微生物培养技术

（四）案例：大肠杆菌的分离和纯培养
1、微生物实验室培养的基本操作程序
（1）器具的灭菌 （3）培养基的灭菌 （5）微生物接种 （7）菌种的保存 （2）培养基的配制 （4）倒平板 （6）恒温箱中培养
2、大肠杆菌的分离和纯培养步骤 （1）制备牛肉膏蛋白胨培养基
（2)配制培养基：计算称量；熔化； 调PH；分装； 灭菌； 倒平板 （3）接种：平板划线法；稀释涂布平板法。 （4）培养： 倒置，37℃恒温箱，12和24h。 （5）纯化培养：倒置，37℃恒温箱，24h。 （6）菌种保藏：临时、长期保存法。
每克样品中的菌数＝(C/ V)× M C:代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V:代表涂布平板时所用的稀释液的体积 M：稀释的倍数
注意事项
菌落数的选择： 一般选择菌落数在30～300的平板上进行计数。 当只有一个稀释倍数的平均菌落数符合此范围时，则 以该平均菌落乘以稀释的倍数； 若有两个稀释倍的平均菌落数均在30～300之 间，则按两者菌落总数之比值来决定：若比值小于2 应采取两者的平均数，若大于2，则取其中较小的菌 落总数。
或 80 ℃下煮15min
C、化学药剂消毒法:用酒精进行皮肤消毒;
氯气消毒水源 D、射线消毒法
2、灭菌
（1）定义：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的
微生物，包括芽孢和孢子 。
（2）灭菌的方法：
A、灼烧灭菌
B、干热灭菌：
160-170 ℃下加热1-2h。
C、高压蒸汽灭菌：
100kPa、121 ℃下维持 15-30min.
（三）接种技术（课本第2页）
1.定义 2.平板培养基上接种方法
平板划线法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法
平板划线的操作方法


连续划线法 交叉划线法
稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将 不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养 基的表面，进行培养。
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起 的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培 养基表面形成单个的菌落。
（三）、实验流程
（1）土壤取样 （3）梯度稀释 （2）选择培养（可省略） （4）涂布培养
（5）挑选产生透明圈的菌落
（6）微生物培养（纯培养）
三、测定微生物的数量
一、基础知识
（一）测定微生物数量的方法
1.直接计数法
最常用：显微镜直接计数法
（方法、优点、缺点、适用条件）
2、间接计数法：
最常用的是稀释平板计数法
专题一
微生物培养技术
非细胞生物：病毒
微生物
原核生物：细菌、放线菌、支原体、 立克次氏体 真核生物：真菌（酵母菌、霉菌）
菌落：
• 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁 殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有 一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。 • 菌落是鉴定菌种的重要依据。
细菌的营养类型
• 根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将 细菌分为两大营养类型。 • 自养型: 光合自养型:光合细菌
4.培养基的配制步骤（第8页）
（以牛肉膏蛋白胨固体培养基为例）
（1）.计算:根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的
比例，计算配制100mL的培养基 时，各种成分的用量。 （参考课本83页培养基配方）
称量：准确地称取各种成分。牛肉膏比较黏稠，
可以用玻棒挑取，放在称量纸上称量。牛 肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称量时动作要 迅速，称后要及时盖上瓶盖。
化能自养型:硝化细菌
• 异养型: 腐生菌 寄生菌
一、微生物的分离和纯培养
（3项技术1个案例）
（一）培养基配制技术
（二）无菌技术 （三）接种技术
案例：大肠杆菌的分离和纯培养
（一）培养基配制技术
1、培养基定义：（课本第2页） 2、营养构成：
营养成分：水、无机盐、碳源、氮源、生长因子 环境条件：pH、氧气、二氧化碳、渗透压等
3.培养基的分类
（1）按物理状态分：
固体培养基和液体培养基、半固体培养基。
固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等 半固体培养基可观察微生物的运动
液体培养基常用于发酵工业。
固体培养基
斜面培养基
平板培养基（课本第2页）
固体培养基中需加入凝固剂，如琼脂
半固体培养基
半固体培养基中也需 要加入凝固剂琼脂，但加 入量少于固体培养基。
（2）.溶化：
①加水加热熔化牛肉膏
将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯加入少量的 水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分 离后，用玻棒 取出称量纸。
②加入蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解； ③加入琼脂； ④用蒸馏水定容到100mL。 整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊 底而导致烧杯破裂。
（3）.调节pH
无运动
有运动
液体培养基
表面长
均匀混浊生长
沉淀生长
（2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基
选择培养基
定义（课本第7页）
举例： 加入青霉素的培养基:抑制细菌和放线菌的生长，
分离酵母菌、霉菌等真菌。
加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌
鉴别培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某 种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同 种类的微生物。 例如：在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来 鉴别大肠杆菌。 如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝
菌种的保存
1、临时保藏： 接种到固体斜面培 养基，菌落长成后 置于4℃冰箱保存。 2、长期保存： 甘油冷冻管藏法 -20 ℃冷冻箱保存
二、培养基对微生物的选择作用
【案例】分解纤维素的微生物的分离
（一）、基础知识
1、纤维素与纤维素酶
纤维素是一种多糖
纤维素酶是一种复合酶
C1酶、Cx酶
葡萄糖苷酶
纤维素
（4）.分装、包扎 （5）.灭菌 （6）倒平板
倒平板
待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯附近倒平板。 ①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞； ②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰； ③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培 养皿，立刻盖上皿盖。 ④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
倒平板技术
（二）无菌技术
无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防 止杂菌污染的方法。
１、消毒
（1）定义：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体
表面或内部一部分对人体有害的微生物（不 包括芽孢和孢子）
（2）消毒的方法：
A、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min
B、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min
结合，使菌落呈蓝紫色，并带有金属光泽。
(课本15页)
（3）按成分分：合成培养基和天然培养基
合成培养基:
用化学成分已知的化学物质配成的，因成分明确， 常用于分类、鉴定等 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化 合物、无机盐和其它一些辅助物质。
天然培养基：
用化学成分不明确的天然物质配成的，如血清、 组织提取液等
稀释涂布平板法 稀释平板法 稀释混合平板法
二、实践案例
（一）测定饮用水中大肠杆菌的数目 配制ＥＭＢ培养基 倒平板 接种（滤膜法） 培养 观察记录
（二）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1、土壤取样 2、配制培养基 尿素琼脂培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
3、样品稀释 4、取样及平板接种（涂布平板或混合平板） 细菌：一般选用104 、105 、106倍的稀释液进行培养 放线菌：一般选用103 、104 、105倍的稀释液 真菌：一般选用102 、103 、104倍的稀释液
5、培养与观察：
细菌：30～370C的温度下培养1～2d； 放线菌：25～280C的温度下培养5～7d； 霉菌：25～280C的温度下培养3～4d。 在以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂， 指示剂变红，就可以准确的鉴定该种细菌能够分解尿素。
6、细菌计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进 行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数， 然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品 中细菌的数目。
纤维二糖
葡萄糖
（二）、筛选
1、方法： 刚果红染色法
原理：刚果红（CR）可以与纤维素形成红 色复合物，当纤维素被纤维素酶分 解后，红色复合物无法形成，出现 以纤维素分解菌为中心的透明圈， 我们可以通过是否产生透明圈来筛 选纤维素分解菌。
常用的刚果红染色法有两种
一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应， 另一种是在倒平板时就加入刚果红 方法一：在长出菌落的培养基上，覆盖1mg/mL的CR 溶液，10—15min后，倒去CR溶液，加入 1mol/L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液。 方法二：配制质量浓度为10mg/mL的CR溶液，灭菌 后，按照每200mL培养基加入1mL的比例加入 CR溶液，混匀后倒平板。