琼脂糖凝胶CL-2B使用说明

货号：S8731

规格：10ml/100ml

一、简介

琼脂糖凝胶CL-2B是在琼脂糖凝胶2B的基础上通过交联使微球的刚性增强，理化性能提高，有利用于工业生产。该介质用于生物大分子的凝胶层析。

本品呈白色球状凝胶，无嗅、无味、无肉眼可见杂质。

二、亲和填料特性

项目指标

基质2%交联琼脂糖

排阻极限70000~40×106(球蛋白)

形状球形

粒径60~200μm

最高流速100cm/h*

耐热pH7水中120℃20min

耐压0.025MPa

pH稳定性3~13(长时间)，2~14(短时间，在位清洗)

化学稳定性可耐8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍；可耐有机溶剂，如乙醇、DMF、THF、DMS、CH

Cl、丙酮、二甲基甲酰胺、二氯乙烷、吡啶、乙腈

*检测条件：层析柱10mm×300mm*柱床高15cm，25℃，流动相为0.1mol/LNaCl。

三、适用范围

本产品具有很高的化学稳定性、高流速、较好的机械性能、可多次重复使用等特点，非特异

性吸附低，回收率高，可用有机溶剂及1~2mol/L的NaOH在位清洗，适用于工业规模生产，广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的凝胶色谱纯化。

四、注意事项

产品应密封贮存在4℃~25℃（保存溶液为20%乙醇），通风、干燥、清洁的地方。不能冷冻。用过的柱子贮存在4℃（20%乙醇）。

本产品避免与氧化剂接触；避免长时间暴露在空气中。

保质期：5年。

五、操作步骤：

1、装柱

凝胶过滤介质的使用对装柱的要求较高，为了保证分离效果，一般通过柱子上加一个装柱器来使分离柱装满凝胶，或采用带有轴向加压装置的柱子。凝胶柱床一般高于60cm。装柱效果可用染料或丙酮-水溶液进行检验。

以下过程为通用介质装填过程。若为带有轴向加压装置的柱子，可在柱床稳定后将柱床压紧，接好管路。

（1）让所有的材料和试剂达到室温。配制缓冲液。凝胶层析上样、平衡和洗脱只用一种低盐浓度的缓冲液。

（2）选择一根一定直径的柱子，长约30~60cm,根据柱子大小取所需量的凝胶（约为柱床体积的1.15倍），清洗掉20%乙醇，抽干，用缓冲液（按凝胶：缓冲液=3：1的比例）配成匀浆。

（3）将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。

（4）用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。

（5）打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定。用缓冲液平

衡柱子，到柱床稳定。

（6）最好用一个装柱器辅助装柱。装完后柱床上端轻轻刮平，上好柱头。

2、平衡

让缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变。

3、上样

（1）样品用缓冲液配制，浑浊的样品要离心和过滤后上样。含盐量过大、浓度过小的样品要先做处理，再上样。

（2）介质对样品组分的分离是按组分分子量大小进行的，分子量大的先流出来。

（3）上样体积约为柱体积的1~2%，越小分离越好。

4、洗脱

用缓冲液洗脱，洗脱中保持流速、缓冲液组成不变。

5、再生

一般用缓冲液洗到平衡，可再次使用。

6、在位清洗

（1）对于以离子键结合上去的蛋白，可以用2M Nacl去除。

（2）对沉淀蛋白、对以疏水性结合的蛋白或脂类，可用1M NaOH去除。

（3）对强疏水性结合的蛋白、脂类等，用4~10倍柱体积的70%乙醇或30%异丙醇清洗，但要注意有机溶剂的浓度以梯度的方式逐渐增加，否则容易产生气泡。

清洗完毕后，用至少3倍缓冲液平衡柱子。

7、注意

在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干，气泡进入。

8、去热源

用0.5M的氢氧化钠清洗柱子5~6小时或用0.1M的氢氧化钠24小时。或用以下方法步骤去

除：

（1）2倍柱体积的70%乙醇；

（2）2倍柱体积50mM Tris-HCl pH7.5；

（3）1倍柱体积4M尿素；

（4）3倍柱体积的Tris缓冲液+0.1M Nacl；

以上缓冲液都在无热源的双蒸水中配制。

9、消毒

用0.5~1M NaOH室温下洗8~10倍柱体积，初始缓冲液平衡柱子。

琼脂糖凝胶的制备上课讲义

琼脂糖凝胶的制备

琼脂糖凝胶的制备一、琼脂糖凝胶的特点天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80％）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。 1. 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。 2. 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 3. 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。 4. 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug蛋白质就可检出。琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。二、DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 ① DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 ②琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。表琼脂糖浓度与DNA分离范围

琼脂糖凝胶的制备(知识资料)

琼脂糖凝胶的制备一、琼脂糖凝胶的特点天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80％）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。 1. 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。 2. 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 3. 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。 4. 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug 蛋白质就可检出。琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。二、DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 ① DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 ②琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。表琼脂糖浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 /％

琼脂糖凝胶电泳目的及后续工作

琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 1.分离纯化大片段DNA 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。分离后如需回收：将需要的DNA胶部分切下，尽量不要切到多余的胶。切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚或氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。 2.提取大分子DNA构建大片段基因组文库的关键就是获得高分子量的基因组DNA。而利用成熟的商品化试剂盒提取基因组DNA只能得到大小约在20kb左右的DNA;酶抽提法需经过多次抽提法才能得到较纯的DNA，但极易造成基因组断裂，也难以得到大于300kb的基因组DNA。两种方法均不能达到目的，但经过研究人员不懈的研究，利用琼脂糖凝胶制备成凝胶块提取基因组DNA能够获得足够大的DNA片段，可以完全符合构建粘粒基因组文库的要求。在此过程中研究人员在用低熔点琼脂糖还是普通熔点琼脂糖制备凝胶块的问题中选择了后者，因为低熔点琼脂糖价格昂贵且胶块在制备纯化的过程中容易断裂，而普通熔点琼脂糖与低熔点琼脂糖在基因组DNA制备方面没有区别。 3.PCR产物检测在基因组DNA的提取中，DNA经孵育及抽提、沉淀后以70%乙醇洗涤2次，再适量的双蒸水溶解DNA。然后在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，以1kb DNA ladder 为参照，估计DNA溶液浓度。具体检验方法是:2.0%琼脂糖制成凝胶，取6 微升AFLP-PCR产物与1微升上样缓冲液混匀后上样，用1×TBE电泳缓冲液，120V电泳50min，使用EB溶液染色后在凝胶成像系统(ChampGel-3200)上观察拍照。 4.免疫扩散法中的应用免疫扩散法是指抗原与抗体在同一凝胶中扩散的方法，是观察可溶性抗原与相应抗体反应和抗原抗体鉴定的最基本方法之一。利用琼脂糖凝胶作为扩

琼脂糖凝胶的配制和DNA回收

配1%的琼脂糖凝胶称量琼脂糖0.3g，倒入锥形瓶中，再用量筒量取30ml TAE，混到一起，放入微波炉中煮沸两次，直到看不到颗粒为止（每次大约三分钟），取出后冷却至60℃左右后加入Gold view（万分之一），同时将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。吸取少量琼脂糖溶液封固胶膜边缘，任其凝固，在距离底板0.5～1.0mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔，将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。凝胶的厚度在3～5mm之间，检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。冷却好后拔梳子（30min左右），将板放入电泳槽里，倒入TAE溶液（1X），在冰箱中拿Loading buffer和两个maker（1kb和 D100），将Loading buffer吸到PE手套上（吸取量随意用枪点一下即可）和样品混匀，向凝胶中加样，两侧的孔里加Maker，通电120V跑胶，红为正，黑为负（DNA带负电，所以往红色正极处跑），放到紫外盒上看结果，同时将亮带部分切下来放入1.5ml的已经称完重量的EP管中（若忘了称重量，按照0.9计算），再次称重计算胶的重量，接下来按照DNA回收试剂盒操作步骤回收DNA，测浓度。普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作步骤使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 1. 柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl平衡液BL，12,000 rpm(~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） 2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。 3. 向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 μl，则加入100 μlPN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。注意：对于回收<300 bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。 4. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：吸附柱容积为800 μl，若样品体积大于800 μl可分批加入。 5. 向吸附柱CA2中加入600 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙

琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测

实验二琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测一. 实验目的 1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理; 2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。二、实验原理溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。 1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： 1)DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA） 2) 琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA Agarose：0.5%：1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%：0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb. 3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环 4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm

5)碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃ 6)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中) 7)电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。 2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 4、电泳缓冲液：TAE TBE TAE 与 TBE不同之处在于TBE用硼酸代替了TAE中的冰醋酸。三、仪器和试剂仪器微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉试剂琼脂糖：1.0%；电泳缓冲液（50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g ，冰醋酸5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至100ml ） EB：5 μl / 100 ml TBE 电泳材料：标准分子量核酸（DL2000）四、操作步骤（1）制胶（以20 mL为例） a. 称取0.2 g 琼脂糖，加入20 ml 的TAE缓冲液（pH 8.0），摇匀；

Q-琼脂糖凝胶说明书

Q-琼脂糖凝胶 FF 产品说明书 Q-琼脂糖凝胶 FF 是将三甲胺基烷基季铵基团键合在高流速琼脂糖微球上形成的一种强阴离子交换介质。广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的离子交换制备。 1. 外观本品呈白色，球状、无嗅、无味。 2. 理化指标项目指标离子交换基团 -CH 2N +(CH 3)3 离子交换类型强阴离子，可交换离子Cl -基质 6% 交联琼脂糖** 蛋白质吸附容量 120mgHSA/ml 介质总离子交换量 0.18-0.25mmol/ml 介质形状球形粒径 45~165μm 流速 400~700 cm/h* 最大流速750 cm/h 工作温度 4~40 ℃ 耐热 pH7水中120℃30min 耐压 0.3MPa pH 值稳定性 1~14 (短时间，在位清洗)；2~12(长时间) pH 工作范围 2~12 化学稳定性在以下液体中稳定：所有常用的水相缓冲液；1mol/L 氢氧化钠；8mol/L 尿素；6mol/L 盐酸胍；70% 乙醇 *检测条件：层析柱10mm×300mm *柱床高15cm,25℃, 流动相为0.1mol/LNaCl 3. pH 滴定曲线： 4．包装产品以聚胺酯瓶密封包装，外贴标签，注明“品名、体积、颗粒大小” 等内容。

5．运输运输中应避免日晒、雨淋、重压，严禁与有毒、有害物品混运。 6．贮存产品应密封贮存在4℃~25℃（保存溶液为20% 乙醇），通风、干燥、清洁的地方。不能冷冻。用过的柱子贮存在4℃（20% 乙醇）。 7.注意事项本产品避免与氧化剂接触；避免在pH值< 4时长时间暴露(一周,20℃)。 8.保质期：暂定5年。 9.应用本产品具有高化学稳定性、高流速、高载量、好的机械性能、可在位清洗、多次重复使用等特点，非特异性吸附低，回收率高，适用于工业规模生产，适用于在pH工作范围内可形成负离子的生物大分子的分离纯化，广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的离子交换制备。下面简要介绍介质的使用过程。 9.1 装柱 ⑴让所有的材料和试剂达到室温。配制初始缓冲液（平衡液）和洗脱缓冲液。 ⑵根据柱子大小取所需量的凝胶，清洗掉20%乙醇，抽干，用初始缓冲液（按凝胶：缓冲液=3：1的比例）配成匀浆。匀浆作脱气处理。 ⑶将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。 ⑷用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。 ⑸打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定。用2~3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。 9.2平衡让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变。平衡液是低浓度的缓冲溶液，如Tris 、PBS等。 9.3上样 ⑴样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心和过滤后上样。盐浓度太大的样品处理后再配。 ⑵一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产

琼脂糖凝胶电泳配方与步骤

?RNA琼脂糖凝胶电泳：配制： 1.0.5M EDTA（pH=8.0）： 100ml：称取18.61g Na2EDTA·2H2O（分子量372.24），加80ml ddH2O剧烈搅拌，用NaOH调节PH值至8.0（约需2g NaOH）.高压灭菌，室温保存。 2.50×TAE loading buffer:（Tris acetate-EDTA buffer）电泳缓冲液组分：2M Tris-乙酸；100mM EDTA（pH=8.0） 500mL:称121.1g Trisbase（分子量121.14），加800ml ddH2O溶解，加57.1ml 乙酸和50ml0.5M EDTA溶液（pH=8.0），搅拌，ddH2O定容至500mL.室温保存。 3.1×TAE loading buffer: 取20ml50×TAE，ddH2O定容至1L.室温保存。 4.100×Sybergreen： 500ul：取495ul1×TAE于1.5ml离心管，加入5ul Sybergreen原液混匀，4℃锡纸避光保存。注意：Sybergreen原液需稀释10000倍； 6×DNA loading buffer上样缓冲液需稀释六倍，最终稀释倍数应不小于1×。步骤： 1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml，我们用30ml): 称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中，加入30ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次，至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。 2.胶板制备: 取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并放好梳子. 将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3.加样: 样品制备：（10ul体系/样品槽）于0.25ml离心管中样品RNA（最后加）:2ul/3ul/5ul 6×DNA loading buffer:10/6=1.7ul 100×Sybergreen：0.1ul DEPC水：至10ul (注意:加样前要先记下加样的顺序).分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个枪头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面. 4.电泳: 加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. 5.电泳完毕后,取出凝胶,利用科212凝胶成像系统,在紫外灯（trans UV）下观察拍照保存.DNA存在则显示出红色荧光条带.RNA完美提出应该是三条带：28，18,5.8。 28和18比较亮,而且28是18亮度的2倍,5.8基本很模糊，可有可无

琼脂糖凝胶电泳

DNA琼脂糖凝胶电泳跑胶即走电泳，是DNA 和protein 最基本的定性定量方法。一般是琼脂糖胶或page 胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA 用丙烯酰胺凝胶。一、基本原理当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。该公式指球形颗粒所受的阻力。代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*t d为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。二、琼脂糖凝胶电泳通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定是采用琼脂糖凝胶(做支持物)电泳法进行的。用琼脂糖分离线性DNA时，其迁移率与该物质分子质量的关系密切，而与结构和碱基组成无关。这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。此方法除了可以分离线性DNA外，还可以分离、分析细菌质粒的闭环DNA和开环DNA，以及分子质量不等的RNA片段。一般实验室采用的琼脂糖凝胶的浓度为0.3%——2%。不同的凝胶浓度，可以分离不同长度的DNA片段。具体见表格：琼脂糖凝胶 /% m/V 分离线性DNA片段的范围 /kb 0.3 50---60 0.6 1----20 0.7 0.8---10 0.9 0.5---7.0 1.2 0.4----6.0 1.5 0.3---3.0

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下： 1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内, 每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存实验原理闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。实验材料和试剂（一）实验样品质粒pUC118 （二）试剂 1．l DNA/HindIII分子量标准 2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 3．1mg/ml溴化乙锭溶液 4．电泳缓冲液（TAE） 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml） 5．0.7% 琼脂糖凝胶

琼脂糖凝胶电泳实验

琼脂糖凝胶电泳实验 2011-11-03 09:43:56 来源：生物秀评论：0 我要评论实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】(1)学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；(2)掌握使用水平式电泳仪的方法；(3)学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的… 实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】 (1)学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理； (2)掌握使用水平式电泳仪的方法； (3)学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中(pH约8.5),核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定： (1)DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。 (2) DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。 (3)电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4)离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中(如误加10 X 电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。溴化乙啶(Ethidium bromide, EB) (1) 能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳

凝胶电泳缓冲液的配制

2．测序凝胶加样缓冲液 98%去离子甲酰胺 10mol/L EDTA(pH8.0) 0.025%二甲苯青FF 0.025%溴酚蓝甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。 3．常用的电泳缓冲液

说明： ①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。以片都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。 ②碱性电泳缓冲液应现用现配。 ③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4．2×SDS凝胶加样缓冲液 100mmol/L Tris·HCl(6.8) 200mmol/L二硫苏糖醇（DTT） 4%SDS（电泳级） 0.2%溴酚蓝 20%甘油不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L 贮存液现加于上述缓冲液中。 5．凝胶加样缓冲液

使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2. 2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。

琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化

实验三琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化一、实验目的 1、掌握琼脂糖凝胶制备方法 2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA方法 3、掌握PCR产物回收和纯化方法二、实验原理根据DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。电泳过程中或电泳完毕，直接利用低浓度的荧光染料EB（溴化乙锭）进行染色，EB可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出荧光，既可以确定DNA条带在凝胶中的位置，而且灵敏度很高，少至1～10 ng的DNA 条带即可直接在紫外灯下检出。不同浓度琼脂糖凝胶分离的范围琼盒回收纯化PCR产物。试剂盒中有一个特制的Column，将硅胶填充到这个特制的管中，利用硅胶在高盐低pH 下，吸附DNA，在低盐和高pH条件下DNA可再被洗脱的原理，进行DNA的回收和纯化。此外还有玻璃奶（Glassmilk法），冻融法等方法回收纯化DNA。三、主要实验仪器和试剂主要仪器：电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。主要实验试剂: 1、50×TAE （2 M Tris，1M 醋酸，50 mM EDTA（pH8.0）） 2、10×上样缓冲液（loading buffer） 3、分子量标准DNA Marker 4、琼脂糖

5、EB （溴化乙锭）（黑暗保存） 6、DNA回收纯化试剂盒（AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒）四、实验步骤琼脂糖凝胶的制备： 1、将洗净的电泳槽洗净，置于平整的台面上，并调节水平； 2、用1×TAE 电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖，微波炉加热使其溶解； 3、待琼脂糖溶液冷却至60°C左右时，加入EB（浓度约0.025 ug/mL）, 搅拌均匀。缓缓将琼脂糖倒入胶模中，厚度约5至7mm； 4、插入梳子，静待琼脂糖凝固； 5、将胶模放进电泳槽中，向电泳槽倒入1×TAE电泳缓冲液，没过胶约 5mm； 6、小心拔掉梳子，用20 ul移液器吸取DNA溶液（20 ul DNA 加2～3ul 10 ×loading buffer），缓缓加入点样孔；并在最右边的点样孔加 4 ul DNA Maker； 7、接通电源，（注意电源的正负极！）电泳20～30分钟； 8、电泳完毕，关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶，置于紫外灯下观察。PCR产物切胶回收： 1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量。（100mg 凝胶，计100ul体积）（尽量缩短暴露UV灯下的时间！） 2、加入3个凝胶体积的Buffer DE-A（600 ul），混合均匀后，于65°C 加热，直至凝胶完全熔化。 3、加0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B（300 ul）,混合均匀，当分离的DNA片段小于400 bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。 4、吸取3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml 离心管中），12， 000×g 离心1 min。弃滤液。 5、将制备管置回2 ml离心管中，加500 ul Buffer W1，12，000×g 离心30 sec，弃滤液。 6、将制备管置回2 ml离心管中，加700 ul Buffer W2, 12，000×g 离心 30 sec，弃滤液。重复一次。 7、将制备管置回2 ml离心管中，12，000×g 离心1 min。彻底去除残余的液体。 8、将制备管置于1.5 ml离心管中，在制备膜中央，加25～30 ul 65°C Eluent 或去离子水，室温静置1 min。12，000×g 离心1 min洗脱DNA。思考题： 1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？ 2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？

RNA琼脂糖凝胶电泳实验原理、试剂配制方法及操作流程

本实验的主要目的是掌握RNA琼脂糖凝胶电泳的操作技术，总结了RNARNA琼脂糖凝胶电泳的原理、实验材料、试剂及器具、操作步骤及注意事项。一、实验目的学习RNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术。二、实验原理 RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，凡是无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。三、材料、试剂及器具 1、材料总RNA提取物。 2、试剂 (1)0.1%DEPC水：200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀，室温放置过夜，高压灭菌。 (2)10x电泳缓冲液。吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 0.4mol/L(pH 7.0) NaAc 0.1mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L (3)50mL变性琼脂糖凝胶(1%) (4)10x电泳缓冲液5 mL 琼脂糖0.5 g 0.1%DEPC水36.5 mL 加热溶解，稍冷却，加入8.5 mL 37%甲醛。 (5)上样缓冲液：50%甘油，1mmmol/LEDTA，0.4% 溴酚兰，0.4%二甲苯蓝。 (6)甲酰胺(去离子)。 3、器具 (1)电泳系统 (2)紫外透视仪

四、操作步骤 1、将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。 2、制胶：称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5mL的10x电泳缓冲液、8.5mL的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。 3、加样：在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：电泳缓冲液(10x)2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA 样品3.5μl。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。 4、电泳：打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳。 5、电泳结束后通过紫外透视仪观察。五、注意事项本实验中必务必要去除RNase污染，防止RNA降解。所有试剂和器具需要用DEPC水配制和处理，并灭菌。此外可通过18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带的亮度判定RNA的完整性。

琼脂糖凝胶的配制是分子实验室比较基本的操作

琼脂糖凝胶的配制是分子实验室比较基本的操作，因此正确地操作对整个实验来讲很有必要，大体流程如下：称量、熔胶、倒胶、拔梳。 1.称量我们通常所说的0.8%、1%的胶都是指的质量体积分数，即所称取的琼脂糖粉的质量（g）比所加的TBE缓冲液的体积（mL）即胶的浓度。缓冲液的体积根据胶板的大小而定。如小胶板0.8%的胶需要琼脂粉0.104g，TBE13mL。 2.熔胶将所称量的琼脂粉与TBE在锥形瓶中混合，在微波炉内反复加热2~3次至琼脂粉溶解并无气泡。 3.倒胶干净的胶槽内摆好梳子，往胶内滴加1uL左右核酸染料，混匀，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。 4.拔梳.待大约20min后，轻轻拔掉梳子（若不好拔，可以滴加适量的TBE缓冲液）。有不同的浓度：1%、1.2%、2%、3%等一般用1%浓度的凝胶用来分离几百到几千bp大小的DNA。称好琼脂糖后，放入TAE或TBE buffer中，用微波炉加热溶解，冷却至55 ℃时，加入少量EB或替代物，倒入模中，冷却凝固。内容 TE缓冲溶液buffer solution TE是有Tris和EDTA配置而成的，主要用于溶解DNA，能稳定储存DNA。 TE缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液。PH缓冲系统对维持生物的正常pH值，正常生理环境起重要作用。多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。在生物体中有三种主要的pH缓冲体系，它们是蛋白质、重碳酸盐缓冲体系和磷酸盐缓冲体系。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。在生化研究工作中，常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系pH值的变化往往直接影响到我们工作的成效。如果提取酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。所以我们要学会配制缓冲溶液。由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑止的作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris一缓冲液，在4℃时是8.4，在37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液拿到37℃测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下，缓冲能力差。

实验二琼脂糖凝胶电泳实验

实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；（3）学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。（3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB 能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。【试剂与器材】（一）材料电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等（二）试剂 1、：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸， 18.6g EDTA。 2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。 3、DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。 4、RNA甲醛变性胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，1mM EDTA(PH8.0)，50%甘油（w/v），用DEPC水配制，高压灭菌备用。 5、甲醛变性胶电泳缓冲液：0.1m MOPS(PH7.0)，40mM醋酸钠，5mM EDTA(PH8.0)，用DEPC水配制，过滤除菌，室温避光保存。淡黄色缓冲液可正常使用，深黄色应弃用。【操作方法】（一）常规的水平式琼脂糖电泳

缓冲液的配制方法

核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法 50×TAE Buffer (pH8.5) 组份浓度 2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 1.称量下列试剂，置于1 L烧杯中。 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加入57.1 ml的乙酸，充分搅拌。 4.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。 10×TBE Buffer (pH8.3) 组份浓度890 mM Tris-硼酸，20 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法l.称量下列试剂，置于l L烧杯中。 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。

10×MOPS(3-吗啉基丙磺酸)Buffer 组份浓度200 rnM MOPS，20 mM NaOAc，10 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 1.称41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。 2.加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解。 3.使用2 N NaOH调节pH值至7.0。 4.再向溶液中加入下列试剂。 5.用DEPC处理水将溶液定容至1 L。 6.用0.45 m滤膜过滤除去杂质。 7.室温避光保存。注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用。溴乙锭(10 mg/ml) 组份浓度10 mg/ml溴乙锭配制量100 ml 配制方法 1.称量1 g溴乙锭，加入到100 ml容器中。 2.加入去离子水100 ml，充分搅拌数h完全溶解溴乙锭。 3.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。 4.溴乙锭的工作浓度为0.5 g/ml。

1%琼脂糖胶的制备

1目的:检验DNA质粒大小或者降解情况。 2范围:适用于DNA质粒性状初步判断。 3责任:检验员对本规程的实施负责. 4内容: 4.1仪器装置:DYCP-31E琼脂糖水平电泳仪,微量移液器,水平电泳槽 4.2试剂:1.电泳缓冲液（TAE） 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml） 2.λDNA/HindIII分子量标准(marker,-20℃保存) 3．Goldview—核酸染料（配置marker 用得上） 4. 1%琼脂糖凝胶溶液（配制方法：称取琼脂糖1克，加入100ml TAE电泳缓冲液） 4.3制作过程: 1．将100ml的1%琼脂糖凝胶溶液，100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。 2．取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板. 取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入5μL Goldview，摇匀，轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。 3．琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子保持点样孔的完好。 4．取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过凝胶2mm. 4.4加样:在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于

1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4.5 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. 4.6拍照：观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存。 5结果判断根据marker的大小来初步判断条带的正误，根据条带初步判定质粒是否降解，或者是否单克隆，或者杂带。