微生物的纯培养及显微技术
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2 微生物的纯培养和显微技术
2 、 扫描电镜 （ scanning electron microscope, SEM ）
电子束做电子探针在样品表面激发出二 次电子， 二次电子产生的多少与样品表面立体 形貌有关。对 二次电子处理，在荧光屏呈现放 大样品立体图像。 主要用于观察微生物的表面 三、显微镜观察样品的制备 结构。
1 、光学显微镜制样 2 、电子显微镜制样
4m 0m 焦f 距 （ ） 12m 70 m 工离 作 距 4 n光 蓝 2 µ 5 m源 0 . m 3 （ 光的率 ）分 时辨
2 、 特殊功能的光学显微镜
名称 普通光学镜 光源 可见光 特殊装置 视野 亮 样品处理与观 应用 察 染色、清晰 形态结构 观察
暗视野镜 相差镜
可见光 特殊聚光 器 可见光 环状光阑 ，相差板 短波光 滤光片
基分离
富集培养 目的菌验证
选择培养
练习思考题：
利用选择培养基如何筛选： （ 1 ）抗链霉素（ str ）细菌？ （ 2 ）降解利用尿素的细菌？ （ 3 ）分解利用纤维素的细菌 ？ 利用富集培养和选择培养如何分离： （ 1 ） 如何从土壤中分离筛选高温（ 70℃ ）解烃细菌？ （ 2 ） 如何从污染废水中分离筛选苯胺降解细菌？
同一 稀释度 培养 20 支
生长者为纯培养物
三、单细胞（孢子）分离
营养琼脂平板不能形成菌落的微生物 解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子 ） 显微镜下用显微操作仪挑选单细胞（孢 子） 操作难度与单细胞（孢子）大小成反比
四、选择培养分离
原理： 创造适于目的微生物生长条件 促使目的微生物快速生长成优势菌 抑制非目的微生物生长 从混杂微生物中选择分离目的微生物 1 、 利用选择培养基直接分离目的微生物 选择培养基（ selective medium ） 只允许特定微生物生长，而同时抑 制或阻止其它微生物生长的培养基。
第二章微生物的纯培养和显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术第二章微生物的纯培养和显微技术第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术。
1、微生物培养的常用器具及其灭菌（1）试管、玻璃烧瓶、培养皿。
（2）高压蒸汽灭菌，杀灭所有的微生物，包括休眠体，同时可保持培养基的营养成分不被破坏。
（3）高温干热灭菌。
2、接种操作无菌条件下，用接种环在火焰附近进行操作，或在无菌操作箱或操作室内进行。
二、用固体培养基获得纯培养1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
2、涂布平板法3、稀释倒平板法4、平板划线法5、稀释摇管法对氧气更加敏感的厌氧型微生物。
先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化后冷却，将微生物进行梯度稀释，冷凝后，在琼脂表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基隔开。
三、用液体培养基获得纯培养对一些个体大的细菌、许多原生动物、藻类。
稀释法。
接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。
经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。
只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。
四、单细胞（孢子）分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。
较大的微生物较容易，个体较小的较难。
对较大微生物，用毛细管提取个体，在低倍显微镜下操作；对较小微生物，采用显微操作仪。
五、选择培养根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，培养一段时间后，通过平板稀释等方法进行纯培养分离。
1、选择平板培养2、富集培养制定特定的环境，使仅适应于该条件的微生物生长。
第二章 微生物的纯培养与显微技术
4、稀释摇管法（dilution shake culture method）
四 、液体培养基分离纯培养
1、原因
不是所有的微生物都能在固体培养基上生 长 。例如：许多原生动物、藻类、大细胞细菌 等。
2、方法
稀释法 （必须在同一个稀释度的许多平行试 管中，应超过95%表现为不生长）
五、单细胞（孢子）分离
有性繁殖：细菌结合
conjugation
2、放线菌
1）菌丝形态： 营养菌丝、气生菌丝和孢子丝（鉴定指标）
Chain of conidiospores
Aerial hyphae
Agar surface
Substrate mycelium
孢子丝不同形态
3、古生菌
古生菌与细菌具有类似的个体形态，但它们多生活 于一些生存条件十分恶劣的极端环境中，例如高温、 高盐、高酸等 。
直接采取显微分离法从混杂群体中 直接分离单个细胞或单个个体进行培 养以获得纯培养。
六、选择培养分离
（一）原因：
1、单一培养不能满足所有微生物生长。 2、微生物对培养条件的选择。 3、微生物对营养的竟争。
（二）分离方法 1、利用选择平板进行直接分离
依据：利用微生物自身特点选择分离条件，如 耐高温、产特殊酶类等。
高压蒸汽灭菌锅
超净工作台
三、固体培养基分离纯培养
（一）相关概念
1、菌落（colony） ：单个微生物在
适宜的固体培养基表面或内部生长、繁 殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有 一定形态结构的子细胞生长群体 。
2、菌苔（lawn） ：当固体培养基表
面众多菌落连成一片时，便成为菌苔 。
细菌菌落形态
（二）微生物分离的手段
微生物纯培养和显微技术
电子束光刻（EBL）：利用电子束在样品表面进行光刻， 用于制备纳米级结构。
● 扫 描 隧 道 显微镜（STM） ：利用隧道效 应，通过扫描 样品表面，获 取样品表面的 形貌和结构信 息。 ● 原子力显微镜（AFM）：利用原子力显微镜探针与样品表面的相互作用，通过扫描样品表面，获取样品表面的形貌和结构
谢过程。
纯培养的应用： 在医学、生物 学、食品工业 等领域都有广
泛的应用。
纯培养的方法： 包括稀释法、 平板划线法、 液体培养法等。
培养基制备：制备适合微 生物生长的培养基
培养：在适宜的温度、湿 度和光照条件下培养微生
物
分离：将不同种类的微生 物分离开来，如使用划线
法、涂布法等
取样：从环境中采集微 生物样品
电子探针（EPMA）：利用电子束激发样品表面，通过分 析电子信号获得样品的化学成分和结构信息。
电子能谱仪（ESCA）：利用电子束激发样品表面，通过 分析电子信号获得样品的化学成分和电子结构信息。
电子束诱导电流（EBIC）：利用电子束激发样品表面，通 过分析电流信号获得样品的电学性质和结构信息。
缺点：需要较高的 技术水平和设备， 操作难度较大
优点：可以观察到 微观世界的动态变 化，如细胞分裂、 生长、死亡等
缺点：需要较长的 时间进行观察，需 要耐心和细心
显微镜的种类和 原理
光学显微镜的种类：普通光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、偏光显微镜等
光学显微镜的原理：利用光的折射和反射原理，通过透镜将微小物体放大
观察微生物生长： 通过光学显微镜可 以观察到微生物的 生长过程、生长速 度等特征。
观察微生物繁殖： 通过光学显微镜可 以观察到微生物的 繁殖方式、繁殖速 度等特征。
观察微生物形态：电子显微镜可以清晰地观察到微生物的形态、大小和结构，为微生物分 类和鉴定提供依据。
● 扫 描 隧 道 显微镜（STM） ：利用隧道效 应，通过扫描 样品表面，获 取样品表面的 形貌和结构信 息。 ● 原子力显微镜（AFM）：利用原子力显微镜探针与样品表面的相互作用，通过扫描样品表面，获取样品表面的形貌和结构
谢过程。
纯培养的应用： 在医学、生物 学、食品工业 等领域都有广
泛的应用。
纯培养的方法： 包括稀释法、 平板划线法、 液体培养法等。
培养基制备：制备适合微 生物生长的培养基
培养：在适宜的温度、湿 度和光照条件下培养微生
物
分离：将不同种类的微生 物分离开来，如使用划线
法、涂布法等
取样：从环境中采集微 生物样品
电子探针（EPMA）：利用电子束激发样品表面，通过分 析电子信号获得样品的化学成分和结构信息。
电子能谱仪（ESCA）：利用电子束激发样品表面，通过 分析电子信号获得样品的化学成分和电子结构信息。
电子束诱导电流（EBIC）：利用电子束激发样品表面，通 过分析电流信号获得样品的电学性质和结构信息。
缺点：需要较高的 技术水平和设备， 操作难度较大
优点：可以观察到 微观世界的动态变 化，如细胞分裂、 生长、死亡等
缺点：需要较长的 时间进行观察，需 要耐心和细心
显微镜的种类和 原理
光学显微镜的种类：普通光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、偏光显微镜等
光学显微镜的原理：利用光的折射和反射原理，通过透镜将微小物体放大
观察微生物生长： 通过光学显微镜可 以观察到微生物的 生长过程、生长速 度等特征。
观察微生物繁殖： 通过光学显微镜可 以观察到微生物的 繁殖方式、繁殖速 度等特征。
观察微生物形态：电子显微镜可以清晰地观察到微生物的形态、大小和结构，为微生物分 类和鉴定提供依据。
《纯培养和显微技术》课件
聚焦
通过旋转物镜或移动载物台，使样本清晰地呈现 在观察者眼前。
放大倍数选择
根据需要选择适当的放大倍数，以便观察样本的 细节。
观察与记录
观察
观察样本，记录所观察到的特征和细节。
拍照记录
使用显微镜自带的拍照功能或外部相机拍摄样本照片，以便后续分 析和研究。
记录整理
将观察结果和照片整理成完整的实验报告或数据记录。
电子显微镜原理
利用电子束代替光线，通过电磁 透镜将电子束聚焦在样本上，然 后通过荧光屏或CCD相机将样本 的图像呈现给观察者。
显微技术的应用场景
生物学研究
用于观察细胞、组织、 微生物等的结构和形态
。
医学诊断
用于观察病理切片、细 胞涂片等的结构和形态 ，辅助医生进行疾病诊
断。
环境监测
用于观察水体、土壤、 空气等的微小颗粒和微 生物，评估环境质量。
微生物的繁殖原理
微生物在适宜的条件下进行生长繁殖，通过不断的分裂和代谢活动，最终形成 大量的微生物细胞。控制培养条件可以控制微生物的生长速度和代谢产物，以 满足不同研究和应用的需求。
纯培养技术的应用场景
微生物分类学研究
通过纯培养技术获得单一或少数 几种微生物，可以更好地研究其 形态、生理生化特性等，为微生
纯培养技术的重要性
纯培养技术是微生物学研究和应用的基础，通过该技术可以 获得单一或少数几种微生物，以便更好地研究其生物学特性 、生长繁殖条件、代谢产物等，为工业生产、生物工程等领 域提供技术支持。
纯培养技术的原理
微生物的分离原理
通过在选择性培养基上接种混合微生物，根据不同微生物对营养、pH、温度 等条件的需求不同，选择适合某一或少数几种微生物生长的条件，使其他微生 物无法生长，从而获得单一或少数几种微生物的纯培养。
通过旋转物镜或移动载物台，使样本清晰地呈现 在观察者眼前。
放大倍数选择
根据需要选择适当的放大倍数，以便观察样本的 细节。
观察与记录
观察
观察样本，记录所观察到的特征和细节。
拍照记录
使用显微镜自带的拍照功能或外部相机拍摄样本照片，以便后续分 析和研究。
记录整理
将观察结果和照片整理成完整的实验报告或数据记录。
电子显微镜原理
利用电子束代替光线，通过电磁 透镜将电子束聚焦在样本上，然 后通过荧光屏或CCD相机将样本 的图像呈现给观察者。
显微技术的应用场景
生物学研究
用于观察细胞、组织、 微生物等的结构和形态
。
医学诊断
用于观察病理切片、细 胞涂片等的结构和形态 ，辅助医生进行疾病诊
断。
环境监测
用于观察水体、土壤、 空气等的微小颗粒和微 生物，评估环境质量。
微生物的繁殖原理
微生物在适宜的条件下进行生长繁殖，通过不断的分裂和代谢活动，最终形成 大量的微生物细胞。控制培养条件可以控制微生物的生长速度和代谢产物，以 满足不同研究和应用的需求。
纯培养技术的应用场景
微生物分类学研究
通过纯培养技术获得单一或少数 几种微生物，可以更好地研究其 形态、生理生化特性等，为微生
纯培养技术的重要性
纯培养技术是微生物学研究和应用的基础，通过该技术可以 获得单一或少数几种微生物，以便更好地研究其生物学特性 、生长繁殖条件、代谢产物等，为工业生产、生物工程等领 域提供技术支持。
纯培养技术的原理
微生物的分离原理
通过在选择性培养基上接种混合微生物，根据不同微生物对营养、pH、温度 等条件的需求不同，选择适合某一或少数几种微生物生长的条件，使其他微生 物无法生长，从而获得单一或少数几种微生物的纯培养。
第二章微生物的纯培养和显微技术
第一节 微生物的分离和纯培养 第二节 显微镜和显微技术 第三节 显微镜下的微生物
第一节 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术（aseptic technique）
1、概念：在分离、转接及培养纯培养物时 防止其被其他微生物污染，其自身也不污染操 作环境的技术。 2、方法：器具、培养基及其灭菌
接种操作——无菌操作
菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同， 给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。
保藏的方法： 传代培养保藏 4℃ 冷冻保藏 -196℃，-70℃，-30～-20℃ 干燥保藏法 沙土管，安瓿管（冷冻真
空干燥保藏，最普遍最重要）
第二节 显微镜和显微技术
绝大多数微生物的大小都远远低于肉眼的观察 极限，因此一般必须借助显微镜放大系统的作用， 才能看到它们的个体形态和内部结构。
除了放大外，决定显微观察效果的还有两个重 要因素，分辨率和反差。分辨率是指能辨别两点之 间最小距离的能力，而反差是指样品区别于背景的 程度，它们与显微镜的自身特点有关，也取决于进 行显微观察时对显微镜的正确使用以及良好的标本 制作和观察技术，这就是显微技术。
现代显微技术不仅仅是观察物体的形态、 结构，而且发展到对物体的组成成分的定性 和定量，特别是与计算机技术结合出现的图 像分析、模拟仿真等技术，为探索微生物的 奥秘提供了强大武器。
五、选择培养
1、选择平板培养 根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件 （对于从自然界中分离、寻找有用的微生物十分 重要，如从土壤中筛选蛋白酶产生菌，分离高温 菌，分离某种抗菌素抗性菌株）
2、富集培养 加富性选择培养基（投其所好）--对羟基苯甲酸 抑制性选择培养基（取其所抗）--致病性肠道杆菌
六、微生物的保藏技术
第一章微生物的纯培养和显微技术
一个细胞或一种细胞 群繁殖得到的后代，称为纯培养。
• 混合培养物：含有两种以上微生物的培养物。 • 二元培养物：只含有二种微生物，并保持二者之间特定关系的培
养物。
• 平板（culture plate）：即培养平板的简称，指熔化的固体培
养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。
• 菌落（colony）：生长在固体培养基表面或内部，来源于一个细
三.微生物的保藏技术
• （一）保藏目的 • 在菌种一定时间内不死亡、不变异（丢失重要的生物学性 状）、不被污染。 • （二）保藏原理 • 根据微生物的生理生化特性，人工创造不适宜微生物生长 繁殖的条件，降低代谢能力，以保持其遗传性、减少变异 性，达到长期保藏的目的。
休眠或 半休眠
• （三）保藏方法 1.低温保藏法： （1）传代培养保藏(冰箱保藏法、定期移植法） （2）超低温保藏法 液氮（-195℃） 低温冰箱 2.干燥保藏法： 沙土管保藏法 3.隔绝空气保藏法 冷冻真空干燥保藏法
环等
• 方法：这些器具在灭菌前须先进行包扎或装入特定容器中。
（1）高压蒸汽灭菌 （2）高温干热灭菌 （3）烧灼灭菌 0.1MPa 121.3℃ 15~30m养基的灭菌： 高压蒸汽灭菌 过滤灭菌：适于不耐温的材料 3.无菌操作： 在火焰旁或无菌箱、超净工作台上操作。
胞、具有一定形态结构的、肉眼可见的子细胞群体。
• 菌苔（lawn）：众多菌落在固体培养基表面连成一片时，称为菌
苔。
一. 纯培养的分离方法
（一） 稀释法
• 1.固体稀释倒平板法：
• 将待分离材料作一系列稀释（1/10，1/100， 1/1000，…）， →取不同吸收液各少许与已 熔化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，→ 摇匀后倾入灭菌过的培养皿中→凝固后保温培 养一定时间→挑取单个菌落，重复以上过程→ 获得纯培养。
• 混合培养物：含有两种以上微生物的培养物。 • 二元培养物：只含有二种微生物，并保持二者之间特定关系的培
养物。
• 平板（culture plate）：即培养平板的简称，指熔化的固体培
养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。
• 菌落（colony）：生长在固体培养基表面或内部，来源于一个细
三.微生物的保藏技术
• （一）保藏目的 • 在菌种一定时间内不死亡、不变异（丢失重要的生物学性 状）、不被污染。 • （二）保藏原理 • 根据微生物的生理生化特性，人工创造不适宜微生物生长 繁殖的条件，降低代谢能力，以保持其遗传性、减少变异 性，达到长期保藏的目的。
休眠或 半休眠
• （三）保藏方法 1.低温保藏法： （1）传代培养保藏(冰箱保藏法、定期移植法） （2）超低温保藏法 液氮（-195℃） 低温冰箱 2.干燥保藏法： 沙土管保藏法 3.隔绝空气保藏法 冷冻真空干燥保藏法
环等
• 方法：这些器具在灭菌前须先进行包扎或装入特定容器中。
（1）高压蒸汽灭菌 （2）高温干热灭菌 （3）烧灼灭菌 0.1MPa 121.3℃ 15~30m养基的灭菌： 高压蒸汽灭菌 过滤灭菌：适于不耐温的材料 3.无菌操作： 在火焰旁或无菌箱、超净工作台上操作。
胞、具有一定形态结构的、肉眼可见的子细胞群体。
• 菌苔（lawn）：众多菌落在固体培养基表面连成一片时，称为菌
苔。
一. 纯培养的分离方法
（一） 稀释法
• 1.固体稀释倒平板法：
• 将待分离材料作一系列稀释（1/10，1/100， 1/1000，…）， →取不同吸收液各少许与已 熔化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，→ 摇匀后倾入灭菌过的培养皿中→凝固后保温培 养一定时间→挑取单个菌落，重复以上过程→ 获得纯培养。
第二章 微生物的纯培养和显微技术
常用的菌种保藏法
3、干燥包藏法 沙土管保存：适用于产孢子的微生物，如 沙土管保存：适用于产孢子的微生物，如 芽孢杆菌，放线菌等。菌种至 斜面长出大量孢子后，洗下孢子，制悬液， 加入无菌的沙土试管中，减压干燥，至水 分抽干，最后用石蜡、胶塞等 封闭试管口，于冰箱中保存。 冷冻真空干燥：加保护剂、冷冻、低温干 冷冻真空干燥：加保护剂、冷冻、低温干 燥
常用固体培养基纯培养获得方法
1、稀释倒平板法（pour plate method） 稀释倒平板法（ method） 将分离物稀释→取少量与50℃ 将分离物稀释→取少量与50℃熔化态琼脂 培养基混合，摇匀→倒平板→培养→ 培养基混合，摇匀→倒平板→培养→稀释 得当会有单个菌落→ 得当会有单个菌落→挑单个菌落，重复以 上操作得纯培养 缺点：热效菌不适用，严格好氧菌生长受 影响
1、微生物培养的常用器皿及其灭菌
（2）湿热灭菌： ①间歇灭菌：100℃ 15-30min①间歇灭菌：100℃，15-30min-冷却 282837℃培养24h（重复此过程3次） 37℃培养24h（重复此过程3 ②高压蒸汽灭菌：121℃ 15-30min，通常 ②高压蒸汽灭菌：121℃，15-30min，通常 20min，装于三角瓶、试管中的培养基的灭 20min，装于三角瓶、试管中的培养基的灭 菌，采用适宜塞子塞好，防止染菌。
常用的菌种保藏法
1、传代培养保藏 保存时间因菌种不同，可数周至数年（一般3个月） 保存时间因菌种不同，可数周至数年（一般3 缺点：繁琐，易染菌，菌种衰退快 2、冷冻保藏 将微生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止以达 保藏目的，一般-70℃ 保藏目的，一般-70℃冰箱保藏。 操作注意点：低温使细胞内水分形成冰晶，从而 引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。采取速冻法 （冰晶小而减少损伤）升温时，冰晶会长大，要 快速升温。