实验四POD同工酶的提取分离活性测定

石峰
2.3 浓缩胶的制备： 按下表制备浓缩胶
试剂名称 浓缩胶缓 浓缩胶丙胶 冲液 贮液 体积比 1 2
取用量 1 2
AP
2 2
蔗糖
4 4
用滤纸吸干水→倒入浓缩胶→插入梳子→照光 →当胶色由黄变为白色表明聚合好。
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3、酶液的制备：
称取小麦幼苗茎部０.５g → 加样品提取液
1ml →于冰浴中研成匀浆→然后以2ml提取液分几
的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等 都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸 作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活 性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。 （2）电泳是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷 相反的电极方向移动的现象。
样本溶液 浓缩胶 分离胶 Tris-HCl Tris-HCl Tris-HCl
5 下层 (正极)缓冲液 Tris-glycine
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(2) 不连续系统中的三种物理效应：
①电荷效应：
酶蛋白按其所带电荷的种类及电量，在电场作用下 向一定的电极以一定的速度泳动。 ② 分子筛效应: 相对分子质量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的 分离胶时，所受阻力程度不同，表现出不同的迁移率。 ③浓缩效应: 使待分离样品中的各组分在浓缩胶中被压缩成层。
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三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：小麦苗 2、仪器、器皿：
(1)垂直板电泳装置 （电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子等）； (2) 电泳仪； （4）电子天平； （3）高速冷冻离心机； （5）瓷盘、微量进样器；
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3、试剂： （1）1N HCl：用12N的浓盐酸来配制； （2）分离胶缓冲液（pH8.9的Tris-HCl缓冲液）：
液10分钟 → 倒去固定液 → 加显色液（联苯
胺），显色→观察记录。
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5、凝胶的质量决定因素：
（1）凝胶度： 是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联剂 （Bis）的总克数，用T%表示。 （2）交联度： 是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量 的百分数，用C%表示。 一般浓缩胶的浓度为7.5%，分离胶的浓度为10%。
（3）浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HCl缓冲液）：
（4）分离胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液Ⅰ）： （5）浓缩胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液Ⅱ）： （6）过硫酸铵溶液（NH4）2S2O8简写Ap：（当天配制）； （7）核黄素溶液： （8）电极缓冲液：（pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液） （9）40%蔗糖：
Please be quiet, 上课了！！！
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实验二 过氧化物酶同工酶的提取、分离
学时：9
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一、实验目的：
1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法； 2、掌握同工酶的概念；
3、了解过氧化物酶(POD)的生物学功能
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二、实验原理:
1、同工酶和电泳概念：
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四、实验步骤：
1、贮液的配制： 2、凝胶的制备：
2.1 胶板的制备： 2.2 分离胶的制备： 2.3 浓缩胶的制备：
3、酶液的制备： 4、装槽、点样：
5、电泳：
6、剥胶、固定、染色：
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2.1 胶板的制备：
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（10）pH4.7乙酸缓冲液：
（11）样品提取液：
（12）0.5%的溴酚蓝：0.5g溶于100ml无离子水；
（13）过氧化物酶同工酶联苯胺染色液：
1g联苯胺加9ml冰醋酸，溶解后加36ml水用时加
160ml水,加Vc140.8mg,加几滴30%过氧化氢原液。联 苯胺是致癌物质，称取时应戴手套；
（1）三个不连续性的表现：
①凝胶由上下两层组成，两层凝胶的孔径不同；
②缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同；
③在电场中形成不连续的电位梯度。
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不连续PAGE电泳胶体系统的组成：
电泳系统 缓冲液 pH
8.3 8.0 6.7 8.9 8.3
胶体浓度
5% 7% -
1 上层 (负极)缓冲液 Tris-glycine 2 3 4
(3)凝胶的质量决定因素：
（1）凝胶度：
是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联剂
（Bis）的总克数，用T%表示。
（2）交联度：
是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的 百分数，用C%表示。 一般浓缩胶的浓度为7.5%，分离胶的浓度为10%。
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6、不连续PAGE的原理：
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2.2 分离胶的制备：
按下表制备分离胶
试剂名称 分离胶缓 分离胶丙 冲液 胶贮液
体积比 取用量 （ml） 1 3 2 6
Ap
4 12
无离子水
1 3
胶灌至距梳子下端1cm →灌毕→封上一层水加 速聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。
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2、影响电泳的主要因素：
（1）带电颗粒的大小和形状： 颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快； （2）颗粒的电荷数： 电荷越少，电泳速度越慢，反之越快； （3） 溶液的粘度： 粘度越大，电泳速度越慢，反之越快； （4）溶液的pH值： 影响被分离物质的等电点，离等电点越近，电 泳速度越慢，反之越快；
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★浓缩效应产生的原因：
（1）两层胶的孔径不同:酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力 突然加大，速度变慢。这样，就在两层凝胶交界处使待分离的酶 蛋白区带变窄，浓度升高。
（2）浓缩胶中产生不连续的电位梯度:在聚丙烯酰胺凝胶中用的都 是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶的pH为6.7，下层分离胶的pH 为8.9。HCl为强电解质，不管在哪层胶中几乎全部电离，Cl布满 整个胶,待分离的酶蛋白加在点样孔，浸在pH8.3Tris-甘氨酸缓 冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl迅速跑到最前面，成 为快离子，在pH为6.7条件下解离度非常小甘氨酸有效泳动率最 低，跑到最后面，成为慢离子，这样在，快慢离子之间就形成一 个不断移动的界面。在pH为6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其 有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布在界面附近，逐渐形 成一个区带。
③ 网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使 凝胶具有抗对流的作用；
④ 长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶； ⑤ 该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。
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■ 聚合反应：
聚合反应
free radical
Bis
架桥物造成分枝
交错连结
Bis
端点自由基 可再延续
自由基形成
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基，能够激活丙烯酰胺单体形成单体长链。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来
制备分离胶。
（2）光聚合： 光聚合法的催化剂是核黄素（VB2 ），光聚合形成
的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
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(2)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起； ② 链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分 子筛的性质；
4.2 点样：
轻拔电泳梳子→用微量进样器点样→每孔约30μl。
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5、电泳：
接通电源 → 稳流 → 调节电流到每孔 1mA左右 → 当溴酚蓝前沿进入分离胶后， 可适当加大电流 → 待前沿下行到距胶末 1cm处，停止电泳。
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6、剥胶、固定、染色： 将凝胶板取下 → 放入装水瓷盘中 → 剥 下胶片→ 并浸洗二次 →倒去水→加入固定
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（5）电场强度：
电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；
（6）离子强度：
离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； （7）支持物筛孔大小： 孔径小，电泳速度慢，反之则快。
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3、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为
载体的一种电泳技术。这种凝胶是由丙烯酰胺单
体（Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis） 在催化剂作用下且具有自由基的体系时，就会聚 合。 引发产生自由基的方法有两种： （1）化学法 （2）光聚合法。
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（1）化学聚合：
引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N、N－四
甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸
次洗入离心管→在高速离心机上以８０００r/min， 离心10min →倒出上清液，加入等量加样缓冲液→ 低温放置待用。
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4.1 装槽：
取出胶板下端胶条→用滤纸搽净凡士 林油→将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向
内） →上下槽装电极缓冲液。
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2、影响电泳的主要因素：
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 4、聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
5、凝胶的质量决定因素：
6、不连续PAGE的原理： （1）三个不连续性的表现：

(2) 不连续系统中的三种物理效应：