大鼠灌注固定取脑

大鼠灌注固定取脑科研实验
具体方法：

1. 配好4％多聚甲醛PBS缓冲液，配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH直至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。
3.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的生理盐水，一瓶底部开口，倒出盐水，倒置灌入多聚甲醛，悬挂，输液器链接，远端结一个三通后到一个输液器粗针头端
2. 经心脏行灌注固定：麻醉，剪开胸廓，见到搏动的心脏，心尖插入灌注针头，止血钳固定，剪开右心耳，开放静脉血，首先快速滴入生理盐水100－200ml，再注入4%多聚甲醛300-350ml固定液
3.取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳瓣断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。
4. 最后在同样固定液中4℃固定4-6小时。

有几点体会 ：

1 4％多聚甲醛的配制：加热至60～65℃固然融解的快，不过容易挥发，气味难闻，不是好的选者。我们是这样做的，感觉不错，在此强烈推荐：先配好pbs，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。
2 灌注时直接把4％多聚甲醛倒入一般玻璃输液瓶中灌注即可，省事方便。
3 灌注时夹上腹主动脉只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。
4 灌注时注意排空输液管中的气泡不然容易气栓，影响灌注效果。一定要看到大鼠较剧烈抽搐，不然证明灌注不好。
个人体会：

1、处死大鼠后迅速取脑放置于4%多聚甲醛中固定也可以，但取脑组织时未经固定的脑组织非常软，即使是刚刚处死的大鼠，也难免会造成微小的人为损伤，可能会影响切片后的观察。而且未经灌注的脑组织血管内会残余大量红细胞，观察血管形态会不太理想。

2、多聚甲醛加热溶解很快，只需要15分钟左右，需配置的量比较大的时候是较合适的方法。如果有通风厨的可在通风厨内配置，就基本没有气味散发的问题。在通风较好的地方配置也可以，但配置的时候配溶液的人一定要注意自我防护，味道确实很刺激！

步骤:1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.
注意事项:1)开胸时不要伤到心脏 2)心脏穿刺最好用留置针,软,不宜穿通室间隔,见血即退针芯.插针部位是心尖部,方向向中线.3)生理盐水冲血管,到右心耳流出无色液体.

4)多基甲醛固定成功的表现是SD鼠四肢抽搐.5)先断头再一步一步取脑6)根据你实验设计,需要切片的部位,有重点的取,常见的体表标志是前囟和外耳道.7)去颅骨后脑表面有一层硬脑膜,要去掉.



大鼠新生鼠灌注取脑及后固定规则
2009-01-25 04:13


目的： 完整取出鼠脑及后期固定

操作步骤

流程：1)麻醉 2)开胸 3)心脏解剖 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.

1 多聚甲醛的配置：

一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有800ml PBS的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮状（滴加），过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

2 实验准备：准备两个10ml注射器，剪刀，弯镊、PBS 10ml/只、4%PFA 10ml/只。

3 麻醉后开胸：因老鼠较小，可冰冻麻醉，或者用致死量麻醉。沿肋弓下向左右剪开，至双侧腋中线向上剪开，然后向上翻起胸壁，充分暴露心脏。

4 心脏穿刺：在右心耳处用针扎出一个小孔，用装有PBS针筒在左心室进行穿刺。

5 灌流：缓慢灌注PBS 10ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛，多聚甲醛的灌流也同PBS。

6 灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后老鼠后肢绷直，尾部竖起成一直线；所灌注的脑组织白而硬。

7 取脑：分离除去后颈部肌肉 ，用弯镊小心取出脑组织。

8 后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。

优点：可用单人用注射器直接完成，不用输液管架，而且平均每只仅需5～10ml固定液，时间也仅为5～10min。