单增李斯特菌llsB基因克隆及序列分析

单增李斯特菌llsB基因克隆及序列分析 王欣雨;尹华;任静静;李红欢;蒋建军 【摘 要】试验旨在对新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2单增李斯特菌llsB基因进行克隆及生物信息学分析,以期进一步完善单增李斯特菌溶血素S的功能研究.根据GenBank中单增李斯特菌F2365基因全长序列(登录号为:AE017262)设计其特异性引物,利用PCR方法对新疆分离株LM90SB2的llsB基因进行扩增,回收目的基因与pMD19-T载体连接,采用PCR、双酶切鉴定筛选阳性菌并进行测序,对所获序列进行同源性比对及遗传变异分析.结果 显示,新疆分离株LM90SB2的llsB基因序列全长为876 bp,共编码291个氨基酸;LM90SB2分离株llsB基因核苷酸序列与10-0809、81-0592、81-0558、02-1792、NTSN、02-1289不同分离株同源性均为100％,与CIIMS-PH-1、NRRLB-57603株的同源性均为99.9％,与J1816、R2-502株的同源性为44.7％～45.0％.分子进化树显示,LM90SB2菌株llsB基因与血清型为4b的菌株亲缘关系较近,聚类为同一分支.蛋白质二级结构预测表明,LM90SB2 llsB蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,不形成跨膜结构.本试验成功克隆了LM90SB2株llsB基因,为深入探讨该基因功能提供全面的理论依据.

【期刊名称】《中国畜牧兽医》 【年(卷),期】2019(046)007 【总页数】9页(P1890-1898) 【关键词】单增李斯特菌;llsB基因;克隆;生物信息学分析 【作 者】王欣雨;尹华;任静静;李红欢;蒋建军 【作者单位】石河子大学动物科技学院,石河子832000;石河子大学动物科技学院,石河子832000;石河子大学动物科技学院,石河子832000;石河子大学动物科技学院,石河子832000;石河子大学动物科技学院,石河子832000

【正文语种】中 文 【中图分类】S852.61

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是重要的食源性人畜共患传染病病原之一[1],由该菌引起的感染发病率较低，病死率达20%～30%。同时该菌对环境的抵抗能力较强，在1～45 ℃均可生长增殖，-20 ℃可部分存活，并可抵抗反复冻融[2-3]。在医学临床中免疫功能不全者、孕妇、胎儿及新生儿都是单增李斯特菌的易感群体，并可以引起人的脑膜炎、败血症、流产及发热性胃肠炎等。在兽医临床中牛、羊易感，表现为败血症、神经症状即“转圈病”、孕畜流产等[4-5]。因此，该菌在对公共卫生安全造成较大危害的同时，也严重影响着畜牧业的生产，给养殖业的发展带来了一定的经济损失。单增李斯特菌感染过程中的每一步均由特定的毒力因子调控。2008年，Cotter等[6]首次发现了溶血素S(listeriolysion S,LLS)，LLS是一种与黏附侵袭相关的细菌素，仅出现在单增李斯特菌谱系Ⅰ型的一个子集中。感染小鼠口服LLS后发现，其在小鼠的肠道中高度表达，通过影响肠道内的其他微生物菌群，使其他细菌菌量减少，从而使单增李斯特菌成为优势菌群，单增李斯特菌菌量达到一定的量，从而穿越血肠屏障进入血液，在血液繁殖增长导致菌血症，同时又能够更深层次地感染其他脏器[7]。研究发现，单增李斯特菌与肠道微生物的相互作用是研究流行性单增李斯特菌病的关键一步，但其中的作用机理尚不明确[8]。本研究通过对新疆临床分离株LM90SB2的llsB基因片段进行克隆及测序，并对其进行生物信息学分析，为探讨llsB基因功能提供更全面的理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒 单增李斯特菌LM90SB2是石河子大学动物科技学院从新疆某羊场发病绵羊脑组织中分离，血清型为4b；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；pMD19-T(Simple)载体购自宝生物工程(大连)有限公司。 1.1.2 主要试剂 脑心浸液(BHI)培养基、胰蛋白胨、酵母浸粉等均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；质粒小提试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京诺维森生物科技有限公司；Trans5000 DNA Marker、2×PCR Mix均购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶(EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ)、T4 DNA连接酶均购自Promega公司(上海)；氨苄青霉素购自Sigma公司。 1.2 方法 1.2.1 引物设计及合成 参照GenBank中公布的单增李斯特菌标准株F2365基因全长序列(登录号为：AE017262)，利用Primer Premier 5.0软件设计llsB基因序列特异性引物，预期片段大小为876 bp。引物序列为：llsB-F：5′-CCGGAATTCATGATCGACTATGAGAAAAAAGGC-3′(含EcoR Ⅰ酶切位点和保护碱基)；llsB-R：5′-CCCCTGCAG-TCATTCCTTTCCACAAATATTTGT-3′(含Pst Ⅰ酶切位点和保护碱基)。引物由北京华大基因公司合成。 1.2.2 菌株培养及基因组DNA提取 将LM90SB2菌株划线接种于BHI固体培养基上，37 ℃静置培养18～24 h，挑取单个菌落接种于5 mL BHI液体培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养12～18 h，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌体DNA，-20 ℃保存备用。 1.2.3 PCR扩增 以提取的菌体DNA为模板，用llsB-F和llsB-R为上、下游引物PCR扩增目的片段。PCR反应体系20 μL：2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物(25 mmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。同时设置空白对照组。取10 μL PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将大小正确的条带经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收。 1.2.4 目的基因克隆及测序 目的基因回收产物与pMD19-T载体16 ℃过夜连接，使用冷热激法将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含Ampr (100 μg/mL)的LB固体培养基上，37 ℃静置培养12～16 h。挑取单个菌落于1 mL LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养6～8 h，以菌液为模板进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆菌送北京华大基因公司进行测序。 1.2.5 生物信息学分析 应用DNAStar软件将LM90SB2菌株llsB基因核苷酸序列与GenBank中单增李斯特菌不同菌株的该基因核苷酸序列(表1)进行同源性比对；应用Mega 7.0软件构建不同来源菌株llsB基因系统进化树；应用ProtParam在线软件对其基本理化性质进行分析；应用TMHMM在线软件分析蛋白质跨膜结构；应用SignalP 4.1 Server在线软件预测其蛋白质信号肽；应用TargetP 1.1 Server在线软件预测其在细胞内的定位；应用SMART和NCBI CDD软件预测其功能结构域；应用SOPMA和SWISS-MODEL软件预测蛋白质二级结构和三级结构。 表1 单增李斯特菌参考菌株信息 Table 1 Reference strains information of Listeria monocytoges 菌株StrainsGenBank登录号GenBank accession No.血清型Serotypes来源Source年份Years国家/地区Country/Region10-0809CP007167.14b粪便1981加拿大81-0592CP007526.14b新生儿血液1981加拿大81-0558CP007525.14b脑脊液1981加拿大02-1792CP007461.14b奶酪2002加拿大NTSNCP009897.14b绵羊脑2011中国江苏02-1289CP007460.14b粪便2002加拿大CIIMS-PH-1CP023321.1-李斯特菌病2016印度J1816CP006047.24b加工食品2002美国NRRLB-57603CP030101.11/2a脑脊液2002加拿大R2-502CP006594.11/2b食物1994美国 2 结 果 2.1 llsB基因的扩增及克隆 以LM90SB2菌株DNA为模板，用llsB-F、llsB-R引物对llsB基因进行PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测得到一条单一且清晰的目的条带，大小约为876 bp(图1)，与预期片段大小相符。测序结果显示，llsB基因序列长为876 bp，共编码291个氨基酸。 2.2 llsB基因核苷酸序列同源性比对 利用DNAStar软件将测序所得llsB基因核苷酸序列与GenBank中公布的10株不同来源的llsB基因序列进行同源性比对，结果显示，LM90SB2菌株llsB基因核苷酸序列与10-0809、81-0592、81-0558、02-1792、NTSN、02-1289不同分离株的同源性均为100%；与CIIMS-PH-1、NRRLB-57603菌株的同源性均为99.9%；与J1816、R2-502菌株的同源性为44.7%～45.0%(图2)。

M，DL5000 DNA Marker；1、2，llsB基因PCR扩增产物M,DL5000 DNA Marker;1 and 2,PCR amplification products of llsB gene图1 LM90SB2菌株llsB基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification products of llsB gene of LM90SB2 strain

图2 分离株llsB基因核苷酸序列与参考菌株同源性比对Fig.2 Homology alignment of nucleotide sequences of llsB gene between isolated strain