腺病毒制品规模化生产能力的三大 产业化基地。
研究历史
P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性 最高的基因。在短短的十多年里，人们对 P53基因的认识经历了癌蛋白抗原，癌基因 到抑癌基因的三个认识转变，现已认识到， 引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是P53基 因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可 以消除正常P53的功能，而野生型P53基因是 一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要 作用。
p73 基因作为p53 家族成员,由于它和 p53 基因具有高度的序列同源性,结构和功能 的相似性,通常被认为是一个新的侯选抑癌基 因,但它与P53 又存在不同的地方:p73 的突 变率很低,遗传基因表达通常为单基因表达,在 DNA 损伤时一般不应答,在细胞生长发育过 程中,诱导p53 不能诱导的ADA靶基因等。通 过对p73 结构、功能以及诱导、活化调控机 制的进一步研究,可对肿瘤发生发展的机制有 新的了解,并且可以为今后肿瘤基因治疗提供 新的思路。
腺病毒介导的野生型p53基因治疗肿瘤研究进展
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８ ・ ６
第２ ０卷
第 １ 期
医 学 研 究 生 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｄ ｃ ｌＰ ｓｇ ａ ｕ ｔｓ ｏ ｒ ａ ｆＭｅ ｉａ ｏ ｔｒ ｄ ａｅ
Ｖｏ ． Ｏ Ｎｏ １ １２ ．
２０ ０ ７年 １月
Ｊｎ ２ ０ ａ．０７
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野生型p53基因对肠癌细胞增殖及凋亡的影响
［ ４］贡小英 ， 国威 ， 荣 安贵生 ， 绎掌侧人路治疗桡骨远端不稳定骨 等．
折 疗 效 分 析 ［ ］ 中华 骨科 杂 志 ，０ ５ ２ （ ）：０５ ． Ｊ． ２ ０ ，５ １ ５ －增 殖 ５ 及 凋 亡 的影 响
张方 圆 ， 张 宏 ， 春 生 陈 （ 国医科 大学 附属 盛 京 医院 ， 阳 １ ０ １ ） 中 沈 １８ ７
恶化 均 与 细 胞 内 某 些 物 质 变 化 有 着 密 切 联 系 。
细胞 周期 调节 因子 失灵 及 细胞 凋亡 或程 序性 死 亡失 控是 肠癌 发生 的 主要 因素之 一 。我 们将 具有 抑 癌活 性 的野生 型 ｐ ３基 因导 入 到肠 癌 细胞 系 Ｓ ８ ５ Ｗ４ ０中 ， 使其 表达 正常 ｐ ３蛋 白， 示 其 对 细 胞 周 期 调 控 及 ５ 揭 抑制 细胞 增殖 、 导凋 亡 的机制 ， 以后 基 因治疗 奠 诱 为
ｃ ｔ ｎ ｏ ｓｐ ｎ ｆ ａｉ ｎ ｗｉ ｌ ｔ ｘ ｔｏ ｏ ｎ ｒ ・ ｒｉｕ ａ ｉｔ ｌｒ ・ ｕ ａ ｅ ｕ ｉ ｘ ｔ ｔ ｐ ａｅ ｆ ａ ｉｎ ｆｒ ｉ ｔ － ｔｃ ｌ ｒｄ ｓａ ａ－ ｉ ｏ ｈ ｉ ａａ
ＨａｄＳｒ ｎ ｕｇＡｍ， ０ ８，３ ５ ：９ －０ ． ２ ０ ３ （ ）６ １ ０ ７
中 图分 类 号 ：７ ５ ３ Ｒ ３ ． 文献 标 志 码 ： Ｂ
文 章 编 号 ：０２２ ６ ２ １ ）８０ ７ － １０ — Ｘ（０ ０ ４ －０ ３ ２ ６ ０
肠癌 作 为一 种 常 见 的 恶性 肿 瘤 ， 发 生 、 展 、 其 发
２天待 细胞 长成 单 层 即可 进 行 转 染 。将 无 血 清 Ｒ — Ｐ ＭＩ ６ ０培养 基 ＋ｌ ｌ 质 体 ２ ０ ４ １ ０ 脂 ０ ０混 匀 为 Ａ 液 ， 室 温 ５ ｍ ｎ 无 血 清 Ｒ ＭＩ１ ４ ｉ； Ｐ ６ ０培 养 基 ＋ ｇ质 粒 ４
p53基因调控研究的新进展 (1)
百度文库- 让每个人平等地提升自我！p53基因调控研究的新进展朱荻绮陈敏审阅李稻上海第二医科大学病理生理学教研室200025摘要p53作为抑癌基因，其激活与调控机制的研究是近年的热点。
DNA受损等应激信号可活化p53，诱导细胞周期调控和细胞凋亡为主的多种细胞学反应，而MDM2、YY1等作为p53的负反馈调控因子，控制p53过度活化。
近来发现，p53可上调p21基因表达产物p21WAF1蛋白使细胞周期阻滞于G1期；同时，激活GADD45参与对G2的阻滞；亦可通过caspasee介导的ERK2/MAPK的细胞裂解通路抑制细胞增殖。
另外，p53通过BH3-only蛋白激活Bax、正调控puma和noxa、抑制Bcl-2等多种途径共同诱导细胞凋亡，p53家族成员p63和p73也参与p53诱导的凋亡过程。
关键词细胞周期；凋亡；p53；p21；Bcl-2；MDM2p53 属于抑癌基因家族，位于染色体17p13.1，基因全长16~20kb，含11个外显子，2~11外显子编码分子量为53kD的p53核内磷酸化蛋白。
正常野生型p53活化后可诱导多种细胞生物学行为，如调控细胞周期、诱导细胞凋亡、细胞分化、细胞衰老、DNA修复，以及抑制血管生成等。
在细胞周期中，p53蛋白通过阻止G1期细胞进入S 期，使受损的DNA或染色体有时间得以修复；若DNA或染色体损伤过于严重时，p53能触发凋亡机制清除受损的细胞。
近来，p53研究的热点集中在自身表达、细胞周期调控和诱导细胞凋亡。
1．p53基因调控p53基因受多种信号因子的调控，其中较为重要的负反馈调控因子是MDM2。
MDM2是一种对p53特效的E3泛素连接酶，为原癌基因mdm2的基因产物。
mdm2是一种进化的保守基因，具有转录因子功能，其编码的基因产物能与p53 结合，使p53介导的反式激活、抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用受抑制，解除细胞G1期的阻滞并重新进入细胞周期[1]。
研究表明，尽管p53蛋白只在核内发挥作用，但其从核内向外移出可能依赖MDM2途径的调控。
p53在胃肠肿瘤的表达及预后意义的研究
［ ｅ ｒｓ ｐ ３ Ｇ ｓｒｉｔｓｉａ ｕ ｒ ；Ｅ ｐｅｓｏ Ｋ ｙ Ｗｏｄ ］ ５ ａｔｏｎｅｔｎ ｌｔｍｏｓ ｘ ｒｓｉｎ‘Ｔ ｅ ｐｏ ｎ ｓｉ ｉｎ ｆｃｎ ｅ ｌ ｈ ｒｇ ｏｔｃ ｓｇ ｉｉａ ｃ
肿 瘤 抑 制 基 因的 研 究 已经 成 为 继 癌 基 因之 后 ， 瘤 遗 传 学 、 肿
期， 以使细胞有足够的时间修复损伤 ， 恢复正常状态。 若不能修复， 野
生 型ｐ ３ ５还能 启动 细胞 的凋亡 过程 从而 引发细 胞的程 序性 死亡 ， 阻止 具 有癌 变倾 向 的突 变细 胞 产生 。 突变 型 ｐ ３ 因 会导 致肿 瘤的 发 而 ５基
［ ｂｔａｔ ｐ ３ ｐ ｏｅｎ ｉ ｅｌｃｅ ｈ ｍ ｏｔｎ ｎ ｅ ｆｃｌ ｐｏｉｅａｉｎ ａ ｔ ｉｙ ｗｉｈ ｇｓｒｉｔｓｉａ ｕ ｏｓｄ ｖ ｌｐ ｅ ｔａｅ Ａ ｓｒｃ］ ５ ｒｔｉ ｓｒｆｅｔｄ ｔｅ ｉｐ ｒａ ｔｉｄ ｘ ｏ ｅｌ ｒｌ ｒｔ ｃｉ ｔ ， ｔ ａｔｏｎｅｔｎ ｌｔ ｍ ｒ ｅ ｅｏ ｍ ｎ ｒ ｆ ｏ ｖ
论
著
ＣＩ ＯＥ Ｎ ＥＩ Ｌ ＲＡ ＭＮ ■ Ｈ ＡＦＲＩ Ｄ Ａ Ｅ Ｅ！瞳 Ｎ Ｇ Ｍ Ｃ ＴＱＴ ： Ｑ ２ Ｔ 】
ｐ５ ３在 胃肠 肿 瘤 的表 达 及 预 后 意 义 的研 究
韩 松 云
（ 苏省 东 海县 人 民 医院病 理 科 江苏 东 海 ２ ２ ０ ） 江 ２ ３ ０ 【 要】 ｐ ３ 白是 反映 细胞增 殖 活性 的重要 指 标 ， 胃肠肿瘤 的 发生 发展 密切 相关 。 摘 ５蛋 与 结合 病理 形态 学观察 ， 曩ｐ ３ 白的表达 ， 检 ｌ５蛋 能 更客观 ， 准确地 判断 胃肠 肿瘤 的恶性 程度和 预 后 。 胃肠肿 瘤的诊 断和 预 后有较 高的 临床 实 用价 值 。 对 【 关键 词】 ｐ３ 胃腑肿 瘤 表达 预后 意义 ５ 【 图分 类 号】 Ｒ ３ ． 中 ７０ ２ 【 献 标 识 码 】Ａ 文 【 章编 号】 ｌ ７ — ７ ２２ Ｏ）４ｂ一 ０ ３ Ｏ 文 ６ ４ ０ ４ （０ ９０ （） ０ ０ 一 ２
p53基因在肿瘤放疗中的研究进展
ｔｙ ｂｙ Ｍｏｃｋｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ，ａｆｆｅｃｔｉｎｇ
ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅ
ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｒ ｍｕｔａｔｅｄ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｗｏｕｌｄ ｗｅａｋｅｎ ｏｒ ｅｖｅｎ ｂｌｏｃｋ ｔｈｅ ＤＮＡ出ｍｍｇｅ ｂｙ ｔ｝Ｉｅ ｒａｙ，ｔｈｕｓ，ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ
促进肿瘤细胞的凋亡，增强了肿瘤细胞对放疗的敏 ２．１ ｐＳ３放射增敏作用的基础研究野生型ｐ５３在
感性［４］。ｐ５３基因除上述功能外，其在机体的衰老、 放射线诱导下引起细胞凋亡，突变型ｐ５３则不会。
新陈代谢及生长发育等生理学功能中也起到重要的 Ｌｏｗｅ等¨们早在十几年前就研究了有关ｐ５３基因的
作用㈣。
ｐ５３基因定位于人染色体１７ｐ１３．１区位，全长１６ 馈调节通路，该通路显示ｐ５３亚型△１１３ｐ５３是ｐ５３
—２０ ｌ【ｂ，有１１个外显子和１０个内含子，编码相对分 的新基因靶点，且这条通路能够对抗ｐ５３的凋亡
子质量约为５３×１０３的磷酸核蛋白，即ｐ５３蛋白。 作用。
ｐ５３蛋白与细胞周期分裂有关，其表达几乎见于各种 ２ ｐ酪增敏作用的研究
总之，ｐ５３基因与肿瘤放射敏感性有密切的关 系。随着分子放射生物学的发展，ｐ５３基因对放射线 的影响及二者的互相作用越来越清楚，给恶性肿瘤 的治疗带来新的希望和方法；同时对正确制订恶性 肿瘤综台治疗方案、预测疗效及评价预后也有重要 的意义。 参考文献
［１］张珊文．中国Ｐ５３基因治疗的现状和前景［Ｊ］．医学研究杂志， ２００８，３７（６）：３－５．
ＤＮＡ阳ｐａｉｒ，Ｃｅｌｔ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ，ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ—ａｐｏｐｔｅｓｉｓ ａｌｅ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ
MDM2、MDMX以及p53在肿瘤中的研究进展
MDM2、MDMX以及p53在肿瘤中的研究进展何田丽;马建华;郭加友;马建新【摘要】肿瘤抑制基因p53在抑制肿瘤生成中起重要作用.作为p53的主要负性调节因子,鼠双微体(MDM)2能够泛素化降解p53蛋白并降低其活性,而p53则与MDM2的P2启动子序列结合,抑制其转录活性,降低其表达,两者相互作用形成负反馈环.MDMX,又称MDM4,其能够抑制p53的转录激活,调节MDM2的E3连接酶活性,且MDM2与MDMX均具有p53非依赖性致瘤作用.因此探究p53-MDM2、MDMX的相互作用及具体的作用机制可为肿瘤治疗提供新的方向.%The tumor suppressor p53 gene plays an important role in tumor formation.Murine double minute (MDM) 2 mediates the degeneration of p53 and decreases the expression of p53 through its E3 ubiquitin ligase activity.And p53 binds to the P2 promoter to inhibit the transcription of MDM2,thus form a negative feedback loop.MDMX inhibits the transcriptional activity ofp53,and it can also regulate the E3 ubiquitin ligase activity of MDM2.Both MDM2 and MDMX have p53independent tumorigeniceffect.Therefore,exploring the interaction between p53-MDM2 and MDMX and its specific mechanisms of action may provide a new direction for tumor therapy.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2017(023)007【总页数】5页(P1338-1341,1345)【关键词】肿瘤;p53;鼠双微体2;鼠双微体X【作者】何田丽;马建华;郭加友;马建新【作者单位】蚌埠医学院附属连云港医院放射治疗科,江苏连云港222000;蚌埠医学院附属连云港医院放射治疗科,江苏连云港222000;连云港市东方医院放射治疗科,江苏连云港222000;连云港市东方医院放射治疗科,江苏连云港222000【正文语种】中文【中图分类】R733肿瘤抑制基因p53在抑制肿瘤生成的过程中起重要作用，其受多种因素的调节。
p53在大肠癌中表达的研究
志 ． ０ ．３４： ４ ５ ６ ２ ５１（） ３ — ３ ． ０ ５
［］ Ｃ ｏ ｅ Ｒ ， ｕ ｎｈ ｒＫ，ｏ ｒ ｅ ， １ ｉ ｕ ｒｐ ｒｔ ｎ ｆｒｇ ｎ ｘ ２ ｒｎ ｒ ＳＧ ｅ ｔｅ Ｆ ｅｔ ｈ Ｔ ｅ ａ． ｓ ｅ ｐｅ ａａ ｏ ｅ ｅ ｅ — ｓ ｔ Ｔ ｓ ｉ ｏ
的表达 情 况 。 果 ：５ 结 ｐ ３在大 肠癌 中的 阳性表 达 率为 ６ ＿ 显著 高于癌 旁组 织 ；５ ３３ ％， ｐ ３与大 肠 癌癌 细胞 分化 程度 有关 。 结 论 ：５ ｐ ３在 大 肠癌 的发生 、 展 中起 重要 作用 。 发
【 关键 词】大肠 癌 ；５ ； 疫 组 织化 学 ；－ ｐ ３免 Ｓ Ｐ法
ｆ 图分类 号】 ７ ５３ ４ 中 Ｒ ３． ＋
【 标 识码】Ｂ 文献
［ 编 号］１ ７ — ７ １２ １ ）８ ｃ 一 ８ — １ 文章 ６ ４ ４ ２ （０ ０ ０ （）０ ２ ０
表 １ ｐ ３表 达 与 大 肠 癌 癌 细 胞 分 化 程 度 的 关 系 ５
大 肠癌 的全 球 发生 率仅 次 于肺 癌 和乳 腺 癌居 第 三位 ． 是 癌 症患 者 的主要 死亡 原 因之 一 。 其 发病 率有 逐 年升 高 的趋 且 势， 因此 大 肠 癌 可能 将 会 成 为 ２ １世 纪 我 国发 病 率 最 高 的 恶 性 肿瘤 之一 ｌ 目前 大肠 癌 的病 因学 尚未完 全研 究清 楚 ， 随 ｌ ｊ 。 但 着 分子 生 物 学 的迅 速 发 展 ， 医学 领 域 中 的应 用 逐 渐 普及 。 在 对 癌基 因和 抑癌 基 因在 癌变 形 成发 展 的作用 越 来越 清 晰。 学 者 们 认 为 ， 基 因 激 活 与 抑 癌 基 因失 活是 大 肠 癌 发 生 的关 癌 键 ， 中抑 癌基 因 ｐ ３与大 肠癌发 生 的密切关 系受到关 注 。 其 ５ 本
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ｃｅｌｌｓ
Ｙａｎ，肌Ｊｕｎｂｏ，Ｇｏｎｇ Ｊｍ印ｉｎｇ，Ｌｉ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｎｇｆｉ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌ—
ｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００３０，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｌｉ Ｘｉａｏｌａｎ．Ｅｍａｉｌ：ｎａｎｃｙ９９９９８＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｒｎ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐ５３ ｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ０５３ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｂｙ Ｆｌｏｗ
０．０５为差异有统计学意义。
结 果
２．细胞葡萄糖摄取实验：细胞接种于２４孔板正常 培养２４ ｈ后，换成不含葡萄糖的ＤＭＥＮ培养基（Ｇｉｂｃｏ 公司）培养４ ｈ后加入１００
荧光。
３．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ：将ＨＣＴｌｌ６细胞以５×１０５个／孔
ｍｍｏＬ／Ｌ
１．野生型ｐ５３抑制结肠癌细胞ＨＣＴｌｌ６葡萄糖摄 取：采用本实验室所保存的ＨＣＴｌｌ６ ｐ５３野生型（ＷＴ） 及缺失型（ＫＯ）细胞系（图１），利用２－ＮＢＤＧ检测试剂 盒检测两种细胞的葡萄糖摄取能力，发现比较于ｐ５３
万方数据
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结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前在 我国的发病率呈不断上升趋势…。ｐ５３基因作为最经 典的肿瘤抑癌基因，参与肿瘤多方面调控。最近研究 结果显示，肿瘤细胞糖代谢的异常改变对促进肿瘤胞 的生长、侵袭和转移具有重要意义，目前作为肿瘤治疗
ｋｎｏｃｋ—ｏｕｔ（ＫＯ）０５３ ＨＣＴｌ １６ ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ａｐｐｅａｒｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ４１ ｐｅｒｃｅｎｔ ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ（ＷＴ）ｐ５３ ＨＣＴｌ １６ ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５）．ｒＩ＇｝ｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ・ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ＡＴＰ）一ｃｉｔｒａｔｅ ｌｙａｓｅ（ＡＣＬＹ），ｇｌｕｃｏｓｅ一６一ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ６ＰＤ）ａｎｄ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎ。
主堡塞墼处型盘查！Ｑ！ｉ生！旦筮≥！鲞筮！塑堡ｂ也』垦翌坠坚：垒！艘壁！！！！：！！！：丝：塑！：！
・１９０５・
・实验研究・
野生型ｐ５３调控结肠癌细胞代谢转换的
研究
刘亮 陈浩余超然
【摘要】
陶德定
冷彦
胡俊波
龚建平
李小兰
目的观察野生型ｐ５３基因在结肠癌细胞系中能量代谢转换中的作用。方法利用
流式细胞学方法检测ｐ５３在结肠癌细胞系ＨＣＴｌ １６中对荧光标记的葡萄糖类似物：２－Ｎ［７－硝基苯－２一 乙二酸，３４羟氨基］一２一脱氧葡萄糖（２－ＮＢＤＧ）摄取的影响，进一步采用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、实时定量聚合 酶链反应（Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ）等方法检测其可能的下游调控关键酶三磷酸腺苷（ＡＴＰ）柠檬酸裂解酶 （ＡＣＬＹ）、糖酵解的关键酶葡糖糖６．磷酸脱氢酶（ｃ６ＰＤ）、乳酸脱氢酶（ＬＤＨＡ）、醛缩酶（ＡＬＤＯＡ）及 Ｍ２型丙酮酸激酶（ＰＫＭ２）的蛋白及转录水平的表达变化。结果 比较于ｐ５３缺失型（ＫＯ）ＨＣＴｌｌ６
方向新的靶点越来越被受到重视旧Ｊ。本研究旨在探
５’一ＴｃＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＩＴｃＡＧＡＧ一３’，下游弓Ｉ物：５’一
ＣＧＡＧＣＡＴＡＣｑｑ＂ＧＡＡＣＣＧＡＴＴＣＴ．３’；Ｇ６ＰＤ上游弓Ｉ物： ５’一ＣＧＡＧＧＣＣＧＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣ一３’，下游引物：５’一 ＧＴＡＧＴＧＧＴＣＧＡＴＧＣＧＧＴＡＧＡ－３’；ＬＤＨＡ上游引物：５’一 ＡＴＧＧＣＡＡＣＴＣＴＡＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣ－３’，下游弓ｌ物：５’一 ＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＴＧＴＡＡＴＣＴ－３’；ＡＬＤＯＡ上游弓Ｉ 物：５’．ＡＴＧＣＣＣＴＡＣＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＣＡ－３’，下游弓Ｉ物： ５’一ＧＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＣＡＴＣＴＧ一３’；ＰＫＭ２上游引物：
【关键词】结肠肿瘤；０５３；能量代谢
Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ
ｃａｎｃｅｒ
ｐｔａｂｏｌｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ
Ｌｉｕ Ｌｉａｎｇ，Ｃｈｅｎ Ｈａｏ，Ｙｕ Ｃｈａｏｒａｎ，Ｔａｏ Ｄｅｄｉｎｇ，Ｌｅｎｇ Ｘｉａｏｌａｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｔｏｎｇｆｉ
讨ｐ５３在结肠癌细胞ＨＣＴｌ １６代谢转换中的作用及其 可能的分子调控机制。
材料与方法 １．材料：ＨＣＴｌｌ６ ｐ５３野生型及缺失型细胞株由本
５’．ＡＴＧＴｃＧＡＡＧｃＣＣＣＡＴＡＧＴＧＡＡ．３’，下游引物：５’一
ＴＧＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＣＡ．３’；ＧＡＰＤＨ上游引物：
５’．ＴＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧ－３’，下游引物：５’一 ＡＣＡＣＣＡ７ＩＩＧＴＡｒＩ’Ｉ＇ＣＣＧＧＧＴＣＡＡＴ．３’。按照试剂盒说明
细胞，ｐ５３野生型（ＷＴ）的ＨＣＴｌｌ６细胞对葡萄糖的摄取能力下降４ｌ％（Ｐ＜０．０５）。进一步利用
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测能量代谢关键基因进行蛋白水平的比较及半定量分析后发现，相对于０５３ ＫＯ的
ＨＣＴｌｌ６细胞，调控细胞脂质代谢关键酶ＡＣＬＹ下调０．３９８４（ｔ＝７．１５４，Ｐ＜０．０２５）、糖酵解的关键酶 Ｇ６ＰＤ下调０．３５７８（ｔ＝１０．９９，Ｐ＜０．０１）、ＬＤＨＡ下调０．２２２７（ｔ＝７．１８２，Ｐ＜０．０５），证明上述基因在 ｐ５３可汀细胞中表达受抑制，而另外两个糖酵解关键酶ＡＬＤＯＡ及ＰＫＭ２的表达则无明显变化（Ｐ＞ ０．０５）。进一步检测ｍＲＮＡ水平后发现ｐ５３ ｗＴ的ＨＣＴｌｌ６细胞中ＡＣＬＹ基因下调６．６１倍（ｔ＝ ４３．１８，Ｐ＜０．０１）、Ｇ６ＰＤ基因下调６．７５倍（ｔ＝８５．９０，Ｐ＜０．０１）及ＬＤＨＡ基因下调０．９９倍（ｔ＝ ３２．４２，Ｐ＜０．０１），而ＡＬＤＯＡ及ＰＫＭ２则无明显变化（Ｐ＞０．０５）。结论野生型ｐ５３作为抑癌基因 参与肿瘤能量代谢的调控过程，其可能通过抑制多种关键酶发挥作用。
ＨＣＴｌｌ６ ｃｅｌｌｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ｓｉｘ—ｆｏｌｄｓ（ｔ＝４３．１８，Ｐ＜０．叭）ａｎｄ ｓｅｖｅｎ—ｆｏｌｄｓ（ｔ＝４３．１８， Ｐ＜０．０１）ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｂｅｓｉｄｅｓ．ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＬＤＨＡ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ５０％ｉｎ ｐ５３ ＷＴ ＨＣＴｌ １６ ｄ０１ａｓｅ Ａ（ＡＬＤＯＡ）ａｎｄ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ
Ａ（ＬＤＨＡ）．ｋｅｙ
ｉｎ
ａｓｅ
ａｓ
ｗｅＩＩ
０．３９８ ４，０．３５７ ８ ａｎｄ ０．２２２ ７ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ＷＴ ＷＴ ｍＲＮＡ ＨＣＴｌｌ６ ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０２５）．Ｔｈｅ ０５３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＣＬＹ ａｎｄ Ｇ６ＰＤ ｉｎ ｐ５３
（Ｇ６ＰＤ）、乳酸脱氢酶（ＬＤＨＡ）、醛缩酶（ＡＬＤＯＡ）及Ｍ２
ＰＣＲ数据，应用单向方差分析进行各个样本间２一ＡＡｃ‘
的比较。
５．统计学方法：数据以均数±标准差（元－Ｉ－ｓ）表示，
应用ＳＰＳＳ １２．０统计软件分析，采用ｔ检验，以Ｐ＜
型丙酮酸激酶（ＰＫＭ２）抗体均购自Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ公司；
２－脱氧一Ｄ葡萄糖（２ＮＢＤＧ）检测试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司。
０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｃｅｌｌｓ（ｔ＝３２．４２，Ｐ＜０．０１）．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌ－ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞ Ｍ２（ＰＫＭ２）ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ ｓｈｏｗｓ Ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ（ＷＴ）ｐ５３，ａｓ ａ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ，ｍａｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒ。
组和对照组间目的蛋白条带的相对灰度值，即可间接 反映蛋白表达水平差异。 ４．实时定量聚合酶链反应（Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ）：将 ＨＣＴｌｌ６细胞以５×１０５个／孔接种于６孔板，２４ ｈ贴壁 培养后胰酶消化收集细胞沉淀，利用Ｔｒｉｚｏｌ法提取细
行灰度值分析，进行半定量分析后可见相对于ｐ５３缺
失型（ＫＯ）细胞，ＡＣＬＹ下调０．３９８ ４（ｔ＝７．１５４，Ｐ＜ ０．０５）、Ｇ６ＰＤ下调０．３５７ ８（ｔ＝１０．９９，Ｐ＜０．０１）、 ＬＤＨＡ下调０．２２２ ７（ｔ＝７．１８２，Ｐ＜０．０５）；而ＡＬＤＯＡ
缺失型ＨＣＴｌｌ６细胞，ｐ５３野生型ＨＣＴｌｌ６细胞的葡萄
２－ＮＢＤＧ作用２
ｈ，
胰酶消化细胞，ＰＢＳ洗２遍后流式细胞仪检测细胞的
糖摄取能力下降４１％（Ｐ＜０．０５．图２）。
种于６孔板，２４ ｈ贴壁培养后胰酶消化收集细胞沉淀，
加入适量含苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）的ＮＰ４０裂解液冰 上裂解离心后取上清，经二喹啉甲酸（ＢＣＡ）法检测浓 度后加人上样缓冲液水浴１００ ｃｃ。蛋白样品以每孔 ３０斗ｌ上样电泳后，硝酸纤维素（ＮＣ）膜转膜２ ｈ，并用 脱脂牛奶封闭非特异性结合，４℃孵育一抗过夜（ｐ５３ 抗体浓度为１：５００，ＧＡＰＤＨ、ＡＣＬＹ、Ｇ６ＰＤ、ＡＬＤＯＡ、 ＰＫＭ２抗体浓度均为１：１ ０００，ＬＤＨＡ抗体浓度