第二章微生物的纯培养和显微技术
第二章微生物纯培养
毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微 生物。
显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢 子以获得纯培养。
小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在
显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的
分离。
第二章微生物纯培养
五、选择培养
为了从混杂的微生物群体中分离出某种 微生物，可以根据该微生物的特点，包括营 养、生理、生长条件等，采用选择培养的方 法进行分离。
1、涂布平板法（Spread Plate method）
步骤： 制板 稀释 加菌液 涂布 特点：简单易行，但易造成机械损伤
培养 挑菌落
第二章微生物纯培养
2、稀释倒平板法
步骤： 稀释 加菌液 浇培养基 培养
挑菌落
第二章微生物纯培养
1.取样
25g或25ml 检样
稀释样品的取样和倾注平皿
1mL
1mL
第二章微生物纯培养
2、富集培养
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同， 制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物 旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更 容易从混杂的群体中分离到特定的微生物。
富集条件可从多方面选择，如温度、pH、紫外 线、高压、光照、氧气、营养等等。
例如：分离产芽孢细菌，可以对样品进行高温处 理，然后再进行培养。
第二章微生物纯培养
第二章微生物纯培养
六、微生物的保藏技术
基本要求：
保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被 杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。
用于长期保藏的原始菌种称为
保藏菌种或原种（stoch culture）。
第二章微生物纯培养
2 微生物的纯培养和显微技术
2 、 扫描电镜 （ scanning electron microscope, SEM ）
电子束做电子探针在样品表面激发出二 次电子， 二次电子产生的多少与样品表面立体 形貌有关。对 二次电子处理，在荧光屏呈现放 大样品立体图像。 主要用于观察微生物的表面 三、显微镜观察样品的制备 结构。
1 、光学显微镜制样 2 、电子显微镜制样
4m 0m 焦f 距 （ ） 12m 70 m 工离 作 距 4 n光 蓝 2 µ 5 m源 0 . m 3 （ 光的率 ）分 时辨
2 、 特殊功能的光学显微镜
名称 普通光学镜 光源 可见光 特殊装置 视野 亮 样品处理与观 应用 察 染色、清晰 形态结构 观察
暗视野镜 相差镜
可见光 特殊聚光 器 可见光 环状光阑 ，相差板 短波光 滤光片
基分离
富集培养 目的菌验证
选择培养
练习思考题：
利用选择培养基如何筛选： （ 1 ）抗链霉素（ str ）细菌？ （ 2 ）降解利用尿素的细菌？ （ 3 ）分解利用纤维素的细菌 ？ 利用富集培养和选择培养如何分离： （ 1 ） 如何从土壤中分离筛选高温（ 70℃ ）解烃细菌？ （ 2 ） 如何从污染废水中分离筛选苯胺降解细菌？
同一 稀释度 培养 20 支
生长者为纯培养物
三、单细胞（孢子）分离
营养琼脂平板不能形成菌落的微生物 解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子 ） 显微镜下用显微操作仪挑选单细胞（孢 子） 操作难度与单细胞（孢子）大小成反比
四、选择培养分离
原理： 创造适于目的微生物生长条件 促使目的微生物快速生长成优势菌 抑制非目的微生物生长 从混杂微生物中选择分离目的微生物 1 、 利用选择培养基直接分离目的微生物 选择培养基（ selective medium ） 只允许特定微生物生长，而同时抑 制或阻止其它微生物生长的培养基。
第二章微生物的纯培养和显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术第二章微生物的纯培养和显微技术第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术。
1、微生物培养的常用器具及其灭菌（1）试管、玻璃烧瓶、培养皿。
（2）高压蒸汽灭菌，杀灭所有的微生物，包括休眠体，同时可保持培养基的营养成分不被破坏。
（3）高温干热灭菌。
2、接种操作无菌条件下，用接种环在火焰附近进行操作，或在无菌操作箱或操作室内进行。
二、用固体培养基获得纯培养1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
2、涂布平板法3、稀释倒平板法4、平板划线法5、稀释摇管法对氧气更加敏感的厌氧型微生物。
先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化后冷却，将微生物进行梯度稀释，冷凝后，在琼脂表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基隔开。
三、用液体培养基获得纯培养对一些个体大的细菌、许多原生动物、藻类。
稀释法。
接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。
经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。
只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。
四、单细胞（孢子）分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。
较大的微生物较容易，个体较小的较难。
对较大微生物，用毛细管提取个体，在低倍显微镜下操作；对较小微生物，采用显微操作仪。
五、选择培养根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，培养一段时间后，通过平板稀释等方法进行纯培养分离。
1、选择平板培养2、富集培养制定特定的环境，使仅适应于该条件的微生物生长。
第二章 微生物的纯培养与显微技术
4、稀释摇管法（dilution shake culture method）
四 、液体培养基分离纯培养
1、原因
不是所有的微生物都能在固体培养基上生 长 。例如：许多原生动物、藻类、大细胞细菌 等。
2、方法
稀释法 （必须在同一个稀释度的许多平行试 管中，应超过95%表现为不生长）
五、单细胞（孢子）分离
有性繁殖：细菌结合
conjugation
2、放线菌
1）菌丝形态： 营养菌丝、气生菌丝和孢子丝（鉴定指标）
Chain of conidiospores
Aerial hyphae
Agar surface
Substrate mycelium
孢子丝不同形态
3、古生菌
古生菌与细菌具有类似的个体形态，但它们多生活 于一些生存条件十分恶劣的极端环境中，例如高温、 高盐、高酸等 。
直接采取显微分离法从混杂群体中 直接分离单个细胞或单个个体进行培 养以获得纯培养。
六、选择培养分离
（一）原因：
1、单一培养不能满足所有微生物生长。 2、微生物对培养条件的选择。 3、微生物对营养的竟争。
（二）分离方法 1、利用选择平板进行直接分离
依据：利用微生物自身特点选择分离条件，如 耐高温、产特殊酶类等。
高压蒸汽灭菌锅
超净工作台
三、固体培养基分离纯培养
（一）相关概念
1、菌落（colony） ：单个微生物在
适宜的固体培养基表面或内部生长、繁 殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有 一定形态结构的子细胞生长群体 。
2、菌苔（lawn） ：当固体培养基表
面众多菌落连成一片时，便成为菌苔 。
细菌菌落形态
（二）微生物分离的手段
第二章 微生物的纯培养和显微技术
常用的菌种保藏法
3、干燥包藏法 沙土管保存：适用于产孢子的微生物，如 沙土管保存：适用于产孢子的微生物，如 芽孢杆菌，放线菌等。菌种至 斜面长出大量孢子后，洗下孢子，制悬液， 加入无菌的沙土试管中，减压干燥，至水 分抽干，最后用石蜡、胶塞等 封闭试管口，于冰箱中保存。 冷冻真空干燥：加保护剂、冷冻、低温干 冷冻真空干燥：加保护剂、冷冻、低温干 燥
常用固体培养基纯培养获得方法
1、稀释倒平板法（pour plate method） 稀释倒平板法（ method） 将分离物稀释→取少量与50℃ 将分离物稀释→取少量与50℃熔化态琼脂 培养基混合，摇匀→倒平板→培养→ 培养基混合，摇匀→倒平板→培养→稀释 得当会有单个菌落→ 得当会有单个菌落→挑单个菌落，重复以 上操作得纯培养 缺点：热效菌不适用，严格好氧菌生长受 影响
1、微生物培养的常用器皿及其灭菌
（2）湿热灭菌： ①间歇灭菌：100℃ 15-30min①间歇灭菌：100℃，15-30min-冷却 282837℃培养24h（重复此过程3次） 37℃培养24h（重复此过程3 ②高压蒸汽灭菌：121℃ 15-30min，通常 ②高压蒸汽灭菌：121℃，15-30min，通常 20min，装于三角瓶、试管中的培养基的灭 20min，装于三角瓶、试管中的培养基的灭 菌，采用适宜塞子塞好，防止染菌。
常用的菌种保藏法
1、传代培养保藏 保存时间因菌种不同，可数周至数年（一般3个月） 保存时间因菌种不同，可数周至数年（一般3 缺点：繁琐，易染菌，菌种衰退快 2、冷冻保藏 将微生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止以达 保藏目的，一般-70℃ 保藏目的，一般-70℃冰箱保藏。 操作注意点：低温使细胞内水分形成冰晶，从而 引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。采取速冻法 （冰晶小而减少损伤）升温时，冰晶会长大，要 快速升温。
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[精品]微生物的纯培养和显微镜技术第2章微生物的纯培养和显微镜技术重点、难点剖析1(无菌技术是最基本的微生物学实验操作技术，其核心是无菌概念的建立，以及正确而严格地按实验教材和实验课的要求，掌握在各种情况下的具体应用原则和操作规范。
2(分离获得某特定的微生物纯培养，是研究和利用微生物的基础。
获得纯培养的方法有固体培养基分离、液体培养基分离和单细胞挑取3大类(表2—1)，其中用固体培养基获得单独的微生物菌落是最常用、最基本的方法。
此外还有活细胞或活体分离法，如噬菌体和动植物病毒纯培养的分离等。
表2-1 获得微生物纯培养的方法比较方法特点应用菌落分离较为均匀，进行微生这3种方法可用于所有在固物计数结果相对准确。
但操作体培养基表面形成菌落的稀释倒平板法相对麻烦，热敏感菌有时易被微生物的纯培养分离。
并烫死，而严格好氧菌也可能被且，通过选用适当的选择平固体培养基分离固定在培养基中生长受到影响板及培养条件可直接分离各种具有特定生理特征的操作相对简单，是较常使用的微生物。
和厌氧罐或厌氧手常规方法。
但有时会因涂布不套箱技术结合，这3种方法涂布平板法均匀使某些部位的菌落不能分也可用于获得各种厌氧开，进行微生物计数时需对稀菌的纯培养释和涂布过程的操作特别注意，否则不易得到准确结果平板划线法操作简单，多用于对已有纯培养的确认和再次分离稀释倒平板的一种变通形式，在缺乏专业的厌氧操作设稀释摇管法但由于菌落形成在琼脂柱的中备的情况下对严格厌氧菌间，观察和挑取都相对困难进行分离和观察工作量大，是否获得纯培养需不能或不易在固体培养基稀释法依靠统计学的推测上生长的微生物进行纯培养分离或数量统计一般不能直接获得微生物的纯1)根据某种微生物的特殊液体培养基分离培养，在通过富集培养使原本生长要求，按照意愿从自然在自然环境中占少数的微生物界中对这种微生物进行有富集培养的数量大大提高后，需再通过针对性的有效分离;2)分离平板法进行相应富集培养微生培养出由科学家设计的特物纯培养的分离和检测定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长分离过程直观，可靠，但对仪从样品中直接分离所需的器和操作技术要求较高，多限微生物细胞或孢子，获得其单细胞(孢子)于高度专业化的研究，而挑取纯培养显微操作挑取的微生物单细胞或孢子需经固体或液体培养基培养后才能获得其纯培养物3(保证所用菌种性状的稳定是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
第二章微生物的纯培养和显微镜技术
第二章微生物的纯培养和显微镜技术2．纯培养和显微技术一、纯培养技术1、无菌技术包括两方面的内容：（1）用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；(2)在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身也不污染环境；2、分离纯化技术（1）固体培养基分离纯培养技术微生物个体微小，常以群体混合状态存在，将单个细胞从群体中分离出来，即纯培养。
菌落：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：众多菌落连成一片。
获得纯培养的方法有：倾注平板法：操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！涂布平板法：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！平板划线法：厌氧微生物的分离：（2）液体培养基分离纯培养稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。
（3）选择培养分离：抑制大多数其它微生物的生长；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。
使待分离的微生物生长“突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。
3、单细胞分离技术用显微操作仪，在显微镜下进行。
难度与细胞或个体的大小成反比，局限于高度专业化的科学研究中。
4、选择培养分离选择平板：抑制大多数微生物不能生长，或具区别特征的直观结果。
富集培养：造成有利于某种菌生长的环境。
（1）利用选择平板进行直接分离高温培养分离嗜热菌，培养基中不含有N，分离固氮菌；培养基中含有抗生素分离抗生菌。
牛奶培养基分离产蛋白酶菌株。
（2）富集培养利用不同微生物之间的生长特性不同，制定特定的环境条件，使仅适合条件的微生物旺盛生长，从而使其在为生物群落中的比率大大增大，易于从群落中间将墓地君主分离出来。
5、二元培养物培养物中只含有二种微生物，而且有意识地保持二者之间的特定关系的培养物。
如病毒与宿主；蛭弧菌与和E.coli.6、微生物的保藏技术影响微生物菌种稳定性的因素：a. 变异；b. 污染；c. 死亡基本要求：在一定时间内使菌株不死，、不变、不乱基本方法生活态：培养基传代培养（斜面、平板、半固体），多见于冰箱4℃培养。
微生物的纯培养和显微技术
只含有两种微生物，且有意识保持二者之间关系的培养物， 这是具有寄生、共生关系微生物的最有效保存途径。
选择培养基分离法
1 ml
1.dilute sample
9 ml
10
100 1000 104 105
106
107
高氏培养基 土豆培养基 牛肉膏培养基
7.微生物保藏技术
微生物纯培养物必须通过各种保藏技术使其在一定时间内 不死亡、不被污染、不变异、生物学性状不丢失，以保证微生 物学研究及应用工作顺利进行，因而微生物保藏技术也是保护 微生物资源的一项重要基础工作。
(1）菌种保藏技术的原理：根据微生物生理、生化特点，人 工创造条件，是微生物的代谢处于不活泼，生长繁殖受抑制的 休眠状态；主要三个条件是：低温、干燥和缺氧。
（2）保藏方法 ①传代培养保藏：斜面，半固体穿刺，液体等，可密封后冷 藏。
②沙土保藏：霉菌孢子及产芽孢细菌。
③真空冷冻干燥法保藏
④冷冻法：低温冷冻（-20℃），超低温，液氮；液体培养 物中常加15%左右甘油，速冻后保藏。
日本大阪发酵研究所(IFO)
斜面低温保藏法－－常用保藏法
• 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏， 如此连续不断。 此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏
此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6个月左右。
培养平板（culture plate，也称平板或平皿）：溶化的培 养基倒入无菌空平皿中，冷却凝固后盛有培养基的平皿。
（1）涂布平板法（Spread plate method） 适于大多数好氧微生物。
（2）稀释倒平皿法（Pour plate method）
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1. 稀释倒平板法（pour plate method） 先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如
1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然后分别 取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼 脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待 琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一 定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或 琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可 能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个 菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
12
接种方法：烧环—冷却—开管—沾菌和塞 管—开另管—涂菌—塞管—火焰烧环
要点：在火焰上方或附近 13
斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
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二、用固体培养基分离纯培养
概述
菌落：由单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部 生长、繁殖到一定程度后，形成肉眼可见的、有一定 形态结构的子细胞生长群体。
菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其
生长，因此在微生物学研究中更常用的纯
种分离方法是涂布平板法。
视频
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思考：两者的结果有什么不同？
22
平板划线分离法
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平板划线分离法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
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划线分离结果
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4、厌氧微生物的分离
稀释摇管法
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三、用液体培养基分离纯培养
待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制
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五、选择培养分离
1. 利用选择平板进行直接分离
牛奶平板：分离蛋白酶产生菌； 颜色反应：分离特定的菌株； 利用特定细菌的滑动特点进行
分离纯化；
待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物
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5·1用选择培养基进行直接分离 选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，
菌落的大小、形状、边缘状况、质地、光泽、颜色 及透明度等是微生物分类、鉴定的重要依据。 菌苔：固体培养基表面众多菌落连成一片，呈片状， 这就是菌苔。 平板：即培养平板，指盛有固体培养基的平皿。
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二自然界中，各种各样的微生物总 是混杂在一起的，要研究和利用某一微生物，就必须把它 同其他微生物分开，才能得到只含有同一种微生物的纯种 微生物。这种方法叫纯种微生物的分离
第二章 微生物的纯培养和显微技术
1
微生物的纯培养和显微技术
• 重点：微生物的分离和纯培养技术，常 用的菌种保藏方法。细菌、放线菌、霉 菌、酵母菌的形态特征。
2
第一节微生物的分离和纯培养
一、无菌技术
概述
（1）培养物：微生物学中，在人为规定的条件下培养、 繁殖得到的微生物群体称为培养物。
（2）纯培养物和纯培养的概念：微生物学中，将由一 个细胞（或一种微生物）繁殖所得到的后代称为纯培 养物。对微生物这种纯种的培养，称为微生物的纯培 养。
以抑制非需要菌的生长，促进需要菌的生 长，这种培养基叫选择培养基。 • 高氏一号培养基加10%酚数滴，抑制其它 菌的生 长，分离出放线菌 • 马丁氏培养基加链霉素以抑制其它菌生长， 分离出真菌。
33
蛋白酶产生菌的分离
34
具有氨苄青霉素抗性 的大肠杆菌
35
五、选择培养分离
5·2 富集培养：不同微生物间的有不同特点，根据这些特点 制定特定的环境条件，使需要的微生物生长旺盛，数量增 加，从而更容易分离到该微生物。
• 加富培养基：一般指在培养基内加入额外的营养物质，使 需要的微生物营养更充分，生长的更快，这种培养基叫加 富培养基。
20
2. 涂布平板法
其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌 平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一 定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板 表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散 至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落
由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中
再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而
且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧
4
试管及斜面培养物
5
培养皿
6
三角烧瓶
烧杯 玻璃吸管
7
高压蒸汽灭菌（P153）
8
干热灭菌
9
一、无菌技术
1·2接种操作 • 接种：在无菌条件下，用接种环或接种
针等工具把微生物从一个器皿转接到另 一个器皿，叫做接种。是最常用的基本 操作。
10
无菌操作环境
无菌箱和超净台 11
常用工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
稀释法：适用于原生动物和藻类的分 离和培养。 特 点：高度稀释、多做平行对照。 思考：有什么缺陷性？ 有些目的微生物尤其是含量较少的微 生物往往被稀释掉！ 此时可采用单细胞分离法。
27
四、单细胞分离
• 显微分离法——单细胞 分离法
• 用毛细管提取单个原生 动物个体
• 用显微操作仪分离单个细菌 单细胞分离器 • 适用于分离混杂微生物中弱势
（没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一 切生物 生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选 择性的。）
使待分离的微生物生长“突出”；
直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。30
五、选择培养分离
1. 利用选择平板进行直接分离
高温下培养：分离嗜热细菌； 培养基中不含N：分离固氮菌； 培养基加抗生素：分离抗性菌；
（3）无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止 其被其它微生物污染的技术称为无菌技术。
3
一、无菌技术
1·1微生物培养的常用器具及灭菌 • 常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等
注：所有器皿使用前都要灭菌！ • 培养基：培养微生物营养物质。
注：配制好后要及时灭菌。 • 常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌、
干热灭菌
群体。
28
五、选择培养分离 选择培养分离：根据微生物的营养、生理、 生长条件等特点，通过选择培养进行微生物 的分离与纯化技术。
29
五、选择培养分离
微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：
抑制大多数其它微生物的生长； 使待分离的微生物生长更快；
使待分离的微生物在群落中的数量上升， 方便用稀释法对其进行纯化。