大肠杆菌检测方法步骤
大肠杆菌的检测MPN计数法
大肠杆菌的检测(MPN计数法) 大肠杆菌的检测在环境和食品微生物检测中至关重要，因为这些微生物的存在可能指示污染和潜在的健康风险。
MPN计数法是一种常用的检测大肠杆菌的方法，下面将详细介绍这种方法。
一、MPN计数法简介MPN计数法，全称Most Probable Number，即最可能数，是一种通过统计学方法估算微生物数量的方法。
它的基本原理是在一定的稀释度下，通过系列梯度稀释的样本中存在微生物的概率来推算样本中实际的微生物数量。
二、MPN计数法检测大肠杆菌的步骤1.样品采集：采集被检样品，如水、食品等，并按照无菌操作的要求进行处理，以避免污染和交叉感染。
2.制备稀释液：将样品进行一系列的稀释，如10-1、10-2、10-3等。
每个稀释度的样品需要进行三份平行试验，以增加结果的可靠性。
3.选择合适稀释度的样品：根据实验结果，选择适合的稀释度的样品进行MPN计数。
这个稀释度应该是使样品中大肠杆菌的数量落在10~100之间，以提高估算的准确性。
4.培养：将选择的稀释度的样品分别接种到含有特殊培养基的试管中，培养基是为了促进大肠杆菌的生长。
每个试管中接种的样品量为10ml。
5.结果分析：经过一定时间的培养后，观察每个试管中的菌落数并记录。
根据统计学原理，通过这些数据可以得出样本中大肠杆菌的最可能数。
6.结果报告：根据实验数据，计算并报告每100ml（或者每1g）样品中大肠杆菌的最可能数。
三、MPN计数法的优势和局限性优势：1.MPN计数法是一种广泛应用的方法，可用于估计微生物的数量，不仅适用于大肠杆菌，还适用于其他微生物。
2.该方法不需要昂贵的仪器设备，操作相对简单，可用于基层实验室。
3.MPN计数法可以提供微生物数量的范围，而非单一数值，对于初步估计和趋势分析具有一定的参考价值。
局限性：1.MPN计数法的主观性较强，结果会受到操作人员的影响。
因此，需要操作者接受专业培训并遵循严格的操作规程。
2.MPN计数法的准确性相对较低，尤其是在微生物数量较少的情况下，可能存在较大的误差。
大肠杆菌标准检测流程
大肠杆菌标准检测流程一、样品采集。
这可是检测的第一步呢，就像找宝藏得先知道宝藏大概在哪一样。
采集样品的时候得特别小心，要选对地方。
如果是检测食品里有没有大肠杆菌，那就要从食品的不同部位采集，像苹果的话，表面和果肉都得取点样，可不能只取一个地方就完事儿了。
要是检测水呢，那也得取有代表性的水样，比如说从水的表层、中层和底层都取一点混合起来，这样检测出来的结果才更靠谱。
采集样品的时候工具也要干净无菌，不然就把杂菌带进去了，那检测结果可就乱套了。
二、样品处理。
采集好样品就得处理啦。
对于固体的样品，像是食物之类的，得把它弄碎成均匀的小颗粒，就像把一块大蛋糕掰成好多小碎块一样。
然后加入一些特定的液体，这个液体能让大肠杆菌从食物颗粒里跑出来，进入到液体里，方便我们后续检测。
对于液体样品呢，要是比较浑浊的，可能还得过滤一下，把那些大的杂质去掉，留下清澈一点的液体，这样大肠杆菌在里面就更显眼啦。
三、增菌培养。
处理好的样品就可以进行增菌培养喽。
这就像是给大肠杆菌盖个小房子，还提供好多好吃的，让它们快快繁殖。
把样品放到专门的培养基里，这个培养基就像是为大肠杆菌特制的营养大餐，里面有它们生长需要的各种营养成分。
然后把这个放了样品的培养基放到合适的温度下，一般是37摄氏度左右，这个温度对大肠杆菌来说就像春天的阳光一样温暖舒适，它们就会在里面开心地繁殖起来啦。
这个过程可能得持续一段时间，几个小时到一天不等，就看大肠杆菌们的心情啦，哈哈，其实是看它们繁殖的速度啦。
四、分离培养。
等大肠杆菌繁殖得差不多了，就要把它们从一堆细菌里分离出来。
这时候就用到平板啦。
把增菌后的样品接种到平板培养基上，然后用一种特殊的方法把它们均匀地涂开，就像画画一样把细菌均匀地涂在平板上。
然后把平板放到培养箱里继续培养。
在平板上，大肠杆菌会长成一个个小菌落，每个菌落就像是一个小家庭一样，都是由一个大肠杆菌繁殖出来的。
而且大肠杆菌的菌落有它自己的特点，比如说颜色、形状、大小之类的，通过这些特点我们就能初步判断是不是大肠杆菌啦。
食品中大肠菌群的检测
食品中大肠菌群的测定
一、实验材料 1、设备和材料 温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、 平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针 2、培养基及试剂 乳糖 — 胆盐发酵管、乳糖发酵管、蛋白胨水、革兰氏染色 液
大肠菌群MPN记数法
三、实验方法与步骤 1、采样及稀释 ①固体和半固体样品：称取检样 25g，放于盛有 225ml 磷酸盐 缓冲液或生理盐水的无菌均质杯，以8000r/min～1000r/min的 速度处理1-2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲溶液或生理盐 水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，做成1：10 的样品匀液。 ②液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml磷酸盐缓 冲溶液或生理盐水的无菌锥形瓶充分混匀，制成1:10的样品匀 液。 ③样品匀液的PH应在6.5-7.5，必要时分别用1mol/LNaOH溶液 或1mol/LHOI溶液调节。
④用 1ml无菌吸管或微量移液管吸取 1:10样品匀液 1ml沿管壁 缓缓注入9ml磷酸盐缓冲溶液或生理盐水的无菌试管中，振荡 试管，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。 ⑤根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成 10倍 递增系列样品匀液。 2. 初发酵试验：每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品 匀液，每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白肉汤，每管接 种1ml，如未产气则继续培养至（48±2）h，产气者进行复发 酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
大肠菌群是指在一定培养条件下能发酵乳 糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏 阴性无芽孢杆菌。 大肠菌群主要来源于人畜粪便，故以此作 为粪便污染指标来评价食品的卫生质菌的检测
大肠杆菌的生物学特性 大肠埃希氏菌习惯称为大肠杆菌， 分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。 大肠杆菌为人和动物肠道中的常 居菌，一般多不致病，在一定条件下可 引起肠道外感染。
微生物大肠杆菌检测方法
微生物大肠杆菌检测方法微生物大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，它可以以多种方式进入人体，包括通过摄入受污染的食物或水，以及通过直接接触感染或间接接触感染。
大肠杆菌是一种潜在的致病菌，它可以引起食物中毒，导致腹泻、腹痛、呕吐等症状。
因此，对大肠杆菌进行快速而准确的检测非常重要。
一般来说，对大肠杆菌的检测可以分为两种方法：传统方法和分子生物学方法。
传统方法主要包括培养法和生化检测法。
培养法是将样品在富含营养物的培养基上进行培养，并通过观察菌落形态、生理生化特性等来识别是否存在大肠杆菌。
常用的培养基包括大肠杆菌选择性培养基（如紫胶杆菌平板和免疫球蛋白平板）和大肠杆菌检测培养基（如二甲基绿平板和温和滴定培养基）。
在培养过程中，大肠杆菌通常会表现为革兰氏阴性、产生气体、氧可用的以及发酵甘露糖等特性。
这种方法的优点是简单易行，成本低廉，但需要较长的培养时间，一般需要24-48小时才能得到结果。
生化检测法是通过检测大肠杆菌产生的特定酶或其他代谢产物来快速识别该菌株。
传统的生物化学试剂盒可以用于检测大肠杆菌的存在，如白酒石酸盐绿的发酵和产气检测。
这种方法的优点是快速、简单，但缺点是它无法提供准确的菌株识别，因为其他细菌也可能产生相似的酶和代谢产物。
分子生物学方法是一种基于DNA或RNA的检测方法，可以提供更准确和快速的识别大肠杆菌。
这些方法包括聚合酶链反应（PCR）、实时荧光PCR、核酸杂交和基因测序等。
PCR是最常用的方法之一，它利用特定的引物扩增目标DNA 序列，然后通过凝胶电泳分析扩增产物，从而确定是否存在大肠杆菌。
PCR方法的优点是高度敏感和特异性，可以在几个小时内得到结果，但缺点是需要复杂的实验设备和技术，并且可能受到PCR抑制物质的干扰。
在实际应用中，常常会结合多种方法来进行微生物大肠杆菌的检测。
例如，可以通过培养法获得初步结果，并用PCR方法进行鉴定确认。
此外，还可以采用免疫学方法来检测大肠杆菌，如流式细胞仪和ELISA等。
大肠杆菌检验方法
大肠杆菌检验方法
大肠杆菌(Escherichia coli)是一种革兰氏阴性的厌氧菌，常常被用作指示性微生物来评估食品和水源的卫生质量。
以下是常见的大肠杆菌检验方法：
1. 培养基方法：将样品接种在包含大肠杆菌生长所需营养物质的培养基上，如大肠杆菌选择性琼脂培养基(MacConkey琼脂培养基)和EC培养基等。
大肠杆菌能够利用琼脂中的乳糖发酵产生酸，导致培养基呈现红色或粉红色。
此外，EC 培养基还包含了可以检测大肠杆菌β-葡萄糖苷酶的亚甲基红试剂，如果大肠杆菌存在，则培养基呈现金属光泽。
2. 确认方法：对落有培养基上的鲜艳深色菌落进行进一步确认。
典型的确认方法包括革兰染色、目测观察形态特征、氧化发酵试验和测试产气杆菌酶试验。
3. PCR检测方法：利用聚合酶链反应(PCR)技术，从样品中扩增大肠杆菌特异性基因片段（如16S rRNA基因），然后通过凝胶电泳检测扩增产物。
4. 快速方法：如免疫层析试纸法和光学组织测定法。
免疫层析试纸法利用抗大肠杆菌抗体与大肠杆菌特异性抗原结合生成可视化结果。
光学组织测定法利用大肠杆菌的β-葡萄糖苷酶水解比色底物产生颜色变化。
这些方法都可用于检测大肠杆菌在食品和水源中的存在及其数量。
在进行检验时，应严格遵守相关的操作规程和实验室操作规范，以确保结果的准确性和可靠性。
大肠杆菌菌落总数检测步骤
大肠杆菌及菌落总数检测方法为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。
下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。
一、大肠杆菌：1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例）双料试管配制A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。
B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。
C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。
单料试管配制A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。
B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。
C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。
2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。
3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。
4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下：A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后及25g样品混合均匀。
（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合）B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。
C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。
D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。
E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。
F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。
G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml吸管取样品液体分别注入双料试管中H、用1ml吸管取-2培养试管液体，分别注入到单料试管中。
I、装好液体的试管，用试管塞封好，放到36℃±1℃的恒温培养箱中24小时培养。
J、24小时培养后，取出并用肉眼观察试管的颜色及冒气泡情况，若有其中的任意状况，说明有大肠杆菌，需要通过美兰做进一步的检测。
大肠杆菌的测定(精)
水中总大肠杆菌的测定来源:加入时间:2010-3-30 12:15:511 原理总大肠杆菌群可用多管发酵法或滤膜法检测。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖,产酸产气以及具备革兰氏染色阴性,无芽孢,呈杆状等有关特性,通过三个步骤进行检验,求得水样中的总大肠菌群数,实验结果以最可能数(most probable number,简称 MPN 表示。
2仪器2.1 高压蒸汽灭菌器。
2.2 恒温培养箱,冰箱。
2.3 生物显微镜,载玻片。
2.4 酒精灯,镍铬丝接种棒。
2.5 培养皿 (直径 100mm ,试管(5×150mm,小倒管,吸管 (1, 5, 10ml ,烧杯 (200, 500, 2000ml , 锥形瓶 (500, 1000ml ,采样瓶。
3 培养基及染色剂的制备3.1 乳糖蛋白胨培养液:将 10g 蛋白胨、 3g 牛肉浸膏、 3g 乳糖和 5g 氯化钠加热溶于 1000mL 蒸馏水中,调节 pH 为 7.2-7.4, 再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL ,充分混匀,分装于试管(内有倒管中,于 121℃高压灭菌器中灭菌 15min ,贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩蛋白胨溶液:按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法制备。
除蒸馏水外,各组分用量增加至三倍。
3.3 品红亚硫酸钠培养基3.3.1 贮备培养基的制备于 2000mL 烧杯中,先将 20-30g 琼脂加到 900mL 蒸馏水中,加热溶解,然后加入3.5g 磷酸氢二钾及 10g 蛋白胨,混匀,使其溶解,再用蒸馏水补充到 1000mL 调节溶液pH 至 7.2-7.4。
趁热用脱脂棉或绒布过滤,再加 10g 乳糖,混匀,定量分装于 250或500mL 锥形瓶内,置于高压灭菌器中,在 121℃灭菌 15min , 贮存与冷暗处备用。
3.3.2 平皿培养基的制备将上法制备的贮备培养基加热融化。
根据锥形瓶内培养基的容量,用灭菌吸管按 1:50比例吸取 5%碱性品红乙醇溶液,置于灭菌空试管中;再按 1:200比例称取无水亚硫酸钠,置于另一灭菌空试管内,加灭菌水少许使其溶解,再置于沸水浴中煮沸10min (灭菌。
大肠杆菌检测大肠菌群测定操作细则中英文对照版重点
3.1.4according to the standards of food hygiene requirements or to sample contamination estimation, choice of three dilutions, each dilution, inoculated with 3 tubes.
2培养基和试剂
2.1乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4EC肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
1.1温箱：36±1℃。1.2冰箱:0〜4℃。1.3恒温水浴：44.5±0.5℃。1.4天平。1.5显微镜。1.6均质器或乳钵。1.7平皿:直径为90mm。1.8试管。1.9吸管。1.10广 口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。1.11玻璃珠:直径约5mm。1.12载玻片。1.13酒精灯。1.14试管架。
二样本采集
检样主要为含乳酸菌活菌的饮料和微生态制剂，样本应放入冰箱保存，心快检验。
三检验方法（中华人民共和国国家标准乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验GB/T 16347-1996）
乳酸菌菌总数的测定：乳酸菌菌落总数是指标样在一定条件下培养后，所得1ml检样中所含 乳酸菌菌落的总数。
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饮用水中大肠杆菌及检测方法
一、乳糖发酵实验（初发酵实验）
溶液与试剂：
乳糖胆盐发酵管
成分：蛋白胨20g，猪胆盐5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，蒸馏水1000mL，pH7.4。
（乳糖胆盐培养基取30g，溶于1000mL纯水中即可）
操作步骤
1：将配制好的培养液，分装于每管10mL，共装9个试管，并各放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。
2：水样稀释
（1）无菌操作取水样1 mL放于含9mL的灭菌生理盐水中，置于容量瓶中，震荡摇匀为1:10的稀释液。
取上述稀释液1mL，注入9mL灭菌生理盐水，震荡摇匀，为1:100的稀释液。
（2）取水样，1:10稀释液，1：100稀释液各1mL接种到乳糖胆盐发酵管中。
（根据检样的污染程度可以适当调整稀释的比例）每一稀释度接种三管。
3：将试管连同试管架放入培养箱中37℃左右培养24h。
产酸溶液会由紫色变为黄色，产气发酵管中会有气泡。
如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则报告大肠杆菌群阴性，如有产气管，就需要进行分离培养，即进行伊红美蓝培养基鉴别实验。
二、伊红美蓝培养基鉴别实验（接种实验）
伊红美蓝琼脂（EMB)
成分：蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，琼脂17g，2%伊红溶液20mL。
0.65%美蓝溶液10mL，蒸馏水1000L，pH7.1.
制法：将蛋白胨，磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min，备用。
临用时加入乳糖，并加热融化琼脂，冷至50~55℃，加入伊红美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
操作步骤
1称量：准确称取各成分。
2 溶化：加热熔化，定容。
3 调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。
4 灭菌：将两个500ml的三角瓶中加上棉塞。
将培养皿用报纸包好，放入灭菌锅内，121℃高压灭菌15min。
5 倒平板（均在无菌台中操作）：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。
其过程是：
①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；
②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；
③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；
④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。
向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。
否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。
6 接种：
将之前产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上
划线分离法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。
划线到最后，可使细菌间的距离加大。
7 细菌培养：将接种好的培养皿放入培养箱中37℃、培养20~24小时。
观察菌落形态。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂培养基上呈现深黑紫色，且有金属光泽菌落。
证实实验：
在上述平板上，挑取可疑大肠杆菌1~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36±1）℃恒温培养箱培养（24±2）h，观察产气情况。
凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告大肠杆菌阳性。
三、革兰氏染色镜检实验
1 溶液与试剂
无菌生理盐水，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染夜，香柏油，二甲苯（或成品革兰氏染液）
2 仪器
酒精灯，载玻片，显微镜，两个长铁条（做架子用），接种环，滴管、吸水纸等
3 染色
初染：滴加草酸结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色2min，水洗至流出水无色。
媒染：用卢戈氏染液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。
脱色：将玻片上的水用吸水纸吸取，用滴管流加95%乙醇脱色（持续20秒），稍后立即洗去乙醇。
复染：将玻片上的水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水烤干。
4镜检
分别用香柏油覆盖涂菌部位，先用低倍镜找到菌，换用的物镜观察染色情况。
观察结束后，用二甲苯擦洗镜头。
备注：大肠杆菌是一种能发酵乳糖、产酸产气和兼性厌氧的革兰氏阴性菌，革兰氏染色呈红色。
报告
根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL检样的大肠杆菌的最可能数。