酿酒酵母高效自主复制区的筛选与鉴定
中国酿酒酵母菌的研究不同酒类酵母筛选与应用纪实
2、酿酒酵母菌的发酵机制研究
对于酿酒酵母菌的发酵机制，中国的研究人员从分子水平上进行了深入研究。 他们发现，酿酒酵母菌的发酵过程受到多种基因的调控，这些基因在发酵过程 中的表达和调控机制对于提高酒的品质和产量具有重要作用。
3、酿酒酵母菌的基因组学研究
随着基因组学技术的发展，中国的研究人员对酿酒酵母菌的基因组进行了测序 和分析。他们发现，不同种类的酿酒酵母菌具有不同的基因组特征，这些特征 对于其发酵能力和品质具有重要影响。
中国酿酒酵母菌的研究——不同酒类酵 母筛选与应用纪实
01 引言
目录
02 相关技术
03 不同酒类酵母的筛选
ห้องสมุดไป่ตู้04 酵母应用的探索
05 结论
06 参考内容
引言
中国作为酒类饮料的生产和消费大国，酒类产业的发展一直备受。酿酒酵母菌 作为酒类发酵过程中的关键因素，对于酒类的品质、口感和风格具有重要影响。 因此，针对不同酒类的酵母筛选与应用研究，对于提高酒类产品的质量和生产 效率具有重要意义。
1、代谢指纹法能够快速、有效地鉴定酵母菌种的发酵性能，但需要专业的代 谢指纹分析设备和技术人员，成本较高。
2、基因组学方法能够从基因水平上揭示酵母菌种的性能和特点，但基因测序 费用昂贵，且需要大量的生物信息学分析。
3、表型筛选法操作简单、直观，可以结合传统的酿酒工艺进行筛选，但需要 耗费大量时间和人力，且有可能错过一些潜在的优质菌株。
2、啤酒类酵母筛选与应用
啤酒是世界上消费量最大的酒类之一，中国在啤酒酿造过程中也使用了多种酵 母菌。通过对不同来源的酵母菌进行筛选和应用研究，中国的研究人员发现了 适合于不同啤酒风格的酵母菌株。例如，一种名为“Beeran”的酵母菌株， 具有发酵温度低、发酵时间短、泡沫稳定等特点，被广泛应用于啤酒生产中。 此外，针对不同地区和消费群体的需求，研究人员还开发了相应的酵母菌株， 如低醇低热量型、高浓型等。
中高温大曲发酵过程酿酒酵母的筛选与鉴定
0引言酿酒酵母()是与人类关系最为广泛的一种酵母，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，还用于制作面包和馒头等食品及酿酒生产中[1]，因此酿酒酵母对于酿酒乃至人类的作用是不言而喻的。
本文首次联合利用TTC 显色实验、麸曲发酵力活力实验和液体酒精度发酵实验逐级筛的方法对中高温大曲发酵过程中的酿酒酵母菌进行了筛选及鉴定，一方面对中高温大曲的应用具有理论指导意义，更重要的是在逐步认清中高温大曲生物结构的同时，对于大曲机械化进程打下了夯实的研究基础。
1材料和方法1.1主要仪器及设备粉碎机，高压蒸汽灭菌锅，超净操作工作台，1ml 移液枪，200μL 移液枪，玻璃涂布棒，恒温培养箱，蒸馏装置，发酵栓。
1.2主要试剂及培养基孟加拉红培养基：蛋白胨5.0g ，葡萄糖10g ，磷酸二氢钾1.0g ，硫酸镁0.5g ，孟加拉红0.03g ，琼脂20g ，氯霉素0.1g ，水1000mL ，pH 7.2±0.2。
PDA 培养基：马铃薯200g ，葡萄糖20g ，琼脂中高温大曲发酵过程酿酒酵母的筛选与鉴定李燕荣，杨勇，张龙云，姜雷，谭洪弟，贾亚伟，郭风雪（江苏洋河股份有限公司，江苏宿迁223800）摘要:为了确立一种简单且高效筛选中高温大曲发酵过程中酿酒酵母的方法，利用TTC 显色实验对中高温大曲发酵过程中的22株酵母菌进行了产酒精能力初筛，并联合酵母菌麸曲发酵力和液态酒精发酵实验对初筛到的酵母菌株进行复筛和三级筛，最后通过分子生物学鉴定，确定4#和8#酵母菌株均为酿酒酵母（）。
首次对中高温大曲发酵全过程酵母菌的变迁做了较为细致的研究，将鉴定结果比对中高温大曲发酵过程酵母菌变迁表1可知，两株菌均分离自主发酵阶段。
4#菌来自于主发酵2d 曲心，8#菌分离于主发酵4d 的曲皮。
关键词：中高温大曲；酿酒酵母；TTC 显色中图分类号：TS262.3；TS261.15文献标识码：BScreening and Identification of During theFermentation of Medium-and High Temperature DaquLI Yanrong,YANG Yong,ZHANG Longyun,JIANG Lei,TAN Hongdi,JIA Yawei,GUO Fengxue(Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian 223800,Jiangsu,China)Abstract:In order to develop a simple and efficient screening method for cerevisiae cerevisiae in high-temperature daqu,this paper attempts to screen 20yeast strains during mid-high temperature daqu fermentation through TTC color development experiments.In combination with yeast gluten fermentation and liquid alcohol fermentation experiments,the yeast strains that were initially screened were re-screened and tertiary screened.Finally,through molecular biology identification,it was determined that both 4#and 8#yeast strains were Saccharomyces cerevisiae..And for the first time,the changes of yeast in the middle and high temperature hyperbolic fermentation process were studied in detail,and the identification results were compared to the yeast transition table in the fermentation process.4#bacteria come from the main fermentation 2D cleft,and 8#bacteria are separated from the main fermentation 4D cleft.Key words:medium and high temperature Daqu;Saccharomyces cerevisiae;TTC color display收稿日期：2020-03-07作者简介：李燕荣（1984.3.29-），女，江西抚州人，工程师，微生物学硕士，现工作于江苏洋河酒厂股份有限公司技术部，从事项目研究工作。
ARS302(酵母自主复制序列)
自主复制序列的分离与 自主复制序列的分离与 鉴定
一．分离ARS的一般程序 分离 的一般程序
染色体DNA→限制酶切 与整合型载体连接 转化相应的宿主细胞 分离纯化转化体 限制酶切→与整合型载体连接 转化相应的宿主细胞→分离纯化转化体 染色体 限制酶切 与整合型载体连接→转化相应的宿主细胞 *→分离各转化子总 分离各转化子总DNA→转化 转化E.coli→药物抗性菌落 分离质粒 药物抗性菌落→分离质粒 分离各转化子总 转化 药物抗性菌落 分离质粒DNA→重新转入宿主细 重新转入宿主细 胞→高频重组转化体 高频重组转化体 *在获得第一次转化体后，可利用下述方法淘汰掉全部因整合作用所形成的转化体： 在获得第一次转化体后，可利用下述方法淘汰掉全部因整合作用所形成的转化体： 在获得第一次转化体后
酵母自主复制序列（ARS302）
中文名称： 自主icating sequence; ARS 其他名称： ARS元件(ARS element) 定义1： 酵母细胞基因组中能够充当复制 起始位点的DNA序列。能够支持质粒在真 核细胞中进行独立复制。
二．ARS的分析与鉴定 的分析与鉴定
1．限制酶谱与次克隆 ． 2. 倒位分析
P E YRp7 YIp5+ARS1(1.4kb) H E E YRp7' H P E
3. 插入分析：将1.4Kb EcoRI片段分离出来，插入另一个 片段分离出来， 片段分离出来
整合载体，其重组 整合载体，其重组DNA分子的转化频率可大大提高 分子的转化频率可大大提高
P E P E H E H E
+
YIp1
HIS3 2000-4000 His+/ug DNA
4. 定位分析
H
H P Yp411 P E P YRp7 H E H E H YP411-HIS3
甘蔗汁酿酒酵母的筛选及特性
甘蔗汁酿酒酵母的筛选及特性
邓毛程;王瑶;李静;李亿祥
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2013(032)009
【摘要】为了筛选适宜于甘蔗果酒的酿酒酵母,综合采用了富集培养、平板分离、产酒与产香实验、起酵实验及耐乙醇特性实验等方法,从自然发酵甘蔗渣中筛选获得1株优良的酿酒酵母G05.菌株G05具有起酵快、耐乙醇性较强、产酒率高、香气明显等特点,最适发酵温度28℃和发酵最适pH值为5.0,在含糖200g/L的甘蔗汁培养基中的乙醇产量、总酯产量分别为10.8％vol和1.2g/L.
【总页数】3页(P54-56)
【作者】邓毛程;王瑶;李静;李亿祥
【作者单位】广东轻工职业技术学院,广东广州510300;五华县溢群酒业有限公司,广东梅州514400;广东轻工职业技术学院,广东广州510300;广东轻工职业技术学院,广东广州510300;五华县溢群酒业有限公司,广东梅州514400
【正文语种】中文
【中图分类】Q815
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野生猕猴桃果酒酵母的筛选鉴定及耐受性的研究
野生猕猴桃果酒酵母的筛选鉴定及耐受性的研究
徐清萍;朱广存
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2011(000)007
【摘要】文中主要筛选适合野生猕猴桃果酒发酵的酵母.通过显微镜观察和WL培养基的颜色变化,初筛出酵母菌136株.采用杜氏管发酵法,CO2失重比较法,猕猴桃果汁发酵法等从中复筛出两株发酵能力好、絮凝能力强、产香较好的菌株:YM-7和YM-210,初步鉴定均为酵母属的酿酒酵母.对YM-7菌种进行了耐受性研究,结果表明YM-7对葡萄糖、酒精度、酸度、NaC1和SO2具有较高耐受性,可作为野生猕猴桃发酵专用菌种或选育野生猕猴桃专用菌种的出发菌株.
【总页数】4页(P120-123)
【作者】徐清萍;朱广存
【作者单位】郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州450002;郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州450002
【正文语种】中文
【中图分类】TS261.1
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一种高效快速鉴定酵母转化子的酵母菌落PCR方法
・研究报告・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2013年第12期酿酒酵母是最简单的真核生物，同时又具有类似原核生物的生长特性，便于培养和进行遗传操作的优点，是一种模式真核生物和模式实验系统，被称为真核生物的“大肠杆菌”［1］。
它与人类的关系极为密切，是人类实践中应用较早的一类微生物［2］，同时它也被广泛用作基因克隆和表达的宿主菌。
为了鉴定克隆到酵母细胞内的外源基因，可以通过提取酵母基因组后通过PCR 扩增目的基因、与特异性底物形成水解圈、荧光基团、挑取单克隆进收稿日期： 2013-06-30基金项目：广东省科技计划（2012B020311005）作者简介：武可婧，女，硕士研究生，研究方向：微生物功能蛋白；E -mail ：wu.kejing@ 通讯作者：林蒋海，博士，副研究员，研究方向：基因工程，代谢工程；E -mail ：jianghai.lin@一种高效快速鉴定酵母转化子的酵母菌落PCR 方法武可婧 吕一鸣 李晶博 肖文娟 龚映雪 刘泽寰 林蒋海（暨南大学生命科学技术学院，广州 510632）摘 要： 酵母是一种重要的基因工程宿主菌，但是由于其细胞壁结构复杂牢固，普通的菌落PCR 方法的成功率较低。
为解决此问题，提供一种快速、简单、高效的酵母菌落PCR 方法。
该方法先利用溶壁酶溶解酵母细胞壁，然后利用热涨裂解细胞并进行PCR 反应。
此方法将酵母细胞裂解和PCR 在同一个PCR 管中完成。
试验结果显示此方法能成功扩增目的基因且成功率高。
将此方法应用于外源性内切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）的酿酒酵母转化子筛选，经与基因组PCR 比较，菌落PCR 与基因组PCR 结果一致。
结果证明此方法具有良好的稳定性，适用于酿酒酵母转化子的快速筛选。
关键词： 酿酒酵母 菌落PCR 转化子 阳性克隆A Rapid and Efficient Yeast Colony PCR Method to Identify PositiveTransformantsWu Kejing L ü Yiming Li Jingbo Xiao Wenjuan Gong Yingxue Liu Zehuan Lin Jianghai（School of Life Science and Technology ，Jinan University ，Guangzhou 510632）Abstract: Yeast is an important host microorganism in genetic engineering and molecular cloning. However, because of the complex structure of their cell wall, ordinary colony PCR method has a low success rate. To address this problem, a fast, simple and efficient yeast colony PCR method was provided. In the novel method, a commercial available cell wall degradation enzyme, lyticase, was used to disrupt yeast cell wall and the resulted protoblast was then bursted by heating. Into the lysis mixture, other PCR components were added and PCR reactions were performed. In the current constructed method, the yeast cell lysis and PCR reaction were performed in one single PCR tube, which is convenient and easy to implement. The success rate of the novel method was relatively high compared to traditional ones. Using this method, the Saccharomyces cerevisiae transformants of exogenous endoglucanase（EG）were screened. Compared to PCR using genomic DNA, the results of colony PCR were consistent with those from genomic PCR. The results indicated that the novel method was of good stability, repeatability and suitable for the rapid screening of the S. cerevisiae transformants.Key words: Saccharomyces cerevisiae Colony PCR Transformant Positive clone行菌落PCR 等一系列方法来鉴定酵母转化后的阳性克隆。
白酒酿造过程中耐高糖酵母的筛选及发酵产多元醇分析
白酒酿造过程中耐高糖酵母的筛选及发酵产多元醇分析发布时间：2021-06-16T01:40:59.523Z 来源：《当代教育家》2021年7期作者：谢俊[导读] 为了解白酒甜味物质来源，从衡水老白干生产大曲和发酵酒醅中筛选的30株酵母为出发菌株，由耐高糖实验筛选出12株酵母，通过高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）定性、定量分析酵母发酵液多元醇。
仁怀市中等职业学校摘要：为了解白酒甜味物质来源，从衡水老白干生产大曲和发酵酒醅中筛选的30株酵母为出发菌株，由耐高糖实验筛选出12株酵母，通过高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）定性、定量分析酵母发酵液多元醇。
结果显示，12株酿造酵母均具有产多元醇能力，发酵液测得酵母所产多元醇分别为核糖醇、赤藓糖醇、甘油、甘露醇、D-阿拉伯糖醇，12株酵母都产甘油，且其中11株酵母均产三种多元醇，菌株Y2产多元醇的总量最多，为16.97 g/L，除甘油外，以D-阿拉伯糖醇最为常见且产量最高。
关键词：耐高糖酵母；筛选；高效液相色谱-蒸发光散射检测法；老白干香型白酒以衡水老白干为代表，具有醇香清雅、酒体协调、醇厚甘冽、回味悠长的风格特点。
白酒的风格特点取决于特征风味物质的种类和含量，其中呈甜味物质的存在可以使得酒体更加的丰满醇厚、绵甜自然。
研究表明，多元醇是白酒醇甜味的重要来源之一，大多数多元醇都沸点高且不易挥发，白酒作为世界六大蒸馏酒之一，拥有独特的甑桶蒸馏技术，它的独特之处即通过蒸汽将酒醅中的风味物质先富集再随蒸汽带入酒体中，难挥发的多元醇进入酒体中为白酒增加甜味和醇厚感，同时也对白酒起助香的作用。
白酒中的多元醇种类繁多，主要包括甘油、阿拉伯糖醇、核糖醇、赤藓糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、半乳糖醇、麦芽糖醇等，且甜度随羟基数增多而增强。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 菌株 30株酵母菌（大曲中8株，发酵酒醅中22株）：衡水老白干技术中心从生产用大曲和发酵酒醅中筛选并保藏。
高效酒精酵母菌的选育及鉴定
高效酒精酵母菌的选育及鉴定李忠英;陈杰山;罗跃中;吴永尧【摘要】从各种腐败水果、葡萄园里土壤等不同基质中筛选分离得到144株酵母菌，采用耐热、耐酒精处理方法，结合TTC法初筛和复筛试验得到一株酒精发酵的高产酵母菌株，编号为TJ-18。
研究结果表明，该菌糖利用率较高，且发酵力突出，40℃培养72 h，CO2失重为10.4 g，酒精产率最高可达5.9%（体积分数）。
对其形态及特征做了常规鉴定实验，根据生理生化试验结果，并对照《TheYeast》对酵母的描述，确定TJ-18为酵母属的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
%From all kinds of corruption fruit, in the vineyard to soiland so on the different matrix screening separation have 144 strains of yeast, use heat resistant, resistant to alcohol processing methods, combined with TTC method initial screen and complex screen test got a strain of alcoholic fermentation yield yeast strain. Numbers for TJ-18. The results show that the bacteria sugar utilization rate is higher, And fermenting power is outstanding, 40℃culture 72 h, CO2 weightlessness is 10.4 g, alcohol yield the highest can amount to 5.9%(v/v). The form and characteristics of the conventional do identification experiment, according to the physiological and biochemical test results, and control the TheYeast"on the description of the yeast, determine the TJ-18 for Saccharomyces wine yeast (Saccharomyces cerevisiae).【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2014(000)007【总页数】4页(P104-107)【关键词】耐高温酵母;筛选;鉴定;酒精发酵【作者】李忠英;陈杰山;罗跃中;吴永尧【作者单位】湖南化工职业技术学院，湖南株洲412004;湖南化工职业技术学院，湖南株洲 412004;湖南化工职业技术学院，湖南株洲 412004;湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128【正文语种】中文随着全球石油能源的日趋枯竭及环境污染的加剧，开发新的绿色能源势在必行。
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酿酒酵母高效自主复制区的筛选与鉴定沈方琳;黄双成;侯朋晨;耿安丽;阮文权【摘要】在酵母表达过程中,传统的表达载体存在着拷贝数低以及稳定性差的缺点.因此,找到一个可用于构建复制整合型载体的高效酵母自动复制区(Autonomously Replicating Sequence,ARS)是解决问题的关键.研究中,从酿酒酵母基因组中扩增得到4种不同的ARS(ARS304、ARS315、ARS735、ARS1512),然后连接到整合载体pNTS2K中,得到4种复制整合型载体(pNTS2K-ARS304、pNTS2K-ARS315、pNTS2K-ARS735、pNTS2 K-ARS1512).经电转化后,4种转化子(36a(pNTS2 K-ARS304)、36a(pNTS2K-ARS315)、36a(pNTS2K-ARS735)、36a(pNTS2K-ARS1512))都能在含有300 μg/mL G418的YPD平板上生长.然而,只有转化子36a(pNTS2K-ARS315)能在含有500 μg/mL G418的YPD液体培养基里较快生长.经过G418耐受性检测后,36a(pNTS2K-ARS315)仍能在含有1 mg/mL G418的YPD培养基中很好地生长.此外,通过质粒pNTS2 K-A RS315表达荧光蛋白,其表达效果高于普通商业质粒.实验结果证明,4种复制区都能在酿酒酵母中独立自主复制,其中ARS315复制能力最强.因此,ARS315可用于构建高拷贝且稳定的重组质粒,为构建高表达且稳定的工程酵母菌株奠定了基础.%In the case of yeast expression,low-copy number of transformed genes and low stability are disadvantages of the conventional types of expressionvectors.Therefore,finding a high effective Saccharomyces cerevisiae autonomously replicative sequence (ARS) that can be used for construction of replicative/integrated plasmid is significantly important.In this study,four different ARSs (ARS304,ARS315,ARS735,and ARS1512) were amplified from Saccharomyces cerevisiae and inserted into integratedyeast vector pNTS2K and four plasmids pNTS2K-ARS304,pNTS2K-ARS315,pNTS2K-ARS735,pNTS2K-ARS1512 were obtained.All the four plasmids were successfully transformed into S.cerevisiae and all transformants were able to grow on YPD plate containing 300 μg/mL ofG418.However,only transformant containing plasmid pNTS2K-ARS315 was able to grow well in the YPD medium containing 500 μg/mL of G418.After G418 tolerance detection,36a (pNTS2K-ARS315) still could grow well in YPD medium containing 1 mg/mL of G418.Furthermore,the expression of the fluorescent protein by the plasmid pNTS2K-ARS 315 was higher than that by the ordinary commercial plasmid.It can be concluded that all of the four ARSs functioned and the ARS315 had the highest replicate ability in S.cerevisiae.Consequently,ARS315 can be potentially used for high expression and stable recombinant strain construction and metabolic engineering of S.cerevisiae.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2017(043)003【总页数】6页(P20-25)【关键词】酿酒酵母;自动复制区;高拷贝复制整合型质粒;荧光蛋白【作者】沈方琳;黄双成;侯朋晨;耿安丽;阮文权【作者单位】江南大学环境与土木工程学院,江苏无锡,214122;江苏省厌氧生物技术重点实验室,江苏无锡,214122;义安理工学院,生命科学与化学技术实验室,新加坡;义安理工学院,生命科学与化学技术实验室,新加坡;义安理工学院,生命科学与化学技术实验室,新加坡;江南大学环境与土木工程学院,江苏无锡,214122;江苏省厌氧生物技术重点实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文在酵母表达蛋白以及其他有机产物的过程中，通过增强转化过程中的酶活性来加快产物生成是研究者公认的观点，而高表达特异性酶是解决问题的主要途径。
寻找1个新颖匹配的启动子或构建1个高效表达系统是非常困难且需要大量的时间。
向宿主细胞中引入大量目的基因是最先广泛采用的方法。
在酵母表达过程中，传统的表达载体YEP，YCP和YIP常常被用来引入外源基因。
但是，YCP和YIP存在低拷贝的缺点，而YEP表达不稳定[1]。
高拷贝数地将目的基因整合入酵母基因组是高表达且稳定的必要途径。
酵母自动复制区作为酵母染色体复制起点，在染色体复制过程中起着至关重要的作用[2-3]。
如果这些位点发生突变会导致ARS失去活性，进而影响到复制起始的功能[4]。
其活性还可能与其他诸如ARS侧翼序列特征，染色体定位，染色体修饰等因素有关。
每条染色体复制都是在间隔40～100 kb的多个位点起始的，每个起点在1个细胞周期的中期S期相继被激活，起始1次染色体复制[5-7]。
在酵母基因组中，存在着300多个自动复制区，而找到高效的自动复制区是构建高拷贝质粒的前提。
本实验在酿酒酵母整合载体pNTS2K中的Nde I和EcoR I之间(见图1)分别引入4种ARS，筛选出高效的复制区ARS315，从而构建了一种高效的复制整合型载体pNTS2K-ARS315。
通过质粒pNTS2K-ARS315表达荧光蛋白，其表达效果高于普通商业质粒。
因此，这种质粒可以在G418抗性基因KanMX两侧，2个rDNA片段之间(见图1)引入多个表达框。
随着G418抗性的选择压力，尽可能多的将外源基因表达框整合在酵母基因组多拷贝rDNA区域，为以后外源基因的高效稳定表达奠定了基础。
1.1 材料1.1.1 质粒与菌种酿酒酵母整合载体pNTS2K由本实验室构建，以pUC19为骨架，引入rDNA 整合区片段及KanMX表达框，如图1所示。
大肠杆菌(E. coli)DH5α，酿酒酵母(S. cerevisiae)Juk36a (URA3缺陷型)由本实验室保存。
1.1.2 酶和试剂酵母基因组提取试剂盒、DNA聚合酶以及Phusion高保真酶购买于Thermo Scientific 公司；限制性内切酶和T4连接酶购买于NEB公司；LB培养基、YPD培养基、氨苄青霉素(Amp)以及G418购买于Sigma公司，引物也由Sigma 公司合成。
1.2 方法1.2.1 质粒的构建用酵母基因组提取试剂盒提取Juk36a基因组DNA。
由于ARS活性可能与诸如ARS侧翼序列特征、染色体定位和染色体修饰等因素有关[8]，所以根据NCBI上S288c基因组序列，针对各ARS序列上下游200 bp处设计4对特异性引物(见表1)分别扩增ARS304、ARS315、ARS735和ARS1512片段，并在上下游引物5’末端引入Nde I和EcoR I酶切位点。
PCR扩增条件为98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s, 72 ℃ 1 min, 循环30次；72 ℃ 2 mins；4 ℃保存。
用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，用胶回收试剂盒回收特异性条带。
用限制性内切酶Nde I和EcoR I双酶切胶回收产物和pNTS2K质粒。
纯化酶切反应液后，用T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞。
经菌落PCR鉴定后，挑取阳性转化子37 ℃过夜培养。
然后提取质粒，并用Nde I和EcoR I酶切鉴定。
1.2.2 酵母转化将所得到的正确质粒pNTS2K-ARS304、pNTS2K-ARS315、pNTS2K-ARS 735和 pNTS2K-ARS1512(如表2所示)用Nanodrop检测浓度后，分别稀释到100ng/μL。
按照Gene Pulser XcellTM Electroporation System 标准方法，分别将5 μL质粒加入到40 μL酵母感受态细胞中进行电转[9]，然后分别涂布于含有300 μg/mL G418的YPD平板上，培养3天后挑取转化子。
转化率=转化子数/质粒DNA质量。
1.2.3 转化子的复筛及比较最终OD600 nm的测量是衡量细菌产量的标准，也是细菌生长率的体现，是外源基因高表达的必要前提[10]。
因此，从生长出的不同转化子中(如表3所示)分别挑出5个最大的单克隆于2 mL YPD培养基中培养过夜，以OD600nm 为0.05转接到5 mL含有500 μg/mL G418的YPD培养基中培养48 h，测OD600nm吸光值。
1.2.4 复制能力的比较及检测将生长能力最强的Juk36a(pNTS2K-ARS315)菌株分别接种于含有不同梯度的G418的YPD培养基的24孔培养板中，每孔培养体积为0.6 mL，放入Infinite F200PRO (TECAN)中监测40 h得到生长曲线。
1.2.5 质粒的应用及检测将得到的复制能力最强的质粒pNTS2K-ARS315为骨架，以本实验室普通商业酵母表达载体pPY1(以2micron 为复制区，由本实验室保存)作为对照，分别引入荧光蛋白表达框。