QBHHS JC002-2013 发酵豆粕中不良寡糖的定性检测方法
发酵豆粕中抗原蛋白和不良寡糖的检测
发酵豆粕中抗原蛋白和不良寡糖的检测发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测——SDS-PAGE法1．适用范围本标准适用于测定发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测。
2．仪器设备2.1蛋白电泳仪：2.1.1 电泳仪；（建议使用：北京六一仪器DYY-2C型）2.1.2 电泳槽；（建议使用：美国伯乐公司的mini型）2.2 25μl微量进样器；2.3 制胶装置；（与电泳槽配套出售，包括玻璃板(厚度分别为1.0 mm和 1.5mm各一套)，梳子，拨胶板）2.4 移液枪(1000μl,200μl,10μl)以及其配套枪头；（属于常规实验耗材）3．试剂3.1 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED；（建议购至上海申能博彩，Chemisonic 进口分装，必须要进口的产品！国产做出来的结果很差）；分析纯；3.2 无水酒精，分析纯；3.3 甘氨酸，分析纯；3.4 Tris，分析纯；3.5 考马斯亮兰R250，分析纯；3.6甲醇，分析纯；3.7 冰醋酸，分析纯；3.8 甘油（丙三醇），分析纯；3.9 β-巯基乙醇，分析纯；3.10 溴酚蓝，分析纯；3.11 HCl，分析纯；4.试剂的配置4.1 SDS-PAGE溶液的配制：30%丙烯酰胺的配制：丙烯酰胺 30.0gN’N-甲叉双丙烯酰胺 0.8g去离子水定容至100ml4.2 10%过硫酸铵：将1g过硫酸铵溶于10.00ml去离子水中。
2.00mol/L Tris-HCl(pH=8.8)：称取Tris 121.14g溶于500mL蒸馏水中，用浓盐酸调节pH至8.8(要求准确)。
1.00mol/L Tris-HCl(pH=6.8)：称取Tris 60.57g溶于500mL蒸馏水中，用浓盐酸调节pH至6.8(要求准确)。
10%SDS：称取5gSDS溶于50ml蒸馏水中。
1.0% 溴酚兰：称取0.05g溴酚兰溶于5ml蒸馏水中。
4.3 染色液：考马斯亮兰R250 0.25g甲醇 45.40ml冰醋酸 9.20ml水 45.40ml4.4 脱色液：甲醇 456.0ml冰醋酸 72.0ml水 472.0ml4.5 4×分离胶缓冲液：2.00mol/L Tris-HCl(pH=8.8) 75ml10%SDS 4ml蒸馏水 21ml10%过硫酸铵 5ml4.6 4×堆积胶缓冲液：1.00mol/L Tris-HCl(pH=6.8) 50ml10%SDS 4ml蒸馏水 46ml10%过硫酸铵 5ml4.7 电泳缓冲液： Tris 3.0g甘氨酸 14.4gSDS 1.0g定容至1L，用HCl调节pH为8.3。
您须知道的发酵豆粕真正品质评判的测定方法说明【五】
您须知道的发酵豆粕真正品质评判的测定方法说明【五】发酵豆粕中的小肽与抗原蛋白是衡量品质优劣的两项重要指标，长期以来国内的发酵豆粕产品主要由乳酸菌通过厌氧发酵生产，而出于便捷考虑，业内通常使用酸溶蛋白法测定小肽含量，使用ELISA法测定抗原蛋白含量，但随着发酵豆粕使用普遍性提高，并且芽孢杆菌通过有氧发酵生产的发酵豆粕在国内市场上渐露锋芒，这两种测定方法是否适用，是否能作为客观反映小肽和抗原蛋白真实含量的指标，引起了关注与讨论。
1 小肽-酸溶蛋白法①不同pH 发酵(或酶解)的豆粕在酸中的溶解度不同微生物发酵过程中对蛋白质的分解，实质上就是微生物产蛋白酶的作用。
但是，不同酸碱性的蛋白酶酶解豆粕所得的小肽在酸中的溶解度不同，其中酸性蛋白酶酶解小肽高达96%可以溶于三氯乙酸，而碱性蛋白酶酶解小肽不到 50%。
因此，酸溶蛋白更适合评估酸性发酵或酶解的豆粕产品，将低估希杰速益肽这类芽孢杆菌发酵的中偏碱性产品的小肽含量(刘慧珍，江南大学硕士论文，2007)。
速益肽 55%CP 产品酸溶蛋白相对低(6-10%)。
②小肽应有明确的分子量定义食品国家标准《大豆肽粉GBT 22492》2008 版将小肽的定义由③酸溶蛋白只体现了速益肽小肽含量的一小部分希杰研究所实验发现，同时测定的发酵豆粕样品整体蛋白分布(红色峰)和三氯乙酸溶解后上清液的蛋白分布结果(蓝色峰)。
三氯乙酸提取的分子量5kDa 以下蛋白质部分，而红色图谱和蓝色图谱之间存在一个灰色的面积区域是三氯乙酸没有办法提取出来的样品中的肽含量的部分，即三氯乙酸并不能完全溶解出样品中的所有的肽，只能溶解出其中的一小部分(如下图)。
2 抗原蛋白-ELISA 法和SDS 法①ELISA 法测定加工豆类产品的缺陷致敏性不确定：目前已有商品化大豆抗原蛋白的检测试剂有大豆球蛋白检测试剂盒和β-伴大豆球蛋白检测试剂盒，但是另两种大豆抗原蛋白 Gly m Bd 30K 和 Gly m Bd 28K 并没有商品化试剂盒。
发酵豆粕各项指标检测方法与实用实用标准
发酵豆粕各项指标检测方法与标准发酵工艺2010-12-31 15:16:17 阅读86 评论0 字号：大中小订阅1、水份、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰份、钙和磷的分析方法全部采用国标法。
2、总有机酸测定采用氢氧化钠滴定的方法和乳酸测定采用气象色谱。
3、pH的测定采用玻璃电极pHS-3C型pH计测定。
4、可溶蛋白的测定方法5、小肽含量的测定水份的测定水份测定直接参见国标测定完水分后的样品需要测定其中的总有机酸的含量，其数值为A，并计算有机酸的挥发量。
水份含量的计算时应当扣除这部分有机酸的挥发量，否则会出现水分超标现象。
总有机酸检测试剂：NaOH标准溶液（邻苯二甲酸氢钾标定），酚酞指示剂仪器:磁力搅拌器离心机方法：（1）取发酵后鲜样品15g 置于150ml烧杯中加入溶于100ml去离子水，在磁力搅拌器上浸提30min。
（2）取部分浸提样离心10min(3000r/min)。
（3）取上清液15ml, 加30ml去离子水稀释（以消除底色的影响），加酚酞指示剂四滴，用0.1molNaOH 标准溶液滴定，并记录到终点消耗NaOH体积。
（终点到溶液呈现粉红）计算乳酸（％）＝N(NaOH)×V(NaOH) ×0.09008/15×115/15gN(NaOH):NaOH标准溶液的浓度；V(NaOH) ：消耗NaOH标准溶液体积；0.09008：乳酸的毫克当量。
0.1mol氢氧化钠的配制与标定1、配制：称取9.6g氢氧化钠，溶于100ml水中，摇匀，注入聚乙烯容器中，密闭放置至溶液清亮。
用塑料管虹吸5ml的上清液，注入2000ml无二氧化碳水中(将去离子水煮沸5分后冷却)，摇匀。
2、标定称取0.67g于105~110℃烘至恒重的基准的邻苯二甲酸氢钾，准确至0.0001g，溶于50ml的无二氧化碳水中，加4滴酚酞指示剂（0.1％），用配制好的氢氧化钠溶液滴定至溶液呈粉红色，同时作空白试验。
发酵豆粕各项指标检测方法与标准
发酵豆粕各项指标检测方法与标准发酵工艺2010-12-31 15:16:17 阅读86 评论0 字号：大中小订阅1、水份、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰份、钙和磷的分析方法全部采用国标法。
2、总有机酸测定采用氢氧化钠滴定的方法和乳酸测定采用气象色谱。
3、pH的测定采用玻璃电极pHS-3C型pH计测定。
4、可溶蛋白的测定方法5、小肽含量的测定水份的测定水份测定直接参见国标测定完水分后的样品需要测定其中的总有机酸的含量，其数值为A，并计算有机酸的挥发量。
水份含量的计算时应当扣除这部分有机酸的挥发量，否则会出现水分超标现象。
总有机酸检测试剂：NaOH标准溶液（邻苯二甲酸氢钾标定），酚酞指示剂仪器:磁力搅拌器离心机方法：（1）取发酵后鲜样品15g 置于150ml烧杯中加入溶于100ml去离子水，在磁力搅拌器上浸提30min。
（2）取部分浸提样离心10min(3000r/min)。
（3）取上清液15ml, 加30ml去离子水稀释（以消除底色的影响），加酚酞指示剂四滴，用0.1molNaOH 标准溶液滴定，并记录到终点消耗NaOH体积。
（终点到溶液呈现粉红）计算乳酸（％）＝N(NaOH)×V(NaOH) ×0.09008/15×115/15gN(NaOH):NaOH标准溶液的浓度；V(NaOH) ：消耗NaOH标准溶液体积；0.09008：乳酸的毫克当量。
0.1mol氢氧化钠的配制与标定1、配制：称取9.6g氢氧化钠，溶于100ml水中，摇匀，注入聚乙烯容器中，密闭放置至溶液清亮。
用塑料管虹吸5ml的上清液，注入2000ml无二氧化碳水中(将去离子水煮沸5分后冷却)，摇匀。
2、标定称取0.67g于105~110℃烘至恒重的基准的邻苯二甲酸氢钾，准确至0.0001g，溶于50ml的无二氧化碳水中，加4滴酚酞指示剂（0.1％），用配制好的氢氧化钠溶液滴定至溶液呈粉红色，同时作空白试验。
发酵豆粕的检测方法
发酵豆粕的检测方法引言发酵豆粕是一种富含营养的饲料原料，通过发酵过程可以改变其营养成分和口感等特性。
为了确保发酵豆粕的品质和安全性，需要进行一系列的检测方法。
本文将介绍发酵豆粕的检测方法，并重点讨论营养成分、微生物、重金属以及有害物质的检测方法。
营养成分是评价饲料品质的重要指标之一、以下是一些常用的发酵豆粕营养成分的检测方法：1.水分含量检测：采用干燥法测定。
2. 粗蛋白含量检测：采用Kjeldahl法测定。
3. 粗脂肪含量检测：采用Soxhlet萃取法测定。
4. 粗纤维含量检测：采用Weende方法、AOAC方法或Van Soest方法测定。
5.粗灰分含量检测：采用高温炉燃烧法测定。
微生物含量是评估发酵豆粕安全性的重要指标。
以下是一些常用的发酵豆粕微生物检测方法：1.总菌落计数：采用平板计数法或膜过滤法。
2.酵母和霉菌计数：采用平板计数法或膜过滤法。
3.大肠菌群检测：采用MPN法或膜过滤法。
4.乳酸菌计数：采用平板计数法或膜过滤法。
重金属含量是评估发酵豆粕的环境污染程度的重要指标。
以下是一些常用的发酵豆粕重金属检测方法：1.铅和镉的测定：采用火焰原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法。
2.汞的测定：采用氢化物液相色谱法或电感耦合等离子体质谱法。
3.铬、镍、锰和锌的测定：采用火焰原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法。
有害物质的含量是评估发酵豆粕的安全性的重要指标。
以下是一些常用的发酵豆粕有害物质检测方法：1.黄曲霉毒素的测定：采用高效液相色谱法或气相色谱法。
2.农药残留的测定：采用气相色谱法或液相色谱法。
3.病原体的检测：采用PCR法或快速培养法。
结论发酵豆粕的检测方法包括营养成分、微生物、重金属以及有害物质的检测方法。
这些方法可以评估发酵豆粕的品质和安全性，确保其在畜牧养殖中的应用效果。
在实际应用中，还需要根据具体情况选择合适的检测方法，并严格执行相关的检测标准，保证检测结果的准确性和可靠性。
发酵豆粕质量评价方法
发酵豆粕质量评价方法豆粕发酵通常采用固体发酵法，由于传统意义上的固体发酵较粗放，从而容易导致产品的不均匀，产品外观的观测也是判断产品优劣的基本条件，对发酵豆粕的评判，主要可通过以下几方面进行评价。
1.感官评判优质发酵豆粕的产品粒度均匀，色泽一致，较原豆粕略深（产品粒度越细，颜色越浅），有淡淡发酵香味，无豆腥味，且因同一批次的产品加工条件和原料较一致，产品感官的一致性可反映出其生产工艺的稳定性。
2.抗腐败能力好的发酵豆粕在整个发酵生产过程的卫生状况非常好，但如果发酵过程中没有做好消毒卫生工作，染菌情况会非常严重。
判断是否染菌可用清水浸泡，优质的发酵豆粕在25℃环境中，1周内不会变味，气味依然芬芳；而染菌不良者，同样条件，2天就会发臭冒泡。
3.粗蛋白质发酵豆粕的粗蛋白质含量达到50%，是由于去除了不良寡糖和降低了水分浓缩而成的，发酵程度越好，粗蛋白质含量越高。
以46%的豆粕为原料来发酵的话，发酵豆粕成品的粗蛋白质含量一般为48%－51%。
粗蛋白质含量也不是越高越好，发酵豆粕成品的粗蛋白质超过51%的话，一来有掺假的嫌疑，二来发酵损耗过大，得率不高。
3.小肽（酸溶蛋白）可间接地反映地反映发酵豆粕抗原的降解情况。
发酵豆粕的小肽含量大概在8%－12%左右（相对于所含蛋白质的比例），发酵程度越好，小肽含量越高，但如果小肽含量超过15%，则产品粘度过高，干燥困难。
4.酸度（以乳酸计）反映发酵情况。
酸度应大于2%，过低则可能发酵程度不足或发酵控制不当而产氨。
5.氢氧化钾蛋白质溶解度(PS)反映大豆粕产品加热过度的情况。
发酵豆粕是豆粕的二次加工产品，选择合适的烘干工艺可有效防止产品蛋白溶解度的降低，保证产品的营养品质，一般应为65－85%。
蛋白溶解度低于65%几乎可以肯定豆粕加热过度，营养价值已受到破坏，大于85%则表示加热不足，豆粕的一些抗营养因子还未完全失去活性，降低了豆粕的品质。
6.挥发性盐基氮（VBN)反映发酵豆粕非蛋白氮添加情况和杂菌污染情况。
QBHHS JC003-2013 发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测办法
8%分离胶不同体积各成分含量详表 含量/mL 10mL 15mL 20mL 3.3 5.0 6.7 2.7 4.0 5.3 3.8 5.7 7.6 0.1 0.15 0.2 0.1 0.15 0.2 0.006 0.009 0.012
30mL 10.0 8.0 11.4 0.3 0.3 0.018
50mL 16.7 13.3 19.0 0.5 0.5 0.03
表9
30 6.0 12.0 11.4 0.3 0.3 0.012
50 10.0 20.0 19.0 0.5 0.5 0.02
15%分离胶不同体积各成分含量详表 含量/mL 试剂名称 5 10 15 20 30 蒸馏水 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 30%Acr-Bis(29:1) 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 1M Tris,pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加 10%SDS 即可配制成非变性 PAGE 胶。
7
附录 SDS-PAGE 分离胶浓度的最佳分离范围 不同样品的检测，需根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，不同分离胶浓度的最
7.1
佳分离范围如表 5 所示。 表5 SDS-PAGE 分离胶浓度 6%胶 8%胶 10%胶 12%胶 15%胶 分离胶浓度与最佳分离范围对照表 最佳分离范围 备注 50-150kD 分子生物学中，kD 表示分子量 的单位道尔顿， 一般写的是 Da， 30-90kD kDa 就是 1000Da。 20-80kD 12-60kD 10-40kD
发酵豆粕各项指标检测方法
发酵豆粕各项指标检测方法发酵豆粕是一种常见的饲料原料，其发酵过程可以提高饲料的消化率和营养价值。
为了确保发酵豆粕质量符合要求，需要进行各项指标的检测。
下面将介绍发酵豆粕各项指标的检测方法。
1.水分水分是判断发酵豆粕是否存在霉变和变质的重要指标。
水分的测定可以通过烘干法和红外干燥法进行。
烘干法是将样品在105℃下加热，然后进行重量测定，计算得到水分含量。
红外干燥法是利用红外辐射对样品进行加热，通过光学传感器测定样品的水分含量。
2.粗蛋白粗蛋白是发酵豆粕中的重要营养成分。
常用的粗蛋白检测方法有凯氏消解法和红外消解法。
凯氏消解法是将样品与酸和碱进行消解，然后利用定量分析方法测定样品中的氮含量，通过乘以样品的氮蛋白转化系数来计算粗蛋白含量。
红外消解法则是通过红外光谱仪测定样品中的氮谱带，然后根据标准曲线计算粗蛋白含量。
3.粗脂肪4.粗纤维粗纤维是发酵豆粕中的非消化性纤维成分。
常用的粗纤维检测方法有酸碱消解法和中性洗涤法。
酸碱消解法是将样品先用酸和碱进行消解，然后进行过滤和洗涤，最后干燥、称重，计算得到粗纤维含量。
中性洗涤法则是将样品浸泡在中性洗涤液中，进行过滤和洗涤，最后干燥、称重，计算得到粗纤维含量。
5.灰分灰分是发酵豆粕中的矿物质成分。
灰分的测定可以通过加热、烘干和称重来进行。
将样品在高温下加热，使有机物燃烧殆尽，然后进行干燥和称重，计算得到灰分含量。
6.外观和色泽外观和色泽是发酵豆粕的质量指标之一，可以通过目测来判断。
良好的发酵豆粕应该具有均匀的颜色和无异物的外观。
综上所述，发酵豆粕各项指标的检测方法主要包括水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰分以及外观和色泽的检测。
这些检测方法能够全面评估发酵豆粕的质量，并确保其适合作为优质饲料原料使用。
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1方法
薄板层析法（TLC）。
2原理
利用不同大小的糖分子在硅胶薄板上的扩散速度的大小不同，将发酵豆粕中的寡糖分开。
3仪器及试剂
3.1硅胶板：10*10cm；
3.2层析缸（可供放置硅胶板）与硅胶板配套；
3.3烘箱；
3.4移液枪(10μl)以及其配套枪头；
3.5高速离心机；
3.6250ml 具塞锥形瓶；
3.7乙醇（分析纯）
3.8正丙醇（分析纯）
3.9乙酸（分析纯）
3.10
α-萘酚（分析纯）3.11正磷酸（分析纯）
4试剂的配制
4.1展开液：正丙醇：乙酸：水＝1:1:0.1(V/V/V)
4.2显色液：α-萘酚
1ml 正磷酸
10ml 乙醇
989ml 共1000ml
5实验方法及步骤检测技术规范与标准方法编号：QB/HHS JC002-2013
修订：第1版
第1次修改发酵豆粕中不良寡糖的定性检测方法起草：赵丽霞审核：刘永垒
批准：
执行日期：2013年06月15日
5.1寡糖标样：用豆粕代替。
5.2样品的预处理
准确称取发酵豆粕样品5.0g于250mL三角瓶中，加入50.0mL80％的乙醇溶液，70℃水浴浸提1h。
取2mL浸提液，10000r/min离心10min，4℃保藏备用。
5.3样品的测定
在预制硅胶板上点样，点样量为5μL，点样干燥后在展开液中展开，展开至离硅胶板前沿2cm处。
自然晾干后，喷淋显色液，在140℃下烘5min显色。
6结果判定
对比硅胶层析板上，样品和标样的条带，直接判读发酵豆粕中寡糖的降解情况。
不同发酵豆粕样品的TLC图谱
6.1样品中寡糖的定性检测结果：
1-4号：++++
5-6号：+++
7号：—
8号：++
6.2定性判定标准如下：
++++：完全没有降解；(图谱斑点与豆粕相同，表现为三个斑点)
+++：基本没有降解；(除了豆粕中的三个斑点外，蔗糖上方还多了一个单糖)
++：降解不完全；(与豆粕相同有三个斑点，但亮度较暗，如8号样品)
+：基本降解；(对应豆粕中的三个样品亮度较暗或很浅)
—：完全降解；(图谱上无斑点，表现为图谱中非常干净)。