实验三 线粒体及叶绿体的提取 2015
观察叶绿体线粒体实验报告
观察叶绿体线粒体实验报告实验目的本实验旨在观察和学习叶绿体和线粒体的结构和功能。
实验材料1. 鲜嫩的植物叶片2. 显微镜3. 盖玻片4. 细悬浮液5. 10%的醋酸实验步骤1. 将几片鲜嫩的植物叶片放入细悬浮液中，并用盖玻片盖好。
2. 在显微镜下，以低倍镜观察叶绿体的形态和位置。
3. 向盖玻片下方滴添加10%的醋酸，使细胞质细小透明，以进一步观察叶绿体的结构。
实验结果在低倍镜下观察，可以清晰地看到叶绿体位于植物细胞的质体中，并且形状呈现出类似棒状或片状的结构。
叶绿体通常密集分布在植物叶片的表皮细胞中，主要在细胞质内。
在添加醋酸后，通过显微镜的高倍镜观察，发现叶绿体的内部结构更加清晰可见。
叶绿体内部存在着一系列被称为叶绿素的色素体颗粒，这些颗粒是植物进行光合作用的关键成分之一。
叶绿素能够吸收光能，并转化为化学能，供植物进行代谢活动。
结论通过本实验的观察和学习，我们得到了以下结论：1. 叶绿体是存在于植物细胞中的一种细胞器，主要参与光合作用反应。
2. 叶绿体的形态和位置在不同植物细胞中可能存在差异，但通常位于细胞的质体中。
3. 叶绿体内部含有叶绿素，该色素体颗粒能够吸收光能并将其转化为植物所需的化学能。
这些观察结果和结论有助于我们进一步认识和了解植物细胞的结构和功能，也为我们深入理解光合作用的过程提供了基础。
实验总结叶绿体线粒体实验的目的在于通过观察植物叶片中的叶绿体结构，加深对其功能的理解。
通过该实验，我们了解到叶绿体是细胞中重要的细胞器之一，它在植物的光合作用中起着至关重要的作用。
叶绿体中含有叶绿素，这一色素体颗粒能够吸收光能，并将其转化为生物化学过程所需的化学能。
实验中合理运用显微镜和化学试剂，配合对叶绿体的仔细观察和镜下调整，我们成功地观察到了叶绿体的结构和功能。
展望通过本次实验，我们对叶绿体的结构和功能有了初步的了解。
但叶绿体和线粒体的结构和功能非常复杂，还有许多细节和特点有待进一步探究。
高三生物基础实验(人教版(上))：实验3观察线粒体和叶绿体含解析
高三生物基础实验(人教版(上))：实验3观察线粒体和叶绿体含解析——显微镜下观察叶绿体的方法，显微镜下观察线粒体的方法前情提要：关键词：叶绿体、线粒体、健那绿难度系数：★★★重要程度：★★★★基础回顾：考点内容要求考纲解读观察线粒体和叶绿体Ⅱ1、理解显微镜下观察叶绿体的方法2、理解显微镜下观察线粒体的方法考点一览：显微镜下观察线粒体和叶绿体1．实验原理（1）叶绿体呈绿色、扁平的椭球形或球形，不需染色，制片后直接观察。
（2）线粒体呈无色，有短棒状、圆球状、线形、哑铃形等，用健那绿染成蓝绿色后制片观察。
2．实验步骤（1）观察叶绿体（2）观察线粒体技能方法：1．观察叶绿体时，临时装片中的材料要随时保持有水状态的原因保持有水状态以保证叶绿体的正常形态，并能悬浮在细胞质基质中，否则，细胞失水收缩，将影响对叶绿体形态的观察。
2．观察线粒体的实验要滴加健那绿染液的原因健那绿是将活细胞中线粒体染色的专一性染料，可使细胞中的线粒体呈现蓝绿色，而细胞质接近无色，从而在高倍显微镜下可以观察线粒体的分布和形态。
3、与叶绿体和线粒体实验有关留意事项（1）要漱净口腔，防止杂质对窥察物像的干扰。
（2）用菠菜叶稍带些叶肉的下表皮为实验材料的缘故原由：靠近下表皮的叶肉为栅栏构造，叶绿体大而排列疏松，便于窥察；带叶肉是因为表皮细胞不含叶绿体。
（3）叶绿体在弱光下以椭球形的正面朝向光源，便于接受较多的光照；在强光下则以侧面朝向光源，以制止被灼伤。
（4）盖盖玻片时，一定要缓慢且与载玻片成45°夹角，盖玻片一侧先接触液滴，防止装片下产生气泡。
【误区警示】走出叶绿体、线粒体窥察实验的“5”个误区（1）窥察线粒体应挑选人体或动物细胞或植物体无色部位细胞，不能挑选绿色构造细胞。
（2）窥察线粒体与叶绿体均需保持细胞活性状态。
（3）观察叶绿体时需保持叶片有水状态，防止失水。
（4）制作观察线粒体的临时装片时，是滴一滴健那绿染液于载玻片中央用于染色，而不是滴一滴生理盐水。
线粒体和叶绿体实验报告
实验三用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体
一实验目的
学会制作临时装片，用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体的形态和分布。
二实验原理
叶绿体和线粒体分布在，叶绿体呈色, 不需要经过染色，可在高倍显微镜下直接观察到线粒体的形态呈；线粒体呈色，因此需用染液将其染成，而细胞质接近无色，才可在高倍显微镜下观察到线粒体,其形态呈。
三实验方法和步骤
1 制作临时装片
2观察叶绿体
①黑藻叶片临时装片
②菠菜叶片临时装片
2 观察线粒体
①口腔上皮细胞临时装片
②洋葱内表皮细胞临时装片
三实验结果
四思考与讨论
1 观察叶绿体时，为什么临时装片中的叶片不能放干？2为什么观察线粒体用的是洋葱内表皮，而不用外表皮？。
细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离
实验二细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法.二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法.细胞组分的分离在等渗溶液〔0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液〕中进行.●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞.●在3000r/min的条件下离心5 min,即可获得沉淀的叶绿体〔混有部分细胞核〕.●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶,洗净搽干后去除叶梗和粗脉,称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中,放入组织捣碎机<间歇>；低速匀浆1min；间歇匀浆.2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中.3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体〔混有部分细胞核〕；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离.5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮.〔浓度不要太高,不利于观察〕➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,再滴加一滴0.01%吖啶橙染料,加盖玻片即可在荧光显微镜下观察.第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.收集沉淀涂片,用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟,线粒体为蓝绿色圆形颗粒.实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下,要迅速分离和观察.〔教师演示示X〕第三部分人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察一、实验目的：观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布.二、实验原理：线粒体是细胞进行呼吸作用的场所,其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同生理状态而发生改变.詹纳斯绿B是一种毒性较小的碱性染料,可专一性的对线粒体进行超活染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态〔即有色状态〕,呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基〔即无色状态〕.三、实验步骤：1、取清洁载玻片,滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液；2、用牙签宽头在口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞,将刮下的黏液状物放入载玻片的染液中,染色10-15 min；〔作用,染液不可干燥,必要时加滴染液〕；3、盖上盖玻片,置显微镜下观察.四、实验结果：在低倍镜下,选择平展的口腔上皮细胞,换高倍镜观察,可见扁平状上皮细胞内,核周围的胞质中,分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构,即为线粒体.实验作业：3 绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布.。
叶肉细胞的叶绿体和线粒体分离方法
叶肉细胞中的叶绿体和线粒体的分离通常依赖于差速离心技术，这是一种利用离心力通过不同密度和大小分离细胞器的方法。
叶绿体和线粒体可以通过粗破碎细胞获得粗提取液，然后通过离心分离纯化。
下面是一个标准的分离流程：1. 组织匀浆：收集新鲜的植物叶片，并在预冷的匀浆缓冲液中匀浆。
这个缓冲液通常包含适合的缓冲剂（如MOPS或HEPES），渗透压调节剂（如蔗糖或甘露醇），以及保护剂（如EDTA）来保护细胞器免受损坏。
匀浆过程应该足够温和，以避免损坏叶绿体和线粒体，但又足够强以破坏细胞以释放细胞器。
2. 过滤和初步离心：将匀浆液通过细目筛或纱布过滤以去除较大的细胞碎片和未破碎的细胞。
首先使用低速离心（例如1000 g左右，5-10分钟）去除细胞碎片和核。
3. 差速离心：收集上述低速离心后的上清液，然后在更高的速度下离心（例如5000-15000 g，10-20分钟），以沉淀叶绿体。
收集叶绿体沉淀，将上清液进行更高速度的离心（例如20000-50000 g，30分钟以上）以沉淀线粒体。
4. 洗涤和纯化：可以用同样的缓冲液轻轻重悬叶绿体和线粒体沉淀，并再次离心以清洗并进一步纯化。
可以重复上述离心步骤，或者使用密度梯度离心来进一步纯化叶绿体和线粒体。
5. 密度梯度离心（如果需要更高纯度的细胞器）：梯度通常使用蔗糖、过氧化氢或聚乙二醇等物质制备。
把叶绿体和线粒体悬浮液层叠在密度梯度上，然后进行高速离心，不同密度的细胞器会在梯度中不同的位置聚集。
6. 收集和存储：在密度梯度离心后，仔细收集不同密度的带，其中包含纯化的叶绿体和线粒体。
采集后的细胞器可在适当的缓冲液中存储于低温条件下，以保持其功能。
在整个过程中，细胞器的完整性和功能的保持是非常重要的，因此所有步骤都应在低温、缓冲的条件下轻柔地操作。
另外，根据研究目的，可能还需要添加特定的酶抑制剂或其他添加剂以保护细胞器免受损伤。
实验三 叶绿体中色素的提取和分离
叶绿体中色素的提取和分离方案一【实验原理】（1）叶绿体中的色素能够溶解在有机溶剂丙酮中，所以，可以通过研磨法用丙酮提取叶绿体中的色素(若无丙酮亦可用酒精代替)。
（2）纸层析法：层析液（在60℃～90℃下分馏出来20份石油醚+ 2份丙酮+ 1份苯混合而成）是一种脂溶性很强的有机溶剂。
叶绿体中的色素在层析液中的溶解度不同(溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快；溶解度低的随层析液在滤纸上扩散得慢。
)这样，几分钟之后，叶绿体中的色素就在扩散过程中分解开来。
所以，可以用纸层析法分离出叶绿体中的色素。
【实验器材】新鲜的绿色菠菜叶片，干燥的定性滤纸，烧杯，研钵，小玻璃漏斗，脱脂棉，载玻片，剪刀，小试管，培养皿盖，药勺，量筒，天平。
丙酮，层析液，二氧化硅，碳酸钙。
【实验过程】（一）提取绿色叶片中的色素：1、用天平称取5g绿色的叶片，用剪刀剪碎，放入研钵中；2、向研钵中放入少许二氧化硅和碳酸钙，再加入5ml丙酮。
由于丙酮具有一定的毒性并且很容易挥发。
为了尽量少的吸入丙酮，可以将一片滤纸盖在研钵上，纸的中心穿一个洞，将杵棒套入洞口进行研磨。
※为什么要加入少许少许二氧化硅和碳酸钙？加入二氧化硅是为了研磨的更充分；加入少许碳酸钙是为了保护叶绿体中的色素，为是由于碳酸钙可以中和液泡破裂后释放出的有机酸，调节液体的PH，防止或避免色素被破坏。
※为什么要加入丙酮？丙酮是有机溶剂可以使色素溶解其中，作为色素的溶剂。
3、将研磨液迅速倒入小玻璃漏斗中进行过滤（漏斗基部放一小团脱脂棉）。
将滤液收集到一个小试管中，及时用塞将试管口塞紧。
（以防止滤液中的丙酮挥发）※是否可以用滤纸来代替脱脂棉？不可以，滤纸对光合色素具有较强的吸附能力，使滤液的色素分子减少。
（二）制备滤纸条：取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将滤纸剪成长6cm、宽1cm的滤纸条，将滤纸条的一端剪去两角，并在距这一端1cm处用铅笔画一条细的横线。
※在剪裁定性滤纸时，尽量注意双手不要接触纸面，以免手上的油脂或其他脏物污染滤纸，影响色素在纸条上的扩散。
叶绿体和线粒体实验报告
实验名称：
一、实验目的：
二、实验原理：
1. 叶绿体的观察：
2. 线粒体的观察：
三、方法步骤：
1. 叶绿体的观察：
2. 线粒体的观察：
四、实验结果：
1. 叶绿体呈形，色。
2. 在显微镜下，可明显地观察到叶绿体随细胞质基质的流动而在细胞中做（顺/逆时针运动），也有少数细胞作（顺/逆时针运动）。
3. 健那绿染色后的活细胞中，线粒体呈色，而细胞质接近色。
五、注意事项：
六、思考题：
1.观察叶绿体为什么用黑藻叶片？你还能想到什么实验材料。
2.黑藻的叶细胞中也有线粒体，为什么不选作为观察线粒体的实验材料？
3.细胞质中叶绿体的流动代表什么在流动？这种流动的状态对活细胞完
成各项生命活动有何生理意义？如果加速叶绿体流动可以采用什么方法？。
叶绿体、线粒体的提取
泡桐叶绿体和线粒体的提取与分离一、试验目的：1、将泡桐叶片中的叶绿体和线粒体提取出来。
2、掌握植物叶片中叶绿体和线粒体提取与分离的基本技术。
3、学习蔗糖沉淀差速离心法和差速离心法提取线粒体的方法。
二、实验材料与仪器：实验材料：泡桐新鲜叶片。
实验试剂：蒸馏水；液氮；缓冲液A（50 mmo l/L Tr is,，25 mmo l /L EDTA，1.25 mo l/L N aC l ，10 mmo l/Lβ-巯基乙醇, ψ=0. 1% (W /V ) BSA (牛血清蛋白) , ψ= 2% (W /V) CTAB, 10 g /L PVP, pH = 8. 0）；缓冲液B (Tris2HCl 0.105 mol/ L, 蔗糖0.15 mol/ L, EDTA 0.1005 mol/ L, BSA 0.11% , 巯基乙醇0.11%, pH =7.15)；缓冲液C( Tris2HCl 0.105 mol/ L, 蔗糖0.13 mol/L, MgCl2 0.101 mol/ L, pH 7.15)；缓冲液D( 0. 2 mol/ L 蔗糖、0. 3mol/ L 甘露醇、50 mol/ L Tris2Cl、1 mol/ L EDTA、0. 1% BSA 、0. 6% PVP、0. 1% B2巯基乙醇,pH 7. 5)；缓冲液E( 蔗糖0. 3 mol/ L、50mol/ L T ris2Cl, pH 7. 5)；缓冲液F( 50 mol/ LTris2Cl、0. 3 mol/ L 甘露醇、0. 2 mol/ L 蔗糖、0. 1% BSA、0. 6% PVP, pH = 7. 5)；纱布等。
试验仪器：研钵，研磨棒；离心管（250ml）；高速冷冻离心机；移液枪；高速组织捣碎器等三、试验步骤：1、叶绿体的提取与分离(1) 称取新鲜泡桐叶片50 ~ 100 g, , 暗处理12小时，蒸馏水洗干净在液氮中保存3 h以上, 以最快速度磨成粉末, 然后用6层无菌纱布过滤, 收集滤液, 弃渣。
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• 3.上清液用4 ℃10000 g 离心10 min，沉淀为线粒体。 • 4. 沉淀用 2 ml 0.25 M蔗糖-提取缓冲液重悬，同上离心一
次(4 ℃10000 g 离心10 min)。 • 5.沉淀存于200 μl 0.3M甘露醇中。 • 6.取分离的线粒体滴在载玻片上，滴加 1%詹纳斯绿B溶液
破碎的完整细胞
取上清
3000 rpm 5 min
研磨，过滤 15 ml 0.35 M氯化钠-buffer 两次离心
1 ml
沉淀悬浮
0.35 M氯化钠-buffer
光
叶绿体
学 显
微
镜
玉米黄化幼苗线粒体的分离
• 1.玉米幼苗约5克，加三倍体积（约8 ml）0.25 M蔗糖-提 取缓冲液，在预冷的研钵内快速研磨成匀浆。
实验步骤. 菠菜叶绿体的分离
• 1. 选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称3 g置于研钵中，加入 15 ml 0.35 M氯化钠－提取缓冲溶液。
• 2. 研磨成匀浆。 • 3. 用6层纱布过滤,滤液盛于烧杯中。
• 4. 取滤液12ml在1000 r/min下离心 2 min，弃去沉淀。 • 5. 将上清液在3000 r/min下离心 5 min，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。 • 6. 沉淀用1 ml 0.35 M氯化钠－提取缓冲液悬浮。
• 2. 对分离得到的叶绿体及线粒体进行观察 及活性鉴定。
1.差速离心
实验原理
▪ 匀浆、超声、研磨使细胞膜破裂，释放各种细胞器
▪ 在一定的离心力下，不同细胞器的沉降速度不同。
▪ 用不同的离心力，将各种不同亚细胞组分分离。
• 细胞核/叶绿体、线粒体/溶酶体/过氧化物酶体、微体、核糖体等。
由于细胞核与叶绿体的沉降速度相近，二者通过离心的方法较难分离。
• 7.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧 光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶 橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片。
菠菜叶绿体的分离实验流程图
洗净、剪碎
3 g菠菜
第一步低速离心： 去除其中的组织
残渣和一些未被1000 rpm 2 min
实验材料
（一）器材： 普通离心机,研钵,天平, 载玻片,盖玻片,滤纸,试管, 试管架,移液管, 滴管, 烧杯,离心管
（二）材料： 菠菜叶片,玉米黄化苗
（三）试剂： ▪ 提取缓冲液：2 mM Na2-EDTA ; 50 mM 三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸
缓冲液(pH7.4), 0.5% BSA (用前加入) ▪ 0.35 M绿B(Janus green B)染液 ▪ 0.3 M甘露醇溶液
实验三
叶绿体和线粒体的分离与观察
商建秀
实验师：刘伟 助教：陈连阁
分离叶绿体和线粒体的意义
1.分离和制备有活性的离体叶绿体是研究叶绿体的结构功能、 光合作用原理及遗传控制机理的前提。 2.对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
实验目的
• 1. 掌握差速离心技术分离细胞器的一般原 理和方法。
染色10分钟后,用光学显微镜观察。
玉米黄化幼苗线粒体的分离实验流程图
5g+ 8 ml 0.25M 蔗糖-buffer
玉米黄化幼苗剪碎、研磨，过滤
4度
分成小管离心 3000g 10min
取上清离心
10000g 10min
沉淀悬浮离心 10000g 10min
沉淀悬浮
200 μl 0.3M 甘露醇
詹纳斯绿B溶液染色,观察
注意事项
• 4人/ 组 2人/叶绿体，2人/线粒体 • 注意：离心机的平衡! • 请用天平平衡！
小型常温离心机 小型冷冻离心机
小型常温离心机 小型冷冻离心机
取新鲜叶片，从叶片的下表面撕取表皮制成装片，在普通显微镜及荧光显 微镜下分别观察气孔及气孔周围的叶绿体。
？？？线粒体詹纳斯绿B染色
如何区别线粒体?
Rcf(g）=1.118 X 10-5 X R（转子半径cm）X N 2 （转速rpm）
渗透压
• 恰好能够阻止水分子通过半透膜从浓度较 低的溶液移向浓度较高的溶液的在较高浓 度溶液的液面上施加的额外压强称为渗透 压。
渗透压
• 溶液渗透压，简单的说，是指溶液中溶质微粒对水的吸引力。溶 液渗透压的大小取决于单位体积溶液中溶质微粒的数目：溶质微 粒越多，即溶液浓度越高，对水的吸引力越大，溶液渗透压越高； 反过来，溶质微粒越少，即与无机盐、蛋白质的含量有关。在组 成细胞外液的各种无机盐离子中，含量上占有明显优势的是Na+ 和Cl-，细胞外液渗透压的90%以上来源于Na+和Cl-。在37℃时， 人的血浆渗透压约为770kPa，相当于细胞内液的渗透压。
2.细胞器的分离介质和条件
• 采用缓冲溶液, 接近细胞质的分散相,保持细胞器 的结构和酶的活性；
• 叶绿体用0.35 M氯化钠或0.4 M蔗糖溶液； • 线粒体用0.25 M蔗糖溶液； • 整个操作过程样品要保持在0℃-4℃,避免酶失活。
3.对分离的细胞器进行鉴定
• 叶绿体用0.01% 吖啶橙荧光染料 • 线粒体用1%詹纳斯绿B染液鉴定活性和纯度。
结果：
结果与讨论
• 1. 绘图并描述光镜下分离的叶绿体的形态及菠菜 下表皮中叶绿体的形态。
• 2. 描述提取到的线粒体的形状及染色情况（如实 验结果不理想，分析造成实验失败的原因。）
思考题
1.植物中分离纯化的叶绿素的酒精溶液在透射光 下为翠绿色，而在反射光下为棕红色。植物中分 离出的叶绿体是否也有同样的现象？请从叶绿体 的功能的角度解释为什么。 2.在细胞器分级分离的实验中，叶绿体分离所用 的等渗溶液势0.4 M的蔗糖，而分离线粒体却用 0.25 M的蔗糖，请从两种细胞器功能上的差异解 释为什么用不同浓度的等渗溶液。