雌性生育力维持调节机制研究及生殖资源库建立

项目名称：雌性生育力维持调节机制研究及生殖资源库建立首席科学家：乔杰北京大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部二、预期目标1. 总体目标：建立能够支撑中国生殖生物学研究和生殖医学应用的生殖器官、组织与细胞资源库，为研究生殖细胞的发育成熟调控机制提供珍贵的人类资源标本；通过探索雌性生殖细胞发育和生育力维持的调控机制，优化和改进人类卵子、卵泡、卵巢组织、完整卵巢冷冻保存和复苏技术体系，获得雌性生殖细胞发育的理论突破和维持女性生育力的专利技术，提升参与国际竞争的实力，扩大我国生殖医学在国际上的影响力。

2、五年预期目标:1)建立卵母细胞体外发生模型和不同发育阶段卵母细胞的蛋白质组，确定控制卵子发生和成熟的关键分子；了解卵子发生相关疾病如非整倍体卵子产生的蛋白质和细胞学基础；2)利用卵母细胞冷冻复苏分子机制的研究结果，完善卵母细胞冷冻、解冻复苏技术；明确人未成熟卵母细胞是先体外成熟后冷冻还是先冷冻未成熟卵再行解冻后成熟培养，为临床提供依据；3)争取能够获得中国第一例卵巢组织冷冻来源或完整卵巢冷冻移植来源的健康婴儿，在人卵泡体外成熟方面取得突破性进展；4)建立规范的具有一定规模的生殖资源库，建立完善的标本库管理模式及共享体系；5)在国际主流杂志（IF>3）上发表论文40篇以上，并争取在一流杂志上发表论文，申请专利10项左右；造就一支高水平的科研队伍，培养博士研究生约40名，硕士研究生30-50名，博士后研究人员20名左右。

三、研究方案(一)学术思路不孕不育是严重影响人们生活质量的疾病，其中很大比例为女性生育力的降低，如何维持、保存生育力是生殖医学面临的最大的问题。

而要找出维持生育力的方法，就需要从构成生育力的多个关键环节即卵子、卵泡到卵巢在分子、细胞、组织等多个层次进行系统研究。

综合本团队及国外实验室的最新研究进展基础，我们提出首先系统阐明参与雌性配子发生、发育、成熟的关键分子及调节机制，从而对造成生育力下降的生物学机制得到充分的认识；在此基础上，建立体外模拟雌性配子（包括卵子及卵泡）成熟的模型，研究影响卵子、卵泡、卵巢组织以及完整卵巢的离体冷冻保存的关键因素，从而阐明生育力保存的机制；结合上述基础研究，建立生殖相关器官、组织与细胞资源平台及数据库，面向全国开放，实现资源共享，在为广大患者提供生育力储备同时，有效推动生殖生物学的基础研究。

本项目以雌性生育力维持为核心，雌性配子发育机制作为项目研究基础，建立规范的生殖资源库为项目最终目的。

在项目实施过程中，通过卵／卵泡体外成熟机制的研究，建立完善的体外培养及冷冻移植体系，为研究影响卵子／卵泡／卵巢冷冻保存的因素提供评价体系，为制定资源库操作及管理规范提供理论依据。

而规范的生殖资源库的建立，将反过来为生育力维持的研究与应用提供强大的平台保障，推动基础研究的开展。

（二）可行性分析1.研究队伍1)本项目汇集了6家科研单位和医院的学术带头人，团队包括长江学者特聘教授（1名）、国家杰出青年（2名）、百人计划（1名），跨世纪优秀人才（1名）、学校特聘教授（1名）等。

参加研究人员长期从事生殖生物学领域相关研究，积累了丰富的基础研究和临床实践经验，具有较强的独立研究能力；2)结构合理的优秀科研团队确保研究方案的顺利实施：优秀的中青年学术骨干，具备良好的大型科研课题实施的工作能力，掌握实验涉及的所有先进技术，保证了项目的实施和技术问题的解决。

2. 研究基础1)团队内前期取得了大量研究成果，本项目是对这些原创性研究的进一步深入和转化，保证了项目预期目标和研究方案的可行性；2)团队内长期的广泛合作为项目顺利进行奠定坚实的基础，可使各课题间的密切联系得以实现；3)申请团队一直从事哺乳动卵母细胞减数分裂成熟、受精和早期胚胎发育研究，发现早期胚胎发育所必需的母源调控因子和母源调控蛋白复合物SCMC，论文发表在Developmental Cell、Development等重要学术期刊上；4)首次建立高度特异性的卵泡颗粒细胞基因敲除小鼠模型（Cyp19-Cre），阐明了卵泡颗粒细胞中的PI3K/AKT/PTEN信号通路和RAS/ERK1/2信号通路在卵泡发育和卵母细胞成熟中的重要作用，论文发表在Science、Cell、Development、Cancer Research、Molecular Endocrinology等重要学术期刊上；5)在世界上首次实现完整大鼠卵巢及部分子宫的冷冻保存与移植并成功受孕，研究论文以第一作者发表于Nature杂志上。

3. 临床特色1)申请团队容纳了国内最大几家生殖医学研究中心，每年接诊５０余万例不孕症患者，每年取卵周期在２－３万人次，具有丰富的临床资源；2)团队内大部分申请者除了在所属生殖中心任职以外同时还兼任妇产科的职务，与血液科、外科及其他医院相关科室都建立了良好的合作关系，很多肿瘤科医生已经在给患者制定治疗方案前考虑生育力保存问题；3)目前，很多肿瘤病人到生殖医学中心进行生育力保存问题的咨询，癌症开始治疗前要求卵巢／睾丸组织冷冻的病人越来越多，保证了项目的顺利进行。

目前课题组已经冻存了20例肿瘤病人的卵巢组织，一例完整卵巢冻存。

所冻存的组织除了患者自用外，其中部分行附件全切除的患者因无生育要求，同意捐赠科研；4)因交通事故意外身亡的捐赠者、做变性手术的捐赠者是卵巢／睾丸组织重要来源之一；5)卵巢组织还可以来自于难免流产的胎儿，申请者所在妇产科每年有百余例难免流产的患者；6)正常卵巢储备的患者经常规促排卵并取卵后，获得卵子有约10％未成熟比例，这部分未成熟卵子患者的自身利用价值极小，经患者知情同意并捐献科学研究后，可以进行本实验的相关基础研究；7)在单纯促排卵周期中，小部分患者对促排卵药物出现高反应，发育过多卵泡，为防止卵巢过度刺激综合征的发生，除人工将优势卵泡穿破外，尚需要将其余卵泡也吸出，可能获得部分成熟卵子，经患者知情同意并捐献科学研究后，可以进行本实验的相关基础研究；8)上海交通大学医学院附属仁济医院目前承担上海生殖遗传与肿瘤资源库的建设项目，努力创建上海公共卫生与生殖健康平台，生殖医学机构包括生殖医学科、上海市人类精子库、上海市男科学研究所，已经与上海交通大学低温生物医学研究所联合进行人类配子、睾丸与卵巢组织及器官的前期冻融机制研究，已建立相对完善的冻融平台与计算机管理系统。

该研究平台已经有20余年的历史，对人类配子与生殖组织及器官冻融的样本量已积累了10万多例次的经验。

已建立完善的生殖伦理评估与案例研究体系，对本课题开展研究可提供可靠的技术支持与保障体系。

4. 实验平台项目组包括计划生育生殖生物学国家重点实验室，山东省生殖医学医药卫生重点实验室，浙江省女性生殖健康重点实验室，还包括教育部、卫生部重点学科建设、211重点学科，实验室装备先进，技术力量雄厚，保证了实验需要的所有技术平台，具备课题实施需要的所有大型仪器。

（三）创新点与特色1.阐明生殖科学的重大问题：本项目利用最新的研究模型与技术，以创新性的系统研究思路，从雌性配子有丝分裂向减数分裂转变、减数分裂精确控制、细胞质成熟等关键环节入手，阐明雌性生殖细胞分化、发育和成熟的分子机制。

不仅将解答生殖科学中雌性生殖力的关键科学问题，同时对临床雌性生育力维持也将提供创新型科学与技术保障。

2.以分子水平的冷冻机制研究，取代经验性的思路，解决卵母细胞冻融效率的问题：结合目前国际研究进展、本项目组前期工作，通过水通道蛋白AQP3在卵子冷冻过程中的表达特征、控制水通道蛋白AQP3表达水平，从冷冻保护剂组合、平衡方式及控制水通道蛋白AQP3表达水平等方面入手，探寻人卵母细胞玻璃化冷冻的改良途径，并对其安全性进行研究。

3.多渠道、全方位提供维持雌性生育力的方案：目前常用的几种生育力保存方式各有优缺点及其适应症。

而本项目从细胞水平到组织器官水平，采取了多阶段、多方案的思路，既有成熟卵母细胞又有未成熟卵母细胞、既有卵泡保存又有卵巢组织与完整卵巢的冷冻、移植，既能维持生育力又能恢复内分泌功能，既有基础/动物研究又有临床应用。

采用系统科学方法，着眼于完善的生育力维持体系，提供多种研究与应用方案。

4.高起点的新的实验平台：本项目利用我们独有的一系列转基因动物模型进行卵子发育的调控分子在动物体内的调控机制研究，本课题组建立高度特异性的卵泡颗粒细胞基因敲除小鼠模型（Cyp19-Cre），特异的卵泡颗粒细胞Pten，Erk1/2ERK1/2基因敲除模型等，同时课题组还成功建立了大鼠完整卵巢冷冻移植的模型以及卵母细胞体外发生模型，这些动物模型均为本团队自建或合作构建，为本团队独有，利用这些实验动物模型，将对阐述常规实验无法进行研究的新机制具有重要作用。

5.原创性研究基础上的新层面的进一步研究：本项目研究内容均是在项目组大量的原创的扎实的工作基础上进一步深入，实现以基础理论的深入研究推动临床问题的解决，又以临床难题来激发和导向基础研究。

4个课题均是针对团队前期建立的模型、发现的卵母细胞成熟发育调控分子的作用及其机制的进一步系统研究以及已有的生育力维持方案的延伸，具有很强的原创性，能够创造一系列具有自主知识产权的成果，具有重大的理论和临床应用价值。

6．基础与临床的密切结合和强强联合：本项目是从基础到临床、从临床到基础的互动转化研究，基础研究与临床研究应用密切结合，研究团队集中了国内生殖医学临床与相关基础研究的优势力量。

一方面为临床生育力保存及生殖资源库建立提供科学依据，生殖资源库的建立又会极大地促进基础研究，由此建立一套完整的人类生殖力维持的研究与应用平台。

（四）研究方案本项目申请团队集中了国内生殖医学与相关基础研究的优势力量，将临床与基础研究有机组合，多学科交叉，根据各自原有的工作基础及实际优势，围绕本项目拟解决的关键科学问题和总体目标，设置四个不同研究侧面及相应的研究分支：1）雌性生殖细胞发生、发育和成熟的分子调节机制；2）不同发育阶段卵母细胞冷冻保存与生殖能力维持的分子基础；3）卵巢冷冻保存：低温生物学技术优化与生物功能维持；4）卵泡成熟机制及生殖资源平台和数据库的建立。

课题之间的关系：本项目围绕生育力维持这一主题，以配子发育机制的研究作为基础，卵子发生及卵泡发育过程中的分子调控网络的建立不仅可为女性生育力维持提供基本理论指导和技术支撑，同时可为卵巢和卵子的冷冻方案提供评价指标，为其有效利用以及生殖相关疾病的预防和治疗提供新思维和新靶点。

完善的卵母细胞冷冻和卵巢冷冻与移植技术及卵泡成熟培养系统是建立资源库的前提条件。

通过建立规范的资源库操作流程及管理模式，促进生殖生物的基础研究。

通过基础研究和临床研究的互动，转化或反转化，最终将大大推动生殖生物学的研究进展。