电镜生物样品前处理固定液配方
电镜生物样品前处理固定液配方
固定液配方一、戊二醛固定液:市售戊二醛为25%or50%水溶液，一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐溶液配制成所需浓度的固定液0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液A液：二甲砷酸钠•3H2O 4.28g加双蒸水至100mlB液：HCL(36-38%) 1.66ml 加双蒸水至100ml按下表比例混合A、B液以配制0.2M二甲砷酸钠母液（在通风橱配制），加1倍双蒸水即得0.1M二甲砷酸钠缓冲液Na2HPO4•2H2O 35.6gNa2HPO4•4H2O 53.63gNa2HPO4•7H2O 71.64g100mlB液：NaH2PO4溶液NaH2PO4 24.0g/ NaH2PO4 •H2O 27.6g/ NaH2PO4 •2H2O 31.21g 加双蒸水至100ml二、四氧化饿固定液1、2%四氧化饿水溶液将0.5 or 1.0g装四氧化饿安踣瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶，在排毒柜5内将安踣瓶敲破，立刻加入双蒸水，配制成2%四氧化饿水溶液，盖上盖子，溶解1d.2、用0.1M磷酸缓冲液配制成四氧化饿固定液0.1M磷酸缓冲液5ml2%四氧化饿水溶液5ml三、karnovsky 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液1、10%多聚甲醛水溶液多聚甲醛2g双蒸水20ml2、固定液配制0.2M磷酸缓冲液50ml25%戊二醛10ml 双蒸水加至100ml10%多聚甲醛水溶液20ml染色液配方一、超薄切片染色液1、柠檬酸铅（Re ynolds’）溶液硝酸铅 1.33g柠檬酸三钠 1.76g切片染色时间5-10min 双蒸水30mlNOTICE:该溶液易与空气中CO2作用而产生沉淀，故使用与保存时，应尽量减少与空气接触，若稍有白色沉淀即舍弃2、醋酸双氧铀-50%饱和溶液醋酸双氧铀2g50%乙醇100ml切片染色时间15-30min（室温），延迟时间or提高温度可加反差NOTICE:溶液呈鲜黄色，若变淡则表示失效。
二、负染色液1、磷钨酸负染色液（PTA）磷钨酸1-2g双蒸水100ml2、醋酸双氧铀负染色醋酸双氧铀双蒸水3、钼酸铵负染色（AM）钼酸铵2g双蒸水。
电镜取样及固定液配制
固定方法：现在磷酸戊二醛固定液中固定24小时，然后换用新的磷酸戊二醛缓冲液永久固定
工具：手术刀两把，镊子两把，锋利的刀片，100ml蓝盖瓶8个
根茎叶取样：最后成熟稳定期取野生型和突变型的根茎叶组织
根：野生型和突变型取相同部位根的相同部位，根尖偏上部位
茎：野生型和突变型取茎相同节间的中间部位（例如第5节茎中间部位），用锋利的刀片切成1cm×0.2cm方块
叶：野生型和突变型取相同叶片的相同部位（例如第5片叶的中间部位），3cm×1cm
磷缓戊二醛固定液：以下两步配成
一、磷酸盐缓冲液配方
A液：0.2M磷酸氢二钠贮备液
磷酸氢二钠Na2HPO4·2H2O 35.61g
或Na2HPO4·7H2O 53.65g
或Na2HPO4·12H2O 71.64g
加双蒸水至1000ml
籽粒取样:
大粒野生型和小粒突变型授粉后分三个时期取样：5天，15天，35天
取样部位：野生型和突变型三个时期各自选取三株，每株取穗轴中部籽粒5-10粒
取样方法：将各个时期所取籽粒的左右两侧和上下两头切掉一部分，留中间部位，切成0.5cm×0.2cm大小（另外可以将各个时期取的样品保留3-5粒种子完整不切开存放在固定液）
B液：0.2M磷酸二氢钠贮备液
磷酸二氢钠NaH2PO4·H2O 27.60g
或NaH2PO4·2H2O 31.21g
加双蒸水至1000ml
C液：0.2M磷酸盐缓冲液:
pH(25℃)
A液
B液
7.2
36ml
14ml
二、磷缓戊二醛固定液配方
C液50mlPH
25%戊二醛溶液10ml 7.2
ห้องสมุดไป่ตู้加蒸馏水至100ml 7.2
电镜材料固定方法
电镜材料固定方法
1、固定液固定（固定液体积是固定材料的十倍以上）
3%戊二醛in 0.1M PBS ,ph7.2，室温5-6h，后4°C保存
（取材：先整个材料放入固定液中，之后用锋利的双面刀片分割，不能撕扯材料，分割成小块后1*1mm，置于固定液中，抽气~20min，让材料沉入固定液中）
2、0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
3、1%锇酸固定in 0.1M PBS，4°C overnight
4、0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
5、乙醇系列脱水：30%-50%-70%（4°C, overnight,可以停下）
-80%-90%-95%-100%-100%（每级20-30分钟，不同材料时间不同）
注意：100%乙醇时不要吸干，防止材料干了。
用丙酮置换乙醇：
乙醇：丙酮=1：1，纯丙酮2次，每级20-30分钟
6、丙酮：树脂=2：1，1：1（可以停下了，overnight），1：2 2-3h/级
纯树脂12h，
换纯树脂12h （从进入树脂开始就要防潮！）
7、包埋
8、聚合60°C 24hr
注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固定液可以是25%戊二醛+1.25%多聚甲醛in 0.1M PBS Ph 7.2。
微生物-菌体扫描电镜前处理
扫描电镜
1、收集培养好的新鲜菌体，用1×PBS（pH7.0）或0.9% NaCl漂洗样品2-3次，每次15min ，5000rpm离心3min,去上清；
2、加2.5%的戊二醛溶液1ml,轻摇充分混匀，重悬菌液，4℃固定4h或过夜；
3、5000rpm离心3min,去上清，加入500ul PBS漂洗样品三次，每次15min （可用枪轻轻吹打，然后离心再加入新鲜PBS，混匀离心）；
4、加1%锇酸500ul或适量,摇动充分混匀，固定1-2h；
5、5000rpm离心3min,去上清，加入PBS 500ul漂洗样品三次，每次15min；
6、用梯度浓度（包括20%，50%，80%，100%五种浓度）的乙醇溶液脱水，每种浓度处理10min，5000rpm离心3min；
7、用纯丙酮或100%叔丁醇转换100%乙醇2-3次，即乙醇菌液离心的后，去上清，加200ul纯丙酮4℃放置20-30min,5000rpm离心3min，再加入新鲜纯丙酮。
8、自然风干，密封4℃保存，等待上样。
电镜缓冲液、固定液、染液配方
固定液配方一、戊二醛固定液:市售戊二醛为25%or50%水溶液，一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐溶液配制成所需浓度的固定液0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液 A 液：二甲砷酸钠•3H 2O 4.28g加双蒸水至100ml B 液：HCL(36-38%) 1.66ml 加双蒸水至100ml按下表比例混合A 、B 液以配制0.2M 二甲砷酸钠母液（在通风橱配制），加1倍双蒸水即得0.1M 二甲砷酸钠缓冲液0.1mol/L 磷酸缓冲液 A 液：Na 2HPO 4溶液 2.84g Na 2HPO 4 / 3.161g Na 2HPO 4 •H 2O / 3.56g Na 2HPO 4 •2H2O /5.363g Na 2HPO 4 •4H2O / 7.164g Na 2HPO 4 •7H2O加双蒸水至100mlB 液：NaH 2PO 4溶液 2.40g NaH 2PO 4/ 2.76g NaH 2PO 4 •H 2O/ 3.121g NaH 2PO 4 •2H 2O 加双蒸水至100ml按下表比例混合A 、B 液以配制0.2M 磷酸缓冲液，加1倍双蒸水即得0.1M 磷酸缓冲液二、四氧化饿固定液 1、2%四氧化饿水溶液将0.5 or 1.0g 装四氧化饿安踣瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶，在排毒柜内将安瓿瓶敲破，立刻加入双蒸水，配制成2%四氧化饿水溶液，盖上盖子，溶解1d. 2、用0.1M 磷酸缓冲液配制成四氧化饿固定液 0.1M 磷酸缓冲液 5ml2%四氧化饿水溶液 5ml 三、karnovsky 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液 1、10%多聚甲醛水溶液 多聚甲醛 2g 双蒸水 20ml 2、固定液配制0.2M 磷酸缓冲液 50ml25%戊二醛 10ml 双蒸水加至100ml 10%多聚甲醛水溶液 20ml染色液配方一、 透射电镜正染色液1、柠檬酸铅（Re ynolds’）溶液 硝酸铅 1.33g 柠檬酸三钠 1.76g 切片染色时间5-10min 双蒸水 30mlNOTICE:该溶液易与空气中CO 2作用而产生沉淀，故使用与保存时，应尽量减少与空气接触，若稍有白色沉淀即舍弃 2、醋酸双氧铀-50%饱和溶液 醋酸双氧铀 2g 50%乙醇 100ml 切片染色时间15-30min （室温），延迟时间or 提高温度可加反差 NOTICE:溶液呈鲜黄色，若变淡则表示失效。
透射电镜生物样品前处理步骤
电镜样品制备步骤1、取材：放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年)注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm）2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min3、锇酸固定与再漂洗：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作），吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差）最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷置换）注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，置换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。
5、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥)注：样品周围不能有气泡6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。
7、莱卡EM UC 7超薄切片仪修快、切片（50-70nm）8、正染色：塑料包埋模具（刀划几道缝隙），染色时温度低影响染色效果，冬天空调醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液100ul染色（15min-1h），双蒸水冲洗柠檬酸铅100ul染色15min（极易吸收空气中CO2产生PbCO3,染色时毋对着说话、呼吸，同时放置数块NaOH）9、日立H-7650透射电镜观察spurr包埋剂配制：ERL 2.5gNSA 5.2 g 混合均匀后再加入催化剂DMAE，搅拌30min；低温干燥保存DER 2.5 gDMAE 0.1g宜新鲜配制但由于使用期限长(3-4天)，混合物可在使用前一天制备。
电镜样本制备原理
电镜样本制备原理
1.固定：将取下的组织块及时投入
2.5%戊二醛固定液中，以固定细胞的形态。
这一步非常重要，因为固定液可以迅速凝固组织中的蛋白质和核酸，从而保持细胞的原有结构和功能。
2.脱水：将固定好的组织块进行脱水处理，通常使用乙醇或丙酮进行脱水。
脱水可以使组织块变硬，以便于进行后续的包埋和切片操作。
3.包埋：将脱水后的组织块放入包埋剂中，经过加热等处理后，使包埋剂凝固，将组织块固定在其中。
包埋剂的硬度适中，可以确保切片时能够切出较薄的样品。
4.切片：使用超薄切片机将包埋的组织块切成薄片，通常厚度在40-50纳米之间。
切片的厚度和质量对于后续的观察和鉴定非常重要，因此需要非常精细的操作。
5.染色：将切好的薄片放在载玻片上，用染色液进行染色，以增强细胞的对比度和结构细节的可见度。
这一步是为了使细胞的结构更加清晰，以便于在电镜下观察。
6.电镜观察：将染色后的薄片放入电镜中观察，可以使用透射电镜或扫描电镜进行观察。
在电镜下，可以观察到细胞的超微结构和细节，如细胞膜、细胞器、细胞核等。
总的来说，电镜样本制备原理需要经过多个步骤，每个步骤都需要严格的操作和质量控制，以确保最终观察到的细胞结构和功能的准确性。
透射电镜样品制备固定液配方
0.2M磷酸缓冲液一系列PH值的配方：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2M）pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml5.8 8.0 92.05.9 10.0 90.06.0 12.3 87.76.1 15.0 85.06.2 18.5 81.56.3 22.5 77.56.4 26.5 73.56.5 31.5 68.56.6 37.5 62.56.7 43.5 56.56.8 49.5 51.06.9 55.0 45.07.0 61.0 39.07.1 67.0 33.07.2 72.0 28.07.3 77.0 23.07.4 81.0 19.07.5 84.0 16.07.6 87.0 13.07 .7 89.5 10.57.8 91.5 8.57.9 93.0 7.08.0 94.7 5.3Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05 0.2M溶液含35.61g/LNa2HPO4·12H2O分子量＝358.22 0.2M溶液含71.64g/LNaH2PO4·H2O分子量＝138.01 0.2M溶液含27.6g/LNaH2PO4·2H2O分子量＝156.03 0.2M溶液含31.21g/L电镜实验用２．５％戊二醛固定液及其制备方法申请号/专利号：201010185630本发明公开了一种电镜实验用２．５％戊二醛固定液及其制备方法，包括以下步骤：１、磷酸盐缓冲液配制：Ａ液：磷酸氢二钠＊１２个结晶水７１．６４克加蒸镏水至１０００ｍｌ；Ｂ液：磷酸二氢钠＊２个结晶水３１．２１克加蒸镏水至１０００ｍｌ；将Ａ液３６ｍｌ＋Ｂ液１４ｍｌ配置成０．２ｍｏｌｐＨ７．２的磷酸盐缓冲液；２、固定剂戊二醛配制：将步骤１配置好的０．２ｍｏｌｐＨ７．２磷酸盐缓冲液５０ｍｌ，加入５０％戊二醛５ｍｌ，然后加蒸镏水至１００ｍｌ，加入活性炭２ｇ1、0.2M磷酸缓冲液的配制磷酸二氢钠(NaH2PO4.H2O) 2.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 29g重蒸馏水加至500ml调pH至7.42、戊二醛固定液0．1M磷酸缓冲液配制的戊二醛固定液如下（A）（B）（C）25%戊二醛（ml）0.4 1 1.6重蒸馏水（ml）4.6 4 3.40．2M缓冲液（ml）5 5 5戊二醛最终浓度(%) 1 2.5 4配制后的固定液pH应为7.3-7.4。
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固定液配方
一、戊二醛固定液:市售戊二醛为25%or50%水溶液，一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐溶液配制成所需浓度的固定液
0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液A液：二甲砷酸钠•3H2O 4.28g
加双蒸水至100ml
B液：HCL(36-38%) 1.66ml 加双蒸水至100ml
按下表比例混合A、B液以配制0.2M二甲砷酸钠母液（在通风橱配制），加1倍双蒸水即得0.1M二甲砷酸钠缓冲液
Na2HPO4•2H2O 35.6g
Na2HPO4•4H2O 53.63g
Na2HPO4•7H2O 71.64g
100ml
B液：NaH2PO4溶液NaH2PO4 24.0g/ NaH2PO4 •H2O 27.6g/ NaH2PO4 •2H2O 31.21g 加双蒸水至100ml
二、四氧化饿固定液
1、2%四氧化饿水溶液
将0.5 or 1.0g装四氧化饿安踣瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶，在排毒柜5内将安踣瓶敲破，立刻加入双蒸水，配制成2%四氧化饿水溶液，盖上盖子，溶解1d.
2、用0.1M磷酸缓冲液配制成四氧化饿固定液0.1M磷酸缓冲液5ml
2%四氧化饿水溶液5ml
三、karnovsky 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液
1、10%多聚甲醛水溶液多聚甲醛2g
双蒸水20ml
2、固定液配制
0.2M磷酸缓冲液50ml
25%戊二醛10ml 双蒸水加至100ml
10%多聚甲醛水溶液20ml
染色液配方
一、超薄切片染色液
1、柠檬酸铅（Re ynolds’）溶液硝酸铅 1.33g
柠檬酸三钠 1.76g
切片染色时间5-10min 双蒸水30ml
NOTICE:该溶液易与空气中CO2作用而产生沉淀，故使用与保存时，应尽量减少与空气接触，若稍有白色沉淀即舍弃
2、醋酸双氧铀-50%饱和溶液醋酸双氧铀2g
50%乙醇100ml
切片染色时间15-30min（室温），延迟时间or提高温度可加反差
NOTICE:溶液呈鲜黄色，若变淡则表示失效。
二、负染色液
1、磷钨酸负染色液（PTA）磷钨酸1-2g
双蒸水100ml
2、醋酸双氧铀负染色醋酸双氧铀
双蒸水
3、钼酸铵负染色（AM）钼酸铵2g
双蒸水。