第二章 试管苗快速繁殖.
第二节 植物的克隆
（2）基因工程 （3）植物体细胞杂交
3.操作过程：
（1）原生质体培养—基因工程导入外源基因—转基因细胞的培养
2、器官培养
指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离 体无菌培养。
如：雌性花器官的培养成果显著（子房的培养、胚囊的培养、 花药的离体培养等）
3、原生质体培养
如何剥 离细胞 壁呢？
[原生质体概念]
用纤维 素酶和 果胶酶
3、原生质体培养
为什么要加较 高渗透压的甘 露醇呢?
愈伤 组织 胚状体
植物 细胞
细胞产物的工厂化生产
种类:蛋白质,脂肪,糖类,药物,香料,生物碱等.
2、作物新品种的培育
1.单倍体育种
(1)方法:花药的离体培养
(2)优点: 后代稳定遗传,都是纯合体; 明显缩短育种年限. 2.突变体的利用
(1)产生:植物组织培养
(2)利用:筛选对人们有利突变体,进而培育新品种
植物繁殖的新途径
3、在个体水平上 ——动物克隆、植物克隆
不通过两性细胞的结合，从一个单一的细胞繁殖 出生物个体。即细胞 个体
植物克隆
二、技术基础---植物组织培养
（1）植物组织培养的一般程序
1.配制含有适当营养物质和植物生长调节剂 的含0.7%-1%琼脂的培养基，倒在灭菌试管 中凝固成半固体 2.从消毒的根、茎、叶上切取一些小组织块 3.将组织块放在固体培养基上进行培养，获 得愈伤组织（创伤组织） 4.以适当配比的营养物质和生长调节剂诱导 愈伤组织，直到再生出新植株
外源遗传物质（DNA）
多途径的植物克隆实践
1、细胞产物的工厂化生产 2、作物新品种的培育
1）单倍体育种 2）突变体的利用
第二章 植物离体繁殖
一、 植物快繁的器官形成方式
由于植物种类不同，器官再生及快速繁殖的方式也不同。 1、短枝发生型：外植体为带叶单芽茎段，培养 为完整植株。 特点：一次成苗，培养过程简单，容易移栽成 活，遗传性状稳定。 例如：葡萄、红薯等试管苗繁殖。
2、器官型（Organ type）：外植体带有顶芽或 腋芽。培养后形成丛生芽，转入生根培养基， 诱导生根成苗，扩大繁殖。 特点：由单芽到丛芽，繁殖速度快，遗传性状 稳定，多数花卉、苗木的快繁属于此类。
选取遗传性状优良、稳定，生长健壮、无病虫害植株上的外植体， 经适当有效灭菌处理后，接种在培养基上，诱导其产生芽（腑 芽或不定芽）和愈伤组织。
注意:培养基激素配比，取材的年龄、大小和生理状态。
初代培养的启动生长方式:腋芽被刺激后生长;茎段、叶片、其它器 官伤口处产生不定芽；外植体切口产生愈伤组织。此阶段一般 需要4-6周。 ↗愈伤组织
控制：减少培养基中容易诱导变异的物质、定期清除不正常
三、玻璃化：
玻璃化苗： 是由于试管苗发生生理失调，而形成的发育不正常的组培苗。 常常表现为叶片皱缩、易碎、嫩叶呈水浸透明状。移栽后常 死亡。
原因： 防止措施: ① 培养基中琼脂与蔗 ① 加入琼脂提高培养基硬度； 糖的浓度低； ② 提高蔗糖含量，降低培养基的渗透 ② 细胞分裂素与生长 压； 素比例失调； ③ 减少含氮成分； ③ 培养基中含氮量高； ④ 降低温度或变温处理、提高光照。 ④ 培养温度高； ⑤ 添加抗玻璃化的化学物质：活性炭、 ⑤ 光照不足。 聚乙烯醇、多效唑、青霉素等。
第2章 自测题及答案
第2章自测题一、单项选择题1．在植物组织培养中，培养基的pH一般为（）。
A．低于5.0 B． 5.6～6.5 C．6.0～7.0 D．7.0以上2．病毒在植物体中的分布规律为（）。
A．从茎尖到底部含量越来越多 B．从茎尖到底部含量越来越少C．病毒在植株体的分布是均匀的 D．茎尖含量最多，底部几乎没有3．下列有关细胞全能性的含义，正确的是（）。
A．每个生物体内的所有细胞都具有相同的功能B．生物体内的任何一个细胞可以完成该个体的全部功能C．生物体的每一个活细胞都具有发育成完整个体的潜能D．生物体的每个细胞都经过产生、分裂、分化、生长、衰老、死亡的全过程。
4．经高温灭菌后，培养基的pH会（）。
A．降低 B．升高 C．不变 D．不能确定5．生长素与细胞分裂素在植物组织培养中的作用是（）。
A．生长素促进芽的生长，细胞分裂素促进根的生长B．生长素促进根的生长，细胞分裂素促进芽的生长C．生长素与细胞分裂素均促进根的生长D．生长素与细胞分裂素均促进芽的生长6．培养基的灭菌方法是（）。
A．干热灭菌 B．湿热灭菌 C．50%酒精灭菌 D．紫外灯灭菌7．热处理脱毒的原理是（）。
A．杀死病毒 B．钝化病毒 C．产生抗体 D．病毒抑制8．接种用具可用（）法灭菌。
A．灼烧灭菌 B．化学灭菌 C．过滤灭菌 D．照射灭菌9．下列不属于细胞分裂素类的植物激素是（）。
A．BA B．NAA C．ZT D．KT10．高温易被破坏分解的植物激素是（）。
A．IBA B．GA C．NAA D．BA11．组培中，进行微茎尖剥离的设备是（）。
A．放大镜 B．显微镜 C．解剖镜 D．无需设备12．植物组培时，培养温度一般控制在（）。
A．23～27℃ B．25+2℃ C．<30℃ D．>15℃二、多项选择题1．下列不属于生长素类的植物激素是______。
A．KT B．IAA C．NAA D．BA2．植物组织培养按照培养对象可分为_________等类型。
高中生物选修3浙科版知识点总结
1 第一章 基因工程一、工具酶的发现和基因工程的诞生1、基因工程的概念：（1）广义的遗传工程：泛指把一种生物的遗传物质（细胞核、染色体脱氧核糖核酸等）移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。
移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。
（2）基因工程：就是把一种生物的基因转入另一种生物体中，使其产生我们需要的基因产物，或者让它获得新的遗传性状。
基因工程的核心是构建重组DNA 分子。
由于基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA 重组技术。
重组技术。
（3）基因工程诞生的理论基础：DNA 是遗传物质的发现过程、DNA 双螺旋结构的确立、遗传信息传递方式的认定。
双螺旋结构的确立、遗传信息传递方式的认定。
2、基因工程的基本工具（1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） ① 来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
主要是从原核生物中分离纯化出来的。
② 功能：能够识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并能切割（使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开），因此具有专一性。
例如：某种限制性核酸内切酶能识别的序列是GAATTC,GAATTC,能在能在G 和A 之间切割DNA DNA，如，如下图所示。
下图所示。
黏性末端黏性末端③ 结果：能将DNA 分子切割成许多不同的片段。
分子切割成许多不同的片段。
备注：不同DNA 分子用同一种限制性核酸内切酶切割形成的黏性末端都相同；同一个分子用同一种限制性核酸内切酶切割形成的黏性末端都相同；同一个 DNA 分子用不同限制性核酸内切酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
分子用不同限制性核酸内切酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
（2）“分子缝合针”——DNA 连接酶 ① 作用：将具有末端碱基互补的2个DNA 片段连接在一起（缝合磷酸二酯键）形成的D NA 分子称为重组DNA 分子。
植物组织培养重点
植物组织培养绪论1.组培根据材料个分为哪几个类型根据外植体来源和培养对象的不同，植物组织培养的研究类型可以分组织培养（tissue culture）、器官培养（organ culture）、胚胎培养（embryo culture）、细胞培养（cell culture）、原生质体培养（protoplast culture）2.组培发展的3个阶段①植物组织培养的早期实践细胞学说，1838-1839年，该学说的基本内容是：一切生物都是由细胞构成的，细胞是生物体的基本功能单位，细胞只能由细胞分裂而来。
1902年，德国植物学家Haberlandt提出了植物细胞全能性学说。
植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞而不影响细胞增殖的观点。
并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力。
②植物组织培养的奠基1934年美国的White，利用番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，发现B族维生素对培养的离体根生长具有重要作用。
创立了White培养基。
1943年美国的White发表了《植物组织培养手册》的专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。
1948 年，Skoog和崔徵通过对烟草茎切段和髓培养组织的研究，确定了腺嘌呤／生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。
1956年Miller等发现了激动素。
控制器官分化的激素模式变为激动素／生长素的比例关系。
促进组培发展。
在这一阶段植物组织培养建立了2个与培养技术有关的重要模式：培养基模式、激素调控模式。
③植物组织培养的建立Reinert和Steward（1958）对胡萝卜悬浮培养细胞和愈伤组织形成体细胞胚作了报道，用实验科学地论证了植物细胞全能性，标志着植物生物技术快速发展的开始。
1960年，Cocking 等用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。
这是植物组织培养的第二次突破。
1960年G.Morel采用兰花的茎尖培养，实现了去病毒和快速繁殖两个目的。
这是经过茎尖—原球茎—小植株的方式而再生的。
提高繁殖速度的方法
提高繁殖速度的方法1、 试管繁殖速率及计算统计试管苗增殖速度，有以苗为单位，也有以芽或未生根的小茎作单位的，以原球茎球状体或胚状体因难以统计，则以瓶为单位。
大多数以芽和苗作单位。
由于试管苗在无菌条件下生长，营养充足，温度适宜，光照充分，100%的相对湿度，又不受季节、气候的限制，也无病虫的危害，故增殖极快，那么，怎样计算其增殖速度呢？计算增殖速率有理论计算和实际计算两种。
实践中要受到多种因素制约，困难很多，因此实际产苗要远远低于理论数字。
但理论计算可以作为一个计算产量的指标，提供参考，有它的积极意义。
试管苗理论上一年能繁殖多少，可用下面的简单公式计算：Y=mXnY= 年繁殖数m=无菌母株苗数X=每个培养周期增殖的倍数n=全年可增殖的周期次数例如月季每5周转接一次，甲品种每次增殖3倍，乙品种每次增殖5倍，丙品种每次增殖7倍，假定一开始都是一个芽，那么这三个品种一年能繁殖多少呢？根据公式可知：n= =10.4，即每年可转接10次，那么这三个品种年繁殖率分别计算如下：甲品种Y=1×310=59000=5.9×104乙品种Y=1×510=9760000=9.76×106丙品种Y=1×710=282000000=2.82×1082、 提高繁殖速度的方法不仅试管苗的繁殖类型不同，而且在试管内又受到基因型、外植体来源、年龄、部位、培养基种类、附加成分和培养环境等多种因素的影响，应通过具体试验来摸索每种植物最快最好的繁殖方法。
1.改进培养基长期以来，根据培养的组织不同，目的不同，已设计了许多种培养基。
初代培养能否进行增殖，培养基的选择是一个关键。
MS培养基可以适用于许多植物的培养，但在大量组织器官培养中发现，由于其无机盐浓度较高，对某些植物来说出现了抑制生长甚至毒害作用，例如，扑虫堇（pinguicula moranensis）的叶，接种到1/2LS培养基中死亡率很高（LS和MS的无机盐一样），在1/5LS培养基中效果很好，而越橘的嫩茎在1/4MS培养基中生长良好，作为热带气生兰的许多种类均需要较低的盐浓度。
第二章-试管苗快速繁殖课件
2.2.3.3 培养
培养基：MS、B5、White 、N6；蔗糖3%；
2.4－D利于愈伤组织形成，NAA抑制芽形 成，利于根发生，KT、6BA利于芽形成。
培养条件：25－28℃，10－14h光照，
1500-3000lx （不定芽分化和生长再强 些）。
（1）适当控制培养基中无机盐成分。 （2）适当提高蔗糖和琼脂浓度。 （3）适当降低CTK和GA的浓度。 （4）增加自然光照，控制光照时间； （5）适宜的培养温度。 （6）改善培养器皿的气体交换状况 。 （6）培养基中添加其它物质 。
2.7 植物无糖培养
植物无糖培养快繁技术又称为光自养微繁 殖技术，是指在植物组织培养中改变碳源的种 类，以CO2代替糖作为植物体的碳源，通过输 入CO2气体作为碳源，并控制影响试管苗生长 发育的环境因子，促进植株光合作用，使试管 苗由兼养型转变为自养型，进而生产优质种苗 的一种新的植物微繁殖技术。
②茎尖流水冲洗2-4h ③75%酒精迅速漂洗30s ④0.1%升汞或稀释20倍的次氯酸钠液消毒 5-8min(取自老枝条上的可适当延长时间）
2.2.2.3 接种
接前可再剥去一些 叶片。然后随切随 接，动作迅速。亦 可将切下茎尖材料 在1-5% VC液中浸一 下。
2.2.2.4 培养
培养基
①基本培养基：MS、White、B5、Heller。
2.2.4.4 植株再生途径
直接产生不定芽 形成愈伤组织 形成胚状体 其他途径
2.3 壮苗和生根培养
2.3.1 试管苗的壮利于形成壮苗.
在生产实际中，增殖系数控制在 3.0-5.0时 可实现增殖和壮苗的双重目的。另外，改善 培养室环境条件，如增加光照强度、降低湿 度等对培养壮苗也有一定帮助。
组培实验六 试管苗的增殖和生根培养
实验六试管苗的增殖和生根培养一．实验目的1、掌握生根培养阶段培养基类型的选择及配制方法2、掌握试管苗生根培养的转接技术3、掌握试管苗生根培养的环境条件控制4、了解不同植物不同繁殖体的增殖扩繁方式5、掌握不同增殖扩繁方式试管苗的转接技术6、要求试管苗和试管苗繁殖体的切割分离方法正确，操作规范熟练。
二．实验原理试管繁殖往往诱导产生大量的丛生芽或丛生茎、原球茎，再转入生根培养基中生根或直接栽入基质中，进一步长大成苗。
试管苗的繁殖（一）试管苗快速繁殖的类型1.无菌短枝型：将待繁殖的材料剪成带一叶的单芽茎段，转入成苗培养基，一定时间后可成苗，再剪成带一叶的单芽茎段，继代又可成苗。
2.丛生芽增殖型：从芽到芽。
3.器官发生型：分为直接和间接两种形式，直接的器官发生是指较少发生或不发生愈伤组织而直接从外植体表面再生不定芽。
4.胚状体发生型从植物叶片、子房、花药、未成熟胚等诱导体细胞发生。
其发生和成苗过程类似合子胚或种子。
这种胚状体具有数量多、结构完整、易成苗和繁殖速度快的特点，是植物离体无性繁殖最快的方法，是人工种子和细胞工程的前提，受到国内外的普遍重视。
（二）.试管苗的生根培养：是使无根苗生根形成完整植株的过程，这个过程的目的就是使试管苗生出浓密而粗壮的不定根，以提高试管苗对外界环境的适应力及驯化移栽的成活率，获得更多高质量的商品苗。
试管苗的生根一般需转入生根培养基中或直接栽入基质中促进其生根，并进一步长大成苗。
试管苗的生根可分为试管内生根和试管外生根两种方式。
1、试管内生根植物离体培养中根的发生都来自不定根，根原基的形成与生长素有关，但根原基的伸长和生长可以在没有外源生长素的条件下实现2、试管外生根为了提高试管苗的生根和移栽成活率，针对有些植物种类在试管中难以生根或根系发育不良，吸收功能极弱，移栽后不易成活的特点，同时为了缩短育苗周期，降低生产成本，国内外许多学者，就现有的生根和驯化程序进行了改进，从而产生了试管苗瓶外生根技术。
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度等对培养壮苗也有一定帮助。
2.3.2 试管苗的生根培养
生根培养基：1／2或1／4MS基本培养
基；不加或少加CTK，适量添加NAA； 糖浓度1-1.5%。
培养条件：增加光强，达3000-
10000lx。
2.3.2.1 生根方法与途径
将新梢基部浸入50 ppm或100 ppm IBA溶液中处 理 4-8h； 在含有生长素的培养基中培养 4-6d 直接移入含有生长素的生根培养基中。 容易生根的植物，延长在增殖培养基中的培养 时间即可生根； 适当降低增殖倍率，减少细胞分裂素的用量， 即可增殖又可生根； 对易生根植物，切割粗壮的嫩枝用生长素溶液 浸醮处理后在营养钵中直接生根，此方法省去 了生根阶段，但只适于一些容易生根的植物。
2.4.1.2 试管苗的特点
（1）生长细弱，角质层不发达 （2）光合作用差 （3）叶片气孔数少，活性差 （4）根吸收功能弱
2.4.2 试管苗的驯化
目的：提高试管苗的适应性，促其健壮，最 终提高移栽成活率 原则：从温、光、湿度及有无杂菌等环境因 素考虑。驯化开始数天内，与培养环境条 件相似；后期与预计栽培条件相似，逐步 适应。 方法：即炼苗。不开口自然光下2-3天，然 后开口1-2天。
2.4.3 移栽基质的选配
河砂:河砂分为粗砂、细砂两种类型。 粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径 为1-2mm。 草炭土:草炭土是由沉积在沼泽中的植 物残骸经过长时间的腐烂所形成，其 保水性好，蓄肥能力强 腐殖土:腐殖土是由植物落叶经腐烂所 形成。
外植体大小： 5×5mm薄片
上表皮朝上接种
培养基。最好带 叶脉，注意极性
2.2.3.3 培养
培养基：MS、B5、White 、N6；蔗糖3%；
2.4－D利于愈伤组织形成，NAA抑制芽形 成，利于根发生，KT、6BA利于芽形成。
培养条件：25－28℃，10－14h光照，
1500-3000lx （不定芽分化和生长再强 些）。
2.3.2.2 影响试管苗生根的因素
植物材料
基本培养基
植物生长调节剂
培养条件 其它物质
2.4 试管苗的驯化与移载
试管苗生态环境与自然环境的差异
试管苗的特点
试管苗的驯化
试管苗的移栽
2.4.1 试管苗的特点 2.4.1.1试管苗的生态环境
（1）高温且恒温 （2）高湿 （3）弱光 （4）无菌
第2章 植物快速繁殖技术
2.1 试管苗快速繁殖意义和一般程序
2.1.1 试管苗快速繁殖意义
试管苗快速繁殖，是指利用植物组织培 养技术对外植体进行离体培养，使其短期 内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。 试管苗快速繁殖是植物组织培养技术在 农业生产中应用最广泛、产生经济效益最 大的研究领域，涉及的植物种类繁多，技 术日益成熟并程序化。
②蔗糖作碳源效果好，浓度2－3%。 ③激素和有机添加物有明显影响。但激素
浓度以0.1mg/L为宜，不要太高。
培养条件
①光强：1000－3000lx；光照时间：16h。
②温度：25℃左右
③ 昼夜温差有或无，以植物或培养过程来定 ④ 干燥季节注意保湿。
2.2.3 茎段的培养
2.2.3.1 材料选择与处理
嫩枝去叶，剪3-4cm长 水冲洗1-3h,75%酒精30-60s， 0.1% 升汞3-8min(饱和漂白粉液10-20min，
无菌水冲洗数次。
2.2.3.2 接种与培养
培养基：MS
腋芽增殖效果 ：BA KT、ZT，生长素改
善苗生长，GA促芽伸长。注意激素配比。
继代增殖途径：促腋芽快速生长；诱导形
成不定芽。
2.2.3 叶的培养
1.成苗途径与意义 2.材料选择与消毒 3.接种 4.培养
2.2.3.1 材料选择与灭菌
幼嫩叶片流水冲洗 70-75%酒精漂洗10s 饱和漂白粉液浸3-15min（或在0.1%升汞 液5-8min） 无菌水冲洗多次后，用无菌滤纸吸干水分
2.2.3.2 接种
2.1.2 试管苗快速繁殖的一般程序
一般选择根、茎、叶器官为培
养材料进行培养、壮苗与生根培养、
试管苗驯化与移栽几个环节。
2.2 器官培养
2.2.1 根的培养
①研究根系生理代谢的优良实验体系
②研究营养吸收、生长和代谢的变化规律
③建立快速生长的根无性系 ④进行诱变育种
2.2.1.1 根无性繁殖性的建立
接后1周 侧根
无菌种子
1.2cm
反复转接
根 无 性 繁 殖 系
2.2.1.2 培养
多为无机离子浓度低的怀特培养基。也可用2 ／3 MS或1／2MS、B5培养基 注：离体根生长要求 提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好， 培养温度25－27℃，暗光培养。
加入B1、B6最重要，生长素对离体根影响不一致。
2.2.2 茎尖培养
概念：切取茎的先端或茎尖分生组织进
行无菌培养。
意义：微茎尖培养可获得脱毒苗；茎尖
培养技术简单，操作方便，易成活，成
苗时间短，加快繁殖。
茎尖培养的类型
类型：根据培养目的和取材大小分为： 微茎尖培养;普通茎尖培养
普通茎尖指几毫米到几 十毫米的芽尖及侧芽。
微茎尖为0.3-0.5mm
茎尖培养的方法
取 材
消材 毒料 处 理 及 接 种
培 养
2.2.2.1 取材
①直接取材：在生长旺
盛、枝条健壮、无病的母 株上选生长不久、杂菌污 染少的顶梢（1－2cm） （取前可喷杀菌药，可顶 芽或侧芽）。
取1-2㎝顶梢
②从试管苗获取。
2.2.2.2 材料处理及消毒
①顶梢切割成0.5-1.0cm的茎尖（除叶,剥 去休眠芽的鳞片） ②茎尖流水冲洗2-4h
③75%酒精迅速漂洗30s ④0.1%升汞或稀释20倍的次氯酸钠液消毒 5-8min(取自老枝条上的可适当延长时间）
2.2.2.3 接种
接前可再剥去一些 叶片。然后随切随 接，动作迅速。亦 可将切下茎尖材料 在1-5% VC液中浸一 下。
2.2.2.4 培养
培养基
①基本培养基：MS、White、B5、Heller。
2.2.4.4 植株再生途径
直接产生不定芽
形成愈伤组织
形成胚状体
其他途径
2.3 壮苗和生根培养
2.3.1 试管苗的壮苗培养
较高浓度的生长素与较低浓度的细胞分裂 素组合有利于形成壮苗. 在生产实际中，增殖系数控制在 3.0-5.0时 可实现增殖和壮苗的双重目的。另外，改善 培养室环境条件，如增加光照强度、降低湿