酵母菌絮凝的分型及其生理生化特性的研究

酵 母 菌 絮凝 的分 型 其生 理生 化特性 的研 究
越
摘 要
Ｔ ＆ 钍。ｉ
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铁翠娟 何秀萍 谭华荣
通过 对 ４ １ ０余株 酵母 菌进 行 絮凝 测定 ． 从 中筛选 到 ５株强 絮凝 菌 。依据 不 同糖 对 其
絮凝 水平 的抑 制， 将 ５株强 絮凝 菌分 为 Ｆ ｌ ｏ １型和 Ｎｅ ｗＦ Ｉ ｏ型 对 这两 种 絮凝 型菌 株 的相关 生
收 稿 日期 ： １ ９ ９ ８ ０ ３ ． ０ ２ ， 修 回 日期 ： １ ９ ９ ８ ４ ） ５ ． ２ ７
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生
物
学
报
３ ９卷
磷酸钠缓 冲液（ ｐ Ｈ７ ． ５ ） 。
１ ． ２ 培 养 条 件 和 测 定 方 法
１ ． ２ ． １ 培 养条 件 ： 实验 菌株于 ２ ５ ℃ 活 化 后 接 一 环 于 液 体 ＹＥ Ｐ Ｄ 中， ２ ５ ＂ １ ２， ２ ０ ０ ｒ ／ ａｉ ｒ ｎ培 养
凝 的最 适 Ｃ ａ ２ 浓 度 为 １ ０ ｍｍｏ ［ ／ Ｌ－ －ｌ ｍｏ ［ ／ Ｌ ， 最适 ｐ Ｈ为 ３ ． ０ －４ ５ 。
关 键 词 兰 兰 ． 墅 ， 盐 丑， 生 里 圭 堑 堡． 簟 醇ｌ 啦．
分 类号 Ｑ ０ ３ ９ ． ５ 文献 标识 码 Ａ 文章 编号 ０ ０ ０ １ ． ６ ２ ０ ９ （ １ ９ ９ ９ ） ０ ６ ， ０ ５ ２ ７ ． ３ ２
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＠ 一 ｓ ３ ２ －
３ ９卷 ６ 期 微 生 物 学 报
３ ９ Ｄｅ ｃ ｅ ｍｂ ｅ ｒ Ｎｏ ６ １ ９ ９ ９
１ ９ ９ ９年 １ ２ 月
Ａｃ ｔ ａ Ｍ ｉ ｃ ｍｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ Ｓｉ ｎｉ ｃ ａ
理 生化 特性 进行 了 研究 。结 果表 明， Ｆ ｌ ｏ １型 菌 絮 凝 只 受 甘露 糖 抑 制 ， 它对 高 温 （ ７ ０ ℃） 、 蛋 白 酶 Ｅ、 胰 蛋白 酶敏感 ， 而对 蛋 白酶 Ｋ、 廉 蛋 白酶 、 Ｃ ａ ２ 一、 ｐ Ｈ 有 一 定 耐受 性 。Ｎｅ ｗＦ ｌ ｏ型 菌 絮凝 受 甘 露糖 等 多种糖 抑 制 ， 它对 高 温 （ ７ ０ ℃） 、 各种 蛋 白酶 、 Ｃ ａ ２ 、 ｐ Ｈ均 较 敏感 。这 两 种类 型菌 株絮
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６期
张 博润 等 ： 酵母 菌 絮凝 的分 型及 其 生理 生化 特性 的研 究
标准 Ｆ ｌ ｏ １型 菌 株 的 表 型 一 致 ， 该 特 性 表 明这 ３株 菌属 于 Ｆ Ｉ ｏ １型 。 而 Ｆ Ｌ 一 １ ８ ６ 、 Ｆ Ｌ 一 １ ８ ７的 絮 凝 则 受 以上 ３种糖 不 同 程 度 的 抑 制 ， 与 标 准 Ｎｅ ｗＦ ｜ ｏ型 菌 株 的 表 型 一 致 ， 证 明这 两 株 菌 属 于 Ｎｅ ｗＦ １ ０型 。 据 文 献 报 道 ， Ｆ ｌ ｏ １型 菌 可 能 同 基 固 Ｆ Ｌ Ｏ１ 、 Ｆ Ｌ Ｏ５ 、 Ｆ Ｌ Ｏ８ 、 Ｃ ｙ ｃ ８ 、 Ｔ ｕ ｐ ｌ 有 关 。分 型 结 果 见 表 １ 。
Ｓ ｔ ｒ ａ ｔ ｆ ｏ ｒ ｄ等 人 将 酵 母 菌 絮凝 表 型 分 为 两 型 ： Ｆ ｌ ｏ ｌ型 和 Ｎｅ ｗＦ ｌ ｏ型 ， Ｆ ｌ ｏ ｌ型 菌 絮 凝 只 受 甘露糖抑制 ， 而 Ｎｅ ｗＦ ｌ ｏ型 菌 絮 凝 受 甘 露 糖 等 多 种 糖 抑 制 。 本 文 检 测 了 ｉ ｍｏ ｌ ／ Ｌ 不 同 搪 （ 甘 露搪 、 麦芽搪 、 葡萄糖 ） 对 ５株 强 絮 凝 菌 的 絮凝 水 平 抑 制 情 况 ， 并 以 标 准 絮 凝 菌 株 作 对 照。结果表 明 Ｆ Ｌ 一 １ ８ ９ 、 Ｆ Ｌ－ １ ９ ０ 、 Ｆ Ｌ 一 １ ９ １的 絮凝 仅 受 甘 露 糖 抑 制 ， 而 不受其 它糖 的影 响， 与
１ 材 料 和 方 法
Ｉ ， Ｉ 材 料 Ｉ ． Ｉ ． Ｉ 菌株 ： 从 本 组 保 藏 的 酵 母 菌 中挑 选 出 不 同 种 属 的 ４ １ ０余 株 菌 作 为筛 选 强 絮 凝 菌 的 出发 菌 株 ， 编 号为 Ｆ ＬＩ ～Ｆ Ｌ 一 ４ １ ０ 。 标准 Ｆ ｌ ｏ Ｉ型 絮 凝 菌 株 Ａ Ｂ ＸＬ － １ Ｄ（ ＭＡＴ ａ ， Ｆ Ｌ Ｏ１ ） ，
Ｂ Ｘ ２ ４ — ２ Ｂ（ ＭＡＴ ， Ｆ Ｌ Ｏ１ ） ， Ａ Ｂ ＸＲ － １ １ Ａ（ ＭＡＴｃ ￣ ， Ｆ Ｌ Ｏ５ ） ， Ｓ ＴＸ ３ ４ ７ — ２ Ｃ（ ＭＡＴ ， Ｆ Ｌ Ｏ５ ） 由 美 国
的 Ｒｅ ｂ ｅ ｃ ｃ ａ Ｃ ｏ ｎ ｔ ｏ ｐ ｏ ｕ ｌ ｏ ｕ教 授 赠 送 。 标 准 Ｎｅ ｗＦ ｌ ｏ型 絮 凝 菌 株 ＮＣ ＹＣｌ ｌ ９ ０ ， ＮＣ ＹＣ ｌ １ ９ ５ 由 英国的 Ｊ ． Ｒ． Ｊ ｏ ｈ ｎ ｓ ｔ ｏ ｎ教 授 赠 送 。 １ ． １ ． ２ 培养基 ： Ｙ ＥＰ Ｄ培养基 ， ＹＮＢ培 养基 ， 麦 芽 汁 培 养 基 ・ 。 １ ． １ ． ３ 酶、 试剂及溶液 ： 各 种 蛋 白酶 均 为 国 产 。 所 用 化 学 试 剂 为 分 析 纯 。 絮 凝 缓 冲 液 为 ０ ． １ ｍｏ ｌ ／ Ｌ柠 檬 酸 钠 缓 冲 液 （ ｐ Ｈ４ ． ０ ， 含 １ ０ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ Ｃ ａ ａ２ ） ） 。 蛋 白酶 的 缓 冲 液 为 ０ ． １ ｍｏ ｌ ／ Ｌ
各 种 蛋 白酶 的 ０． １ ｍｏ ｌ ／ Ｌ磷 酸 钠 缓 冲 液 （ ｐ ｈ ７． ５ ） 中， ３ ０ ℃保 温， 在不同 时间取 样， 测 定 絮 凝
水 平 。 蛋 白酶 浓 度 分 别 为 ： 蛋 白酶 Ｅ ０． １ ｍｇ ／ ｍＬ ， 蛋 白酶 Ｋ ｌ ｍｇ ／ ｍＬ ， 胰 蛋 白酶 ｌ ｍｇ ／ ｍＬ， 糜 蛋 白酶 ０ ． ５ ｍｇ ／ ｍＬ 。
表 １ 絮 凝菌 株的 分型
Ｔａ ｂｌ ｅ １ Ｄｉ ｓ ｔ ｉ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｙ ｅ ａ ｓ ｔ ｌ ｆ ￣ｃ ｕ ｌ ｅ ｎ ｔ ｐ ｈ ｅ ｔ ｔ ｏ ｔ ｙ ｐ ￣
注： “一” 不絮凝 ； “＋” 弱絮 凝 ； “＋ ＋“ 中度 絮凝 ； “＋ ＋ ＋” 强 絮凝
定絮凝水平。
２ 结 果 和 分 析
２ ． １ 强 絮凝 菌 株 的 筛 选 通 过 目测 法 从 酵 母 菌 Ｆ Ｌ １ ～Ｆ Ｌ ４ １ ０中 筛选 到 ５株 强 絮 凝 菌 株 ， 即 Ｆ Ｌ 一 １ ８ ６ 、 Ｆ Ｌ 一 １ ８ ７ 、
Ｆ Ｌ 一 １ ８ ９ 、 Ｆ Ｌ 一 １ ９ ０ 、 Ｆ Ｌ 一 １ ９ １ ， 均 为啤酒酵母 （ Ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ｏ ｍｙ ｃ ｅ ｓ ｃ ｅ ｒ ｅ ｖ ｉ ｓ ｉ ａ ｅ ） 。 用这 ５株 菌进 行 后 续 实验 。 ２ ． ２ 絮 凝 菌 株 的 分 型
１ ． ３ ． ６ 培养基对 絮凝水平的影响 ： 将 酵 母 菌 分 别 接 种 于 ＹＥ Ｐ Ｄ培养基 、 Ｙ ＮＢ培 养 基 、 麦 芽汁培养基 中， ２ ５ ＂ １ ２， ２ ０ ０ ｒ ／ ａｉ ｒ ｎ培 养 ４ ８ ｈ ， 测定 絮 凝 水平 。 １ ． ３ ． ７ 培养时间对絮凝水平 的影 响 ： 将 酵 母 菌 接 种 于 ＹＥ Ｐ Ｄ培 养 基 后 ， 每隔 ８ ｈ取 样 测
时， 在 ６ ０ ℃处理 ５ ｍｉ ｎ以 杀 死 细 胞 （ 该 处理不影响细胞 的絮凝） ， 然后 测 定 絮 凝 水 平 。
１ ． ３ ． ２ Ｃ ａ ２ 浓 度对 絮 凝 水 平 的影 响”Ｊ ： 改变 絮 凝 缓 冲 液 中 ｃａ 的浓度 ， 测定絮凝水平 。 １ ． ３ ． ３ ｐ Ｈ值对絮凝水平 的影响 ： 改变 絮凝缓冲液的 ｐ Ｈ值 ， 测定絮凝水平 。
酵 母 菌 絮 凝通 常 指 酵 母 菌 在 生 长期 间 发 生 的细 胞 间 的 无 性 凝 集 。 在 发 酵 工 业 中 ， 酵 母 菌 细 胞 的 絮 凝 能 力 是 评 价 菌 种 优 劣 的 一 个 重 要 指 标 。 若 细 胞 絮 凝性 强 ， 在发 酵 后 期 ， 分 散 于发 酵 液 中 的 细 胞 相 互 聚 集 形 成 絮 凝 颗 粒 并 沉 降， 从而 有利 于细 胞同发 酵液 的有效分 离， 可 大 大 简化 后 处 理 工 艺 ， 降低成本。然而 絮凝是 一个 极复杂 的现象 ， 不 仅 受遗 传 因 子 的控 制 ， 而 且受 环 境 、 生理 等 多 方 面 的 影 响 。 目前 ， 对 酵 母 菌 絮凝 机 理 还 不 太 清 楚 ． 主要 有 两 种 假说 Ｊ ： 一 种 假 说 认 为酵 母 菌 细 胞 絮 凝 是 由细 胞 壁 上 类 外 源 凝 集 素 的 糖 蛋 白 和 甘 露 聚糖相互作用形成 ； 而 另一 种 假 说 认 为 酵 母 菌 细 胞 絮 凝 是 细 胞 壁 上 蛋 白和 甘 露 聚 糖 间 以 钙 离 子 桥 连 接 而 成 。近 年 来 ， 国 外 有 关学 者 对 酵 母 菌 絮 凝 机 理 及 其 分 子 遗 传 学 进 行 了 较 广 泛 的研 究 Ｊ ， 而 国 内 未 觅类 似 报 道 。本 文 报 道 了 强 絮 凝 酵 母 菌 的 筛 选 、 分 型 及 其 生 － 理 生 化 特 性 的研 究 结 果 。
１ ． ３ ． ４ 高温 对絮凝水平的影响 ： 将用 Ｅ ＤＴ Ａ 及 蒸 馏 水 洗 过 的 酵 母 细 胞 重 新 悬 于 絮 凝 缓
冲液中， ７ ０ ℃保温 ， 在 不 同 时 间取 样 ， 测定 絮凝水平。
１ ． ３ ． ５ 蛋 白酶 对 絮 凝 水 平 的 影 响 ： 将 用 ＥＤ ＴＡ 及 蒸 馏 水 洗 过 的 酵 母 细 胞 重 新 悬 于 加 有
４８ｈ。
１ ． ２ ． ２ 絮 凝水 平 测 定 ： 按 文献 ［ ６ ］ 的方 法 略 有 改 进 。 目测 法 ： 将待 测菌接 种 于装 有 ３ ｍＬ ＹＥＰ Ｄ液 体 培 养 基 的 试 管 中 ， ２ ８ ℃静 置培 养 ４ ８ ｈ后 ， 剧 烈振 荡 ｌ ｍｉ ｎ ， 室 温静置 ， 观 察 絮 凝 形 成速 度 及 絮凝 物 大 小 ， 确定 菌株 的 絮凝 水平。分 光光 度法 ： 取４ ８ ｈ培 养 物 离 心 收 集 菌 体， 用２ ５ ０ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ Ｅ Ｄ ＴＡ 溶 液 及 无 菌 水 各 洗 两 次 ， 离 心 收集菌 体并 悬 于絮凝 缓 冲液 中 ， 立刻在 ６ ０ Ｏ ｎ ｏ 处 测 ０１ ｔ ）值 ； 然 后 细 胞 悬 液 移 至 三 角 瓶 中， ２ ５ ℃， １ ２ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ振 荡 ２ ｈ至 絮 凝 完成， 室温静置 ３ ０ ｍｉ ｎ ， 取上清在 ６ ０ ０ ｎ ｍ 处 测 ＯＤ 值 。 以振 荡 处 理 后 测 定 的 ０ １ ）值 除 以 振 荡 处理 前 测 定 的 ＯＤ 值 ， 再乘以 １ ０ ０ ％（ 即 自 由细 胞浓 度 ） 表示絮凝水平。 １ ． ３ 不 同因 素 对 菌 株 絮凝 水 平 的 影 响 １ ． ３． １ 不 同糖 对 絮凝 水 平 的 影 响 ＿ ６ ： 将 不 同浓 度 的 各 种 糖 溶 于 絮 凝 缓 冲 液 中 ， 测 定 絮 凝 水平 ， 为 避 免 代 谢 旺盛 的 酵 母 细 胞 消 耗 糖 而 降 低 其 浓 度 ， 可于 ２ ５ ０ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ Ｅ ＤＴＡ 洗 细 胞