大豆活性肽的分离纯化和生理活性

大豆活性肽的分离纯化和生理活性
大豆蛋白肽是利用酶法或微生物发酵法将大豆蛋白降解成多肽、短肽和氨基酸的混合物。

大豆蛋白肽是一种重要的肽来源。

大豆蛋白肽与蛋白质相比较，多肽具有如下特点：在较宽的pH 范围内溶解度高，容易在体内消化和吸收；渗透压低，能够避免高渗透压导致的腹泻；不容易导致过敏。

Rerat 等研究表明，短肽的特点是吸收速度快、消耗能量低、载体不易饱和，不同肽之间运转没有竞争和抑制。

随着生物技术与生命科学的不断进步与发展，大豆多肽的功能越来越多的被人们所发掘，而某些活性肽的结构与生理功能也逐渐被人们所认识和了解，这对活性肽的研究起到了推动作用，更有利于人类对大豆活性肽进行研究与开发。

迄今为止，从大豆蛋白中已分离出降血压肽、免疫调节肽、抗氧化肽、降胆固醇肽、抗血栓形成、促进钙磷及微量元素的吸收等多种纯化的大豆蛋白生物活性肽，对这些大豆活性肽的研究情况进行了综述，以期为大豆活性肽的应用提供参考。

1 大豆蛋白活性肽的分离和纯化目前，生产大豆活性肽的方法主要三种有：酶解法、微生物发酵法和化学法，最为先进的是微生物发酵法，它不仅能修饰肽的苦味。

还能将原料中的KTI 和BBI 等影响消化和口味的抗营养因子降解。

大豆蛋白肽的活性易受到外界条件的影响，在过强的酸碱、较
高的温度与剧烈震荡等条件下都有可能失活。

初始的肽液成分相对较复杂，目标产物的浓度也比较低，一般低于5%，含有大
量杂质，某些杂质的理化性质和目标产物有相似之处，这就提高了大豆肽的分离纯化的难度。

传统多肽分离工艺，如吸附沉淀、溶媒、萃取和离子交换法等步骤繁多，耗时，原料消耗量大，耗能高，得到的产品较少。

生物技术的发展与人们对大豆肽结构和功能研究的不断深入，大豆肽分离检测技术也获得了突飞猛进的发展，出现了反相高效液相色谱法、凝胶过滤色谱法、毛细管电泳法、膜分离法、各种技术手段的联用等许多高效的分离纯化技术和手段。

1.1反相高效液相色谱（RP—HPLC法
反相高效液相色谱是一种色谱洗脱法，它以非极性的反相介质为固定相，流动相是水溶液或甲醇、乙腈等极性有机溶剂。

根据流动相中被分离溶质疏水性的不同，与固定相发生的作用大小的差异，使被分离物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数，从而进行分离纯化。

如果大豆多肽是疏水性较弱的分子，它和固定相之间的作用比较小，能够较快流出；反之，如果大豆多肽分子疏水性比较大，流出会比较靠后。

反相高效液相色谱法分离纯化大豆活性肽时采用三氟乙酸- 乙氰这种挥发性冲剂作为流动相，其纯化产品不需脱盐，这样就简化了操作步骤，对于分子量在lOOODa以下的小分子大豆肽类物质的分离和纯化尤为重要。

反相高效液相色谱分离和纯化大豆活性肽时多采用增加流动相
疏水性的线性梯度洗脱法和在窄梯度的条件下延长洗脱时间的方法。

在洗脱的初始阶段，洗脱液中有机成分浓度较低，大豆肽分子与固定相间的疏水作用较强，几乎完全被固定相吸附。

随着洗脱的进行，当洗脱液中有机成分浓度增加到能够使得大豆多肽与固定相间作用小于流动相与固定相间的作用时，大豆活性肽分子便可从固定相上洗脱下来。

洗脱液成分的极微小改变对大豆肽的保留行为具有较大的影响，因而对于疏水特征相近的小分子大豆肽也能够完全分离。

1.2离子交换色谱（IEC）法
大豆活性肽的分离纯化方法之一就是离子交换色谱法。

离子交换色谱法是利用大豆多肽在一定pH值和离子强度条件下带电
荷的微弱差异，依靠静电力与离子交换剂结合在一起时，进入介质表面的可交换离子与带相同电荷的蛋白质分子就会发生交换的差异而分离。

1.3凝胶过滤色谱（GFC法
GFC也叫凝胶色谱分子筛法，是利用凝胶网状结构，根据分子大小和形状的不同进行分离的一种方法。

当样品进入凝胶柱后，较大分子不能通过凝胶孔道进入柱体内，会先流出层析柱，而小分子则渗入凝胶柱体内，后流出层析柱。

凝胶过滤色谱法具有很多优点，如分离条件温和，产品得率高，生物活性好，分离面宽等。

因此，凝胶过滤色谱被广泛用于大豆多肽物质的分离纯化中。

Ljevakovic 等分离肽聚糖单体衍生物是通过凝胶过滤色谱Sephadex G25和SP—Sepadex C-25离子交换色谱来完成的。

1.4 联用技术
在大豆多肽物质分离中，HPL—CE联用技术具有选择性和灵敏度高、时间花费短、操作简单，可用于梯度洗脱等具有独特的优点，尤其适合大豆多肽的分离纯化。

将高效液相色谱强的分离能力和质谱的选择性高、灵敏度高和提供相对分子质量与结构信息的优点有机的结合起来的高效液相色谱一质谱（HPLC-MS联用技术，为大豆活性肽组分的分离分析提供基础。

Hoffmann 用高效液相色谱―质谱分离技术在3.5min 内完成了多肽分离鉴定。

周婷婷利用超滤技术对大豆蛋白酶解物进行初步分离，利用高速逆流色谱技术对分子量小于5kDa的大豆肽进行分离，并利用RP-HPLC技术进一步纯化，得到了具有抗氧化活性的大豆多肽。

2 大豆肽的生理活性目前，从大豆蛋白中已分离出抗癌肽、降血压肽、降胆固醇活性肽、抗氧化肽、高F 值寡肽等多种纯化的大豆生物活性肽。

2.1 降血压肽
血管紧张素转换酶（ACE在肾血管紧张素系统中对调节血压具的生理功能有重要的作用。

由于体内血管紧张素转换酶活性太高而引起的高血压，可以通过抑制血管的紧张素转换酶活性，达到治疗高血压的作用。

Dziuba 等研究发现大豆蛋白酶解物能抑制血管紧张素转换酶活性，具有良好的降血压作用。

Zaelk 等利用高效液相色谱分析得到了抑制血管紧张素转换酶活性最强的短肽，其氨基酸序列
为组氨酸―组氨酸―亮氨酸，通过实验表明大豆蛋白中获得的血管紧张素转换酶抑制肽组氨酸― 组氨酸―亮氨酸在体内具有抗高血压活性。

大豆多肽可作为一种安全可靠有效的降压保健品，用于心血管疾病的患者。

2.2 降低胆固醇肽大豆多肽的降胆固醇作用主要是通过促进胆固醇的胆汁酸化，刺激甲状腺激素分泌，增加粪便排泄胆固醇，达到降低血液胆固醇的目的。

Yasuyuki 等采用基因位点诱变技术和酶解技术，从大豆球蛋白的酶解物中获得了多种具有减肥和降胆固醇的生物活性肽。

Satoshi Nagaoka 等用超声波乳化的方法制备出一种人造胆汁胶束溶液，在体外模拟人体的肠道环境，再经超速离心使胶束溶液两相分离，通过测定水相中胆固醇溶出的含量也可以考察大豆活性肽对胆固醇在胆汁胶束溶液中的溶解度的影响。

Morita 等报告老鼠食用大豆、马铃薯和稻米蛋白质对其胆固醇的降低有一定影响。

报告指出在试验引起的全部变化中，蛋白质中的蛋氨酸和蛋氨酸与甘氨酸比率是最好的降低胆固醇的因素，大豆蛋白质的低蛋氨酸含量或许是大豆起到降低胆固醇作用的一个重要原因。

2.3 降血脂功能刘忆梅等通过动物试验对大豆蛋白肽进行了降血脂功能研究。

实验结果表明，大豆蛋白肽能够升高高密度脂蛋白胆固醇
（HDL-C，降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）,从而起到显著降低
血清胆固醇的作用。

赵秀娟等将4 组Wistar 雄性大鼠喂饲4 周高血脂饲料诱导高血脂，一组大鼠喂正常饲料作为对照，喂高脂饲料动物有3 组分别给予5.10kg 体重、1.70kg 体重和0.85kg 体重剂量的大豆活性肽粉。

在实验结束时检测动物血清总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白的含量。

喂饲高剂量大豆活性肽粉的动物血清总胆固醇下降26.0%,甘油三酯含量下降24.4%。

而HDL-C没有明显变化。

大豆活性肽粉对喂饲高脂饲料的大鼠血脂有一定的调节作用。

2.4大豆短肽（SSP对氮平衡、消化率的影响
Bin Zhang 等通过用大豆短肽进行山羊饲养试验，结果表明大豆短肽可以维持氮平衡并可提高消化率。

2.5 大豆抗癌肽
葛锡娟等采用四噻唑蓝比色法对改变大豆粉过筛目数、脱脂粉添加量和超声波处理时间条件的大豆提取物进行抗癌活性检测。

结果表明，大豆抗癌肽在经过乙醚脱脂、过80目筛、脱脂粉添加量
3g/15mLPBS缓冲液（pH7.4）、超声处理时间80min, 经验证实验，此条件下对胃癌细胞SGC-7901的增殖抑制率达到39.03%。

1987 年日本的一个研究小组鉴定出富含天冬氨酸的大豆多
肽，分子量为5kDa的抗癌活性肽露那辛（Lunasin ）。

美国加利福尼亚大学克利分校研究小组通过动物实验发现富含天冬氨酸的大豆活性肽能破坏细胞有丝分裂并引起染色体破裂和细胞凋亡。

2.6抗氧化肽大豆蛋白酶解后的大豆肽具有很强的抗氧化活
性，大豆肽的
疏水性基团暴露出来，这种结构变化和被活化的组氨酸、络氨酸等活性物质使大豆肽能螯合金属离子、清除自由基和超氧阴离子，从而延缓机体衰老，减少各种老年性疾病的发生。

大豆蛋白肽的抗氧化能力与肽链的长度、氨基酸的种类和序列以及蛋白酶的种类等都有关系。

张莉莉等用SephadexG-25 分离了大豆蛋白酶解产物，得到的6个组分中，肽链长度为4 的肽段清除羟自由基的能力最强。

2.7其他生理活性功能研究表明，大豆蛋白活性肽还具有抗疲
劳、抗辐射、减肥等
功能。