水蛭粉中天然水蛭素的测定方法
水蛭及其炮制品中水蛭素的测定
水蛭及其炮制品中水蛭素的测定
戴作波
【期刊名称】《求医问药（学术版）》
【年(卷),期】2012(010)012
【摘要】目的:研究水蛭及其炮制品中水蛭素的测定方法.方法:通过水蛭的炮制、制备提取液、配制缓冲液、配制凝血酶滴定液及水蛭素含量的测定,对水蛭及其炮制品中水蛭素进行测定.结果:生水蛭中水蛭素含量最高,其次为滑石粉烫水蛭,含量最低的为砂烫水蛭.结论:生水蛭中有效成分水蛭素的含量最高,可能原因是砂烫和滑石粉烫后高温导致水蛭素这种蛋白质变性.
【总页数】2页(P343-344)
【作者】戴作波
【作者单位】江苏省宝应县中医医院江苏宝应225800
【正文语种】中文
【中图分类】R283
【相关文献】
1.凝血酶时间法测定家兔尿液及胆汁中r-水蛭素 [J], 阎宇辉;王一楠;韩国柱;任洪灿;周峰;罗轶;陈晓芳;姜伟
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水蛭素
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染色
考马斯亮蓝G250：20mg溶于10ml 95％ 乙醇，加入20ml磷酸，用双蒸水定容至 200ml，定容前用玻璃棒搅溶。（在恒温箱 中染色20分钟）
12
脱色
25％甲醇，7.5％乙酸，室温振摇下脱色， 总共配置200ml。
13
14
总结
1.在进行水蛭粉末获取时，是否直接将整个水蛭搅碎就能 使用了。 2.当抽干仪温度为52度会不会改变水蛭素的性质 3.在水液减压浓缩蒸压干燥得纯化样品A和B时，应用小离 心管或称量纸收集精品A和B 4.点样时加可溶性淀粉对水蛭素的水性溶是否有影响
2
3
精制
将粗品A和B分别溶于250和200ml蒸馏水中，各装入已捡漏的透析 袋(析袋MW值为6000)，扎紧上口，放置有蒸馏水的烧杯中，4度冰箱
放置，每隔8小时换水，连续透析48h，取出透析袋，水液减压浓缩蒸
压干燥得纯化样品A和B,A得量1.19克，收率7.9％，B得量0.21克，收 率1.4％。（按书上介绍;A的收率应为0.104％，B收率为0.0825％)
水蛭素
水蛭素抗凝血物质的提取
粗品提取： 粉碎水蛭样品15g，生理盐水225ml，4度冰箱放置24h，倾出上清 （上清液的PH为7.4)，同法提取3次，合并提取液，磷酸调PH至4.4， 冷贮12h，取上清（上清液的PH为4.6) ，加入无水乙醇使其含量为61 ％，（加入乙醇后溶液的PH为6.6）（无水乙醇本身的PH为8.4）用稀 盐酸调PH至6，放置过夜，倾出上清（该上清的PH为6.1），沉淀用61 ％的乙醇洗涤3次，抽干得粗品A，滤液合并于上清液，再加入乙醇使 其含量为85％，静置24h后同同前处理取沉淀物洗涤抽干（抽干时仪 器调的温度为52度）得到粗品B。 加入无水乙醇使其含量为61％,用稀盐酸调PH至6
水蛭素的提取及含量测定
水蛭素的提取及含量测定HEIL0NGJIANGMEDICINEANDPHARMACYAug.2010,V o1.33No.4?87?水蛭素的提取及含量测定田丽华,刘娟,刘利成(1.佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;z.佳木斯大学生药学研究生,黑龙江佳木斯154007)关键词:水蛭素;仿生诱导;凝血酶滴定中图分类号;R284文献标识码:A文章编号:1008—0104(201O)04—0087—01水蛭素是从水蛭中提取的一种酸性多肽,在临床上多用酶的分子表面有一个富含碱性氨基酸的纤维蛋白原识别位于治疗不稳定性心绞痛(USA),急性心肌梗死(AM),血管形点(FRS).而水蛭索的C 端含有较多的酸性氨基酸,可以结成术,血液透析,体外循环,肾移植(CRRT),弥漫性血管内凝合在FRS上,阻止凝血酶与其底物血纤维蛋白原的相互作血(DIC)等病症.用,从而达到抗凝血的目的.天然水蛭索的分离与纯化主要包括从活体水蛭素和干2.2.2凝血酶滴定过程水蛭中分离提取水蛭素.传统的水蛭素的获得是对水蛭的一次性掠夺,而本实验采用诱导方法对活体水蛭素的提取,避免了传统方法对水蛭的一次性掠夺,保护了水蛭的野生资源,又带动了水蛭养殖业的发展.国内曾报道了一种能利用水蛭反复吸血并用其嗉囊消化液为原料,既不杀死水蛭又能提取批量水蛭素的方法.水蛭素的含量测定方法有多种,如生物底色法,凝血酶滴定法,光散射法,酶联免疫法吸附测定法,同位素标记示踪法等.本实验采用凝血酶滴定法,1970年Markwardt报道了凝血酶滴定法,其原理是根据水蛭素与凝血酶结合比例为1:1(mol/mo1)和1:5(g/g).凝血酶的国际单位NIH,水蛭素的活性以抗凝血酶活力单位ATU表示,一个AUT等于中和一个NIH凝血酶的水蛭索量.1实验仪器,材料及试剂本实验所用水蛭购于山东省济宁市,经佳木斯大学药学院生药学教研室主任刘娟教授鉴定.BSZ一2型自动双重纯水蒸馏仪(上海之信仪器有限公司),5L微量进样器(上海安亭微量进样器厂),10/~L微量进样器(上海安亭微量进样器厂),酶示板.凝血酶(北京生物制品研究所);纤维蛋白原(上海市生物制品研究所);双重蒸馏水(自制);L一精氨酸(北京生物制品研究所);牛肠系膜(佳木斯肉联厂);氯化钠(分析纯);生理盐水(黑龙江省肇东市华富药业有限责任公司).2实验方法2.1诱导法本实验对活体的诱导有两种方法,一种用不同浓度的氯化钠溶液组成的诱导系统,对活体水蛭进行诱导,收集水蛭唾液腺分泌物,测定水蛭素含量,比较结果.另一种是用氯化钠和L一精氨酸组成的诱导系统,对活体水蛭进行诱导,测定水蛭素含量,比较结果.2.1.1不同浓度的氯化钠溶液诱导配制浓度为0.9%的氯化钠溶液(即生理盐水),分别稀释至浓度为0.45和0.225的氯化钠溶液(即1/2生理盐水和1/4生理盐水),装入3个小试剂瓶里,用牛肠系膜封口组成诱导系统,对活体水蛭进行诱导,观察水蛭的反应,收集其唾液,分别用凝血酶滴定法进行含量测定,选择最佳诱导条件.2.1.2氯化钠加L一精氨酸诱导配制150mm的氯化钠溶液,分别装于5个小试剂瓶中,分别加人lmmol,2mmol,4mmol,6mmol的L一精氨酸,用牛肠系膜封口组成诱导系统,对活体水蛭进行诱导,观察水蛭的反应,收集其唾液,分别用凝血酶滴定法进行含量测定,选择最佳诱导条件.2.2凝血酶滴定法2.2.1凝血酶滴定法原理本实验对水蛭索的含量采用凝血酶滴定法,其原理是:凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶,在止血时起中心作用,在凝血具体方法如下:配制不同梯度(2ONIH/mL,4ONIH/mL,8ONIH/mL,100NIH/mL)的凝血酶溶液,采用逐步缩小活性范围,多次换管重滴的浓度梯度法,对水蛭索含量进行测定, 在酶示板小孔中加200p.L0.5的纤维蛋白原(0.05mol/L) Tris—HCL缓冲液(pH7.4)再加入10—1OOL水蛭素溶液,充分混均.用微量注射器吸取标准的凝血酶溶液(2ONIH单位)5L(即0.1NIH单位),若在lmin内纤维蛋白原发生凝固,即说明已经达到滴定终点.若没有发生凝固,则换取4ONIH/mL单位的凝血酶溶液进行滴定,若仍没有凝固,则逐步扩大范围直至确定活性范围.3结果表1氯化钠溶液诱导结果表2氯化钠+L一精氨酸诱导结果(U一4O)4结论通过应用仿生诱导的方法对活体水蛭进行诱导后比较发现,当诱导溶媒为不同浓度氯化钠溶液时,其最佳的提取浓度为0.9,也就是生理盐水组的提取效果较好.当诱导溶媒为氯化钠+L一精氨酸时.发现150mLNaC1加4mL一精氨酸组的效果最好,能够得到最大剂量的水蛭素.综合两种诱导溶媒发现,诱导溶媒为氯化钠+L一精氨酸的效果较好.本实验对水蛭素含量测定采用改进后的凝血酶滴定法,即逐步缩小活性范围,多次换管重滴的浓度梯度法,对水蛭分泌的唾液进行含量测定时,具有节省时间,重复性和准确度都较好的优点.(收稿日期:201O—O4—07)黑龙江省研究生创新基金科研项目,项目编号:YJSCX2OO8—063HLJ 作者简介:田丽华(196O～)女,黑龙江佳木斯人,高级实验师.。
水蛭粉标准
水蛭粉标准
性状：本品体长稍扁，乍视之似圆柱形，体长约2～2.5厘米，宽约2～3毫米。
背面绿中带黑，有5条黄色纵线，腹面平坦，灰绿色，无杂色斑，整体环纹显著，体节由5环组成，每环宽度相似。
鉴别：本品粉末棕黄色。
体壁细胞纵断面观呈长条形，壁薄，近角质层处一边微向内卷曲，并附有细长的透明颗粒；另一边与角质层相连处平坦。
横断面观呈长梭形，表面有极细的凹凸纹。
检查：水分不得过百分之十八。
浸出物：照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法（通则2201）测定，用乙醇作溶剂，不得少于百分之二。
炮制：水蛭粉需要除去杂质，洗净、干燥后打粉。
水蛭粉的注意事项：
孕妇禁用。
切忌与寒凉食物同食。
忌烟酒、茶、辛辣等刺激性食物。
凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤
凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量实验仪器和试剂：电子天平 酸度计 离心机 移液器 45度试管架 三羟甲基氨基甲烷（Tris ） 盐酸（Hcl ） 生理盐水 蒸馏水 凝血酶 纤维蛋白原及常用玻璃仪器实验步骤：1、称取1.21g 三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml ，浓度为0.2mol/L 。
2、用移液器取429ul 盐酸加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml ，浓度为0.1ml/L 。
3、从1去25ml ，从2取40ml 混合调PH 到7.4（用1或2调），加蒸馏水定溶到100ml 。
4、称取样品1g 放入试管加生理盐水5ml 充分溶解30分钟。
5、把4放入离心机离心10分钟，4000转/分。
6、取3（Tris 缓冲液）1.6ml ，稀释纤维蛋白原0.008g ，浓度0.5%。
7、用生理盐水配制40u/ml 的凝血酶溶液。
8、从5取上清液100ul 。
9、从6取200ul 加入8充分摇匀后，吹一小气泡。
10、从7每分钟取5ul 加入9迅速摇匀后，匀速转动试管，观察反应，溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数）。
11、计算公式为：2211V C V C U其中C1=凝血酶的浓度C2=样品的浓度V1=滴加凝血酶的体积V2=取样的体积注：1、滴加次数超过5次还不凝固的，应按一定倍数稀释样品。
2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。
3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5u/次，改为4u/次，3u/次，2u/次，1u/次。
4、如果样品是溶液，直接取样100ul检测，检测步骤和计算方法不变。
5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后，取溶液100ul检测，检测步骤和计算方法不变。
凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤
凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量实验仪器和试剂:电子天平 酸度计 离心机 移液器 ４5度试管架 三羟甲基氨基甲烷（Tris ） 盐酸（Hcl) 生理盐水 蒸馏水 凝血酶 纤维蛋白原及常用玻璃仪器实验步骤：１、称取1.2１g 三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解,定溶到50ml,浓度为０.２mol/L 。
2、用移液器取４29ul 盐酸加蒸馏水充分溶解,定溶到５０ml ，浓度为0.1ml/Ｌ。
３、从1去25ｍl,从2取４0ｍl 混合调ＰＨ到７.4（用1或2调)，加蒸馏水定溶到10０ml 。
4、称取样品1g 放入试管加生理盐水5ｍl 充分溶解30分钟。
5、把4放入离心机离心10分钟,4000转/分。
6、取3(Ｔri ｓ缓冲液)１.6ｍl,稀释纤维蛋白原0.00８g,浓度0．5%。
7、用生理盐水配制40u/ml 的凝血酶溶液。
８、从5取上清液10０ul 。
９、从6取200ｕl 加入８充分摇匀后，吹一小气泡。
10、从７每分钟取5ul 加入9迅速摇匀后，匀速转动试管,观察反应,溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数)。
11、计算公式为:2211V C V C U其中C1=凝血酶的浓度Ｃ２=样品的浓度V１＝滴加凝血酶的体积V2=取样的体积注：1、滴加次数超过５次还不凝固的,应按一定倍数稀释样品。
2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。
3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5ｕ/次，改为４ｕ/次,3ｕ/次，2ｕ/次，１u/次。
4、如果样品是溶液，直接取样10０uｌ检测,检测步骤和计算方法不变。
5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后,取溶液1０0uｌ检测,检测步骤和计算方法不变。
水蛭粉中天然水蛭素的测定方法
产品中天然水蛭素的测定方法（《中国药典》2010年版1部规定的测定方法）方法提要（凝血酶滴定法）水蛭素能与凝血酶直接结合，使凝血酶失活，其结合比例为1:1，抗凝血酶单位以ATU 表示，即每消耗一个凝血酶单位(U)相当于一个抗凝血酶单位(ATU) 。
仪器设备0.75cm×10cm小试管；微量移液器（1～500μl、1～5ml）；45 度角试管架；秒表；恒温水浴箱；分析天平，感量0.0001克；pH测试仪；普通玻璃仪器。
试剂（人）纤维蛋白原；凝血酶； 0.2 mol/L的 Tris-Hcl缓冲液（pH7.4）；0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；0.1mol/L盐酸溶液；氯化钠；0.9％生理盐水。
溶液的配制1、Tris-HCl缓冲液（pH7.4）的配制将0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液约25 ml、0.1mol/L盐酸溶液约40ml和氯化钠0.8766g混合、溶解，调节pH值至7.4，然后加蒸馏水定容100ml(含0.15 mol 氯化钠)即成Tris-HCl缓冲溶液，备用。
2、0.5％（人）纤维蛋白原的配制用上述已配制好的Tris-HCl缓冲溶液溶解（人）纤维蛋白原，配成0.5%纤维蛋白原溶液（以凝固物计，现用现配），备用。
3、凝血酶溶液的配制用0.9％生理盐水配制成凝血酶浓度为40 U/ml的溶液（现用现配），备用。
分析步骤取1g样品粉末（过三号筛），精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清夜100μl置试管中，加入0.5％（人）纤维蛋白原溶液200μl、摇匀，用移液器在试管内的溶液中吹一小气泡作为观察标记（注意避免产生其它气泡），接着加入已配制好的凝血酶溶液，轻轻摇匀（3～5s，下同）、计时，然后将试管插入位于37℃恒温水浴箱的45 度角试管架中，轻轻旋转并观察气泡随液面转动情况，如气泡随液面转动即为反应终点，否则按每分钟滴加5μl凝血酶溶液至凝固（如滴加凝血酶溶液次数超过5次不凝固者应稀释样品，直至在3～5次为止）。
水蛭素的提取及含量测定
表 １ 氯 化钠 溶 液诱 导 结 果
１
实验 仪 器 、 料 及 试 剂 材
本 实 验 所 用 水 蛭 购 于 山东 省 济 宁 市 ， 佳 木 斯 大 学 药 学 经 院生药学教研室主任刘娟教授鉴定 。 Ｂ Ｚ ２ 自动 双 重 纯 水 蒸 馏 仪 （ 海 之 信 仪 器 有 限 公 Ｓ一 型 上 司 ） ５ Ｌ微 量 进 样 器 （ 海 安 亭 微 量 进 样 器 厂 ） １／ 微 量 ， 上 ，０ Ｌ ￣ 进样 器 （ 海 安 亭 微 量进 样 器 厂 ） 酶示 板 。 上 ， 凝 血 酶 （ 京 生 物 制 品 研 究 所 ） 纤 维 蛋 白 原 （ 海 市 生 北 ； 上 物 制 品 研 究所 ） 双 重 蒸 馏 水 （ ； 自制 ）Ｌ一精 氨 酸 （ 京 生 物 制 ； 北 品研 究 所 ） 牛 肠 系 膜 （ 木 斯 肉 联 厂 ） 氯 化 钠 （ 析 纯 ） 生 ； 佳 ； 分 ； 理 盐 水 （ 龙 江 省 肇 东 市 华 富 药业 有 限 责 任 公 司 ） 黑 。
２ 实 验 方 法
２ １ ． 诱 导 法
表２ 氯化钠＋Ｌ 精氨酸诱导结果 （ 一 Ｕ一４ ） Ｏ
本 实 验对 活 体 的诱 导 有 两 种 方 法 ， 种 用 不 同 浓 度 的氯 一
关 键 词 ： 蛭 素 ； 生诱 导 ； 血 酶 滴 定 水 仿 凝 中 图分 类 号 ； ８ 文 献 标 识 码 ： Ｒ２ ４ Ａ 文章 编 号 ： ０ ８ １ ４ ２ １ ） ４ ０ ８ —０ １ ０ —０ ０ （ ０ Ｏ ０ — ０ ７ １
水 蛭 素 是 从 水 蛭 中 提 取 的 一 种 酸 性 多 肽 ， 临 床 上 多 用 在 于 治 疗 不 稳 定 性 心 绞 痛 （ Ａ） 急 性 心 肌 梗 死 （ ） 血 管 形 ＵＳ ， ＡＭ ， 成术 ， 血液 透 析 ， 外 循 环 ， 移 植 （ Ｒ Ｔ）弥 漫性 血 管 内 凝 体 肾 Ｃ Ｒ ， 血 （Ｉ 等病症 。 Ｄ Ｃ） 天 然 水 蛭 索 的 分 离 与 纯 化 主 要 包 括 从 活 体 水 蛭 素 和 干 水 蛭 中分 离 提 取 水 蛭 素 。 统 的 水 蛭 素 的 获 得 是 对 水 蛭 的 一 传 次性 掠夺， 本 实验 采用诱 导方 法对活 体水蛭 素 的提取 ， 而 避 免 了 传 统 方 法 对 水 蛭 的 一 次 性 掠 夺 ， 护 了 水 蛭 的 野 生 资 保 源 ， 带 动 了水 蛭 养 殖 业 的 发 展 。 内 曾 报 道 了 一 种 能 利用 又 国 水 蛭 反 复 吸 血 并 用 其 嗉 囊 消 化 液 为 原 料 ， 不 杀 死 水 蛭 又 能 既 提取批量水蛭素的方法 。 水 蛭 素 的 含 量 测 定 方 法 有 多 种 ， 生 物 底 色 法 、 血 酶 如 凝 滴 定 法 、 散 射 法 、 联 免 疫 法 吸 附测 定 法 、 位 素 标 记 示踪 光 酶 同 法 等 。 实 验 采 用 凝 血 酶 滴 定 法 ，９０ Ｍａｋ ｒｔ 道 了 本 １７ 年 ｒｗａｄ 报 凝 血 酶 滴 定 法 ， 原 理 是 根据 水 蛭 素 与 凝 血 酶 结 合 比例 为 １ 其 ： １ｍｏ／ １和 １ ５ ｇ ｇ 。 血 酶 的 国 际 单 位 ＮＩ 水 蛭 素 的 （ ｌｍｏ） ： （／ ） 凝 Ｈ， 活 性 以 抗 凝 血 酶 活 力 单 位 ＡＴＵ 表 示 ， 个 ＡＵＴ 等 于 中 和 一 个 ＮＩ 凝 血 酶 的水 蛭 索 量 。 Ｈ
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产品中天然水蛭素的测定方法
（《中国药典》2010年版1部规定的测定方法）
方法提要（凝血酶滴定法）
水蛭素能与凝血酶直接结合，使凝血酶失活，其结合比例为1:1，抗凝血酶单位以ATU 表示，即每消耗一个凝血酶单位(U)相当于一个抗凝血酶单位(ATU) 。
仪器设备
0.75cm×10cm小试管；微量移液器（1～500μl、1～5ml）；
45 度角试管架；秒表；恒温水浴箱；分析天平，感量0.0001克；
pH测试仪；普通玻璃仪器。
试剂
（人）纤维蛋白原；凝血酶； 0.2 mol/L的 Tris-Hcl缓冲液（pH7.4）；
0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；0.1mol/L盐酸溶液；
氯化钠；0.9％生理盐水。
溶液的配制
1、Tris-HCl缓冲液（pH7.4）的配制
将0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液约25 ml、0.1mol/L盐酸溶液约40ml和氯化钠0.8766g混合、溶解，调节pH值至7.4，然后加蒸馏水定容100ml(含0.15 mol 氯化钠)即成Tris-HCl缓冲溶液，备用。
2、0.5％（人）纤维蛋白原的配制
用上述已配制好的Tris-HCl缓冲溶液溶解（人）纤维蛋白原，配成0.5%纤维蛋白原溶液（以凝固物计，现用现配），备用。
3、凝血酶溶液的配制
用0.9％生理盐水配制成凝血酶浓度为40 U/ml的溶液（现用现配），备用。
分析步骤
取1g样品粉末（过三号筛），精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液5ml，充
分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清夜100μl置试管中，加入0.5％（人）纤维蛋白原溶液200μl、摇匀，用移液器在试管内的溶液中吹一小气泡作为观察标记（注意避免产生其它气泡），接着加入已配制好的凝血酶溶液，轻轻摇匀（3～5s，下同）、计时，然后将试管插入位于37℃恒温水浴箱的45 度角试管架中，轻轻旋转并观察气泡随液面转动情况，如气泡随液面转动即为反应终点，否则按每分钟滴加5μl凝血酶溶液至凝固（如滴加凝血酶溶液次数超过5次不凝固者应稀释样品，直至在3～5次为止）。
记录消耗凝血酶溶液的体积。
结果表述
水蛭素含量按下列公式计算：
C 1×V
1
样品中水蛭素含量= ————
C
2×V
2
式中水蛭素含量单位为 ATU/g；
C
1
----凝血酶溶液的浓度，U/ml；
C
2
----供试品溶液的浓度，g/ml；
V
1
----消耗凝血酶溶液的体积，μl；
V
2
----供试验品溶液的加入量，μl；。