热纤梭菌内切β-1,4-葡聚糖酶基因celD在大肠杆菌中的表达及酶学特性分析

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2006,14(6):1000~1001
作者简介:常巧玲(1980~)，女，硕士研究生。

E-mail:<cql-zqh@>.
*通讯作者。

Author for correspondence.教授，主要研究方向：基因工程酶制剂。

E-mail:<jysun@>.收稿日期：2005-08-27接受日期：2005-11-10·研究简报·
热纤梭菌内切β-1，4-葡聚糖酶基因
在大肠杆菌中的表达及酶学特性分析
常巧玲,孙建义*,许英蕾,钱利纯
(浙江大学饲料科学研究所动物分子营养学教育部重点实验室,杭州310029)
关键词：纤维素酶;基因表达;酶学特性
中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:1006-1304(2006)06-1000-02
Expression of A Thermostable Endoglucanase Gene from in
and Characterization of Its Recombinant Enzyme
CHANG Qiao-ling,SUN Jian-yi*,XU Ying-lei,QIAN
Li-chun
gene expression;enzymic properties
热纤梭菌是一种嗜热的厌氧细菌，能产生一种叫纤维素小体的多酶复合物(Bhat,1997),是实现纤维素工业转化的一个较有希望的菌种(于洪日等,1989)。

同时热纤梭菌能够产生耐热的纤维素酶，通常在酸性和碱性的pH以及90℃以上的高温下仍能稳定存在，并且可以在广泛的底物上发酵而不易被其它的病原体污染，近些年来引起了极大的关注。

但热纤梭菌又是一种严格的厌氧菌，其纤维素酶的分泌必须在高度厌氧的条件下进行(Lamed and Bayer,1988)，给实验的测定和工业的生产都带来很大的不便，而且热纤梭菌纤维素酶的产量很低，难以工业化生产。

本实验是改造热纤梭菌内切β-1,4-葡聚糖酶的基因，使其与表达载体pET-30a(+)相连，在大肠杆菌原核表达系统中高效表达，构建出高酶活、耐热和低产酶条件的纤维素酶基因工程菌。

并对该酶的最适反应温度、最适反应pH、热稳定性、pH稳定性等生物学特性进行分析，为工业化生产提供基础资料。

1材料与方法
1.1菌种和质粒
热纤梭菌(),大肠杆菌()TOP10、BL21和表达载体pET-30a(+)由本实验室保存,pGEM-T Easy Vector购自Promega公司。

1.2试剂
凝胶回收试剂盒(QLAqueick DNA gel extraction kit)为QLAGEN公司产品;PCR试剂、质粒提取试剂盒(Wizard Kit)均为Promega公司产品；SephadexG-25、SephadexG-100、EAE-SephadexA-50和标准蛋白(codeRPN756)购自Amersham Pharmacia Bioteach公司。

1.3基因的PCR扩增
根据Joliff(1986)报道的内切β-1,4-葡聚糖酶基因序列，设计并合成特异性引物，2条引物分别命名为5TCE和3TCE,TAA为终止密码子。

5TCE:5'-AGGGAATTCATGAGTAGAATGACCTTGA-3';
RⅠ
3TCE:5'-TGCGGCCGCTTATATTGGTAATTTCTCG-3'。

Ⅰ
以基因组DNA为模板用引物5TCE和3TCE进行PCR 扩增,PCR反应体系(50μL)为:10×buffer5μL；MgCl2(25 mmol/L)3μL；dNTP(10mmol/L)1μL;引物各1μL；模板1μL；DNA聚合酶(10000U/mL)0.5μL;无酶H2O37.5μL。

PCR程序:94℃2min;94℃50s,55℃50s,72℃2
min,35个循环;72℃10min。

1.4基因克隆与序列分析
将PCR产物回收后用T4DNA连接酶连接到pGEM-T Easy Vector上，转化TOP10。

在含有100mg/L ampi-cilin的麦康凯琼脂平板上培养后挑选白色菌落，得到含有基因的阳性克隆，进行酶切鉴定和序列分析。

第6期常巧玲等:热纤梭菌内切β-1，4-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学特性分析
1.5DNA序列分析
由上海博亚生物技术有限公司进行测序，在NCBI上分析序列同源性。

1.6阳性克隆质粒和表达载体酶切
阳性克隆菌提质粒纯化后经RⅠ和Ⅰ双酶切，回收小片断，连接到经同样双酶切的表达载体pET-30α(+) Vector上，转化BL21,在含有100mg/L Kanamycin的LB平板上培养后，随机挑选菌落，提取质粒进行验证，将验证正确的重组质粒命名为pET-TCE。

1.7阳性菌诱导表达
将重组BL21(pET-TCE)接种于含100mg/L kanamycin的LB培养液，37℃150r/min培养过夜，至对数生长期加IPTG(5mmol/L)诱导表达，再培养4～8h。

1.8表达产物SDS-PAGE电泳
参照文献(Sambrook and Maniatis,1996)进行。

1.9酶的生物学特性研究
诱导后收集的菌体冰浴中进行超声波破碎，用DNS法测定葡萄糖的含量。

酶活力单位定义：在一定的条件下，每分钟分解底物产生相当于1μmol葡萄糖的酶量为1个酶活力单位（U）。

粗酶液酶活性为22U/mL。

2结果和分析
2.1内切β-1,4-葡聚糖酶基因的PCR扩增
通过PCR方法，从热纤梭菌总DNA中扩增出基因片段，连接到pGEM-T Easy Vector上，转化TOP10。

测序结果表明扩增出的基因序列2058bp包括完整的ORF1947bp,与报道的序列同源性100％（基因序列号为X04584）。

2.2表达产物SDS-PAGE电泳
阳性基因工程菌pET-TCE诱导培养后，重组菌经超声破碎，进行SDS-PAGE电泳，与含空载体的BL21菌相比，pET-TCE在77kD左右有表达的蛋白条带(图1)。

2.3酶的生物学特性
在不同温度条件下分析重组酶活力变化，发现该酶的最适温度为60℃,最适pH范围为pH6～7。

重组酶在70℃以下处理2min残余酶活可高达80％。

将重组酶在不同pH值的缓冲液中37℃保温1h，检测剩余酶活力，发现该酶在pH
4～7范围内，酶的活性损失比较小，其相对酶活都在50％以上。

图1.在BL21中表达的SDS-PAGE分析Fig.1.SDS-PAGE analysis of expression in BL21
M,标准分子量蛋白marker；1,3，表达的BL21；2，BL21对照。

M,protein molecular markers;l and3,recombinant endoglucanase protein;
2,control.
3讨论
本实验将来源于热纤梭菌的内切β-1，4-葡聚糖酶基因在BL21中成功表达，实验结果表明，该基因工程菌的培养液里没有酶活，而经细胞破碎后的培养液里有很高的酶活，所以该酶为胞内酶。

酶学特性分析表明，此酶的耐热性比较强，在70℃以下处理2min，残余酶活高达80％，从饲料加工方面考虑，在饲料制粒时要经过90s的高温（75℃）处理（这也是本实验要选用2min做耐热处理的原因），在这种情况下，该酶活性虽有所降低，但仍能保持67％的相对酶活;该酶在pH小于4的条件下稳定性较差，pH3处理1h，酶的活性基本丧失,表明该酶还没有到达小肠，就被胃酸所破坏。

为解决这一问题，可以在该酶的饲料添加剂表面增加一层保护膜，或通过基因工程技术来改变其耐酸性能，后者的工作相对要困难许多，需要进行大量实验长期摸索。

本实验只对热纤梭菌内切β-1，4-葡聚糖酶酶学特性做了初步的研究，该酶的其它生物学特性需要进行进一步的研究和鉴定。

同时今后的研究还应从纤维素酶基因的结构与功能间的关系来入手，通过基因克隆和重组技术来进一步改善纤维素酶的水解性能，以期获得更适应于工业化生产
的纤维素酶基因工程菌。

参考文献
Bhat S，.Determination of immunological homology between cellulosome subunits and cloned endoglucanases and xylanase of clostridium thermocellum(J).,1997,3:347~352
Lamed R and Bayer E A.The cellulosome of
(J).,1988,33:1~46
Joliff G，Beguin P and Aubert J P.Nucleotide sequence of the cellulase
gene encoding endoglucanase D of
(J),1986，14:8605~8613
Sambrook J and Maniatis E F T.Molecular Cloning(version2)(M).
Beijing:Science Press,1996.(in Chinese)
Yu H R(于洪日),Gao P J(高培基)and Wang Z N(王祖农).Isolation of
and pilot study on its cellulose hydrolyzing activity(J).(山东大学学报),1989,24(2):86~92(in Chinese)
1001。