发光细菌
毒性试验整理
实验一发光细菌的急性毒性评价试验一、实验器材1.菌株明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）2.培养基酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。
固体培养基再加琼脂2%。
3.溶液、试剂及待测物质酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。
4.仪器及其他用品生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。
二、目的要求1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。
2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。
三、基本原理发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。
不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下：FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为407-409 nm处的蓝绿光。
发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。
发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。
当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。
发光细菌法检测水土环境毒性的进展和评价分析
发光细菌法检测水土环境毒性的进展和评价分析摘要：发光细菌法是一种快速、灵敏的生物测试方法，被人们广泛应用在水土环境毒性测试工作中，取得了理想的成绩。
文章在阐述发光细菌法测定原理的基础上，就发光细菌法在水土环境毒性测定中的应用问题进行探究。
关键词：发光细菌法；水土环境；毒性；检测在现代工业的快速发展下，金属开始通过各个途径进入到土壤、水文、大气等生态系统中，这个期间会对系统中的生物体产生不良反应，进而使得整个生态系统遭受到破坏。
为了能够确保工业发展的安全有效，需要相关人员按照规范的标准研究金属生物毒性以及其在生态系统中的潜在危害。
生物毒性是指生物体在毒物的作用下所产生的不良效应，为了能够更为精准的把握这种反应，可以借助生物测试方法，比如发光细菌法来测试生物体中的毒性。
一、发光细菌法的测定原理生物发光是一种普遍的自然现象，在自然环境中，可见光的生物有发光细菌、真菌、放射虫类等。
发光是发光细菌的一种生理过程，在分子氧作用、细胞内荧光酶催化作用下会将还原态的黄素单核苷酸和长链脂肪醛氧化为黄素单核苷酸和长链脂肪酸。
在发生化学反应之后还会释放出波长在450nm到490nm的蓝绿光。
从实际发展情况来看，发光过程很容易受到外界环境的影响，这个期间，能够干扰或者损害细菌呼吸、生理过程的任何因素都会使得细菌的发光强度出现变化。
在有毒有害物质和发光细菌出现接触的时候，发光强度会出现变化，且随着毒性物质浓度的增加，发光也会日渐减弱。
基于这个特点，可以利用发光细菌作为指示微生物，将发光强度的变化作为重要参考指标，在此基础上深入测定环境中有毒有害物质的生物毒性，从而帮助相关人员全面的了解环境中的污染物质。
二、发光细菌法检测水土环境毒性检测使用发光细菌进行毒性测试可以从以下几个方面进行：第一，利用野生型发光细菌来开展毒性测试，细菌发光强度和毒性物质的浓度会呈现出一种反比的关系。
在具体测试分析中会通过发光抑制率来体现水土环境中的毒性大小。
11发光细菌的制备与微生物画制作
发光细菌的制备与微生物画制作实验目的1.学习制备抗性平板；2.通过特定质粒转化大肠杆菌，学习细菌转化的基本原理及方法；3.验证DNA是遗传物质，加深对中心法则的理解；4.制作荧光微生物画。
细菌转化原理▪转化(transformation)是指受体细菌通过直接吸收来自供体细菌或人工重组的含有特定基因的DNA片段，从而获得了相应遗传性状，这种现象称为细菌转化▪细菌转化的过程是DNA导入和表达的过程。
受体菌的生理状态是影响转化率的首要因素。
▪实验室常用的转化细菌的方法分为化学性感受态菌转化和电打孔转化（又叫电击转化）。
前者需要化学方法处理细菌制备感受态，最为常用；后者虽然受体菌容易制备，也容易获得高转化率，但需要电转化设备。
1928，格里菲斯（Griffith ）肺炎链（双）球菌转化实验，证明遗传物质可以转化进入细菌，改变细菌特性。
可致病的S 型不致病的R型细菌转化发现历史证实转化物质是DNA.Avery and co-workers’ proof that the transforming principle is DNAHershey 获1969 年诺贝尔奖1952，赫歇（Hershey）和切斯（Chase）用同位素技术证明，DNA是遗传分子35S 标记外壳蛋白质,感染后放射标记不进入大肠杆菌细胞32P 标记DNA ,感染后放射标记进入大肠杆菌细胞2008年诺贝尔化学奖—发现和研究绿色荧光蛋白方面作出杰出贡献下村修(Osamu Shimomura)钱永健(Roger Tsien)马丁·查尔菲(Martin Charfie)绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)▪GFP是一种在当今生命科学和医学研究中被广泛使用的示踪物。
▪基于GFP的光学成像技术使人们可以直接观察到从微观到宏观各个层次上丰富多彩的生命现象。
GFP的来源---太平洋的神秘荧光生物其他荧光蛋白质粒pGEX-4T-EGFPEGFP：Enhanced GFP即增强绿色荧光蛋白，是一种优化的突变型GFP，较普通GFP强35倍。
发光细菌GFP的表达机理及应用
发光细菌GFP的表达机理及应用发光细菌GFP是绿色荧光蛋白的简称，是由Aequorea victoria这种水母所产生的一种蛋白质。
GFP不但具有高度的应用价值，而且还是生物学研究中最有用的分子标记之一。
本文将从发光细菌GFP的表达机理、应用以及未来发展等方面进行介绍。
一、发光细菌GFP的表达机理GFP是一种由238个氨基酸组成的蛋白质，主要在海水深处生活的Aequorea victoria珊瑚中产生。
GFP通过吸收紫外线光激发，产生荧光。
GFP能在任何类型的生物组织内发光，不会产生有害影响。
除了绿色之外，GFP还能产生黄色、蓝色、紫色、红色等颜色的荧光。
这些颜色的荧光由不同种类的GFP进行表达，这些不同种类的GFP都具有不同的结构和光学特性。
GFP的结构包含一个由11肽段组成的β桶状结构和一个由α螺旋段组成的关键性结构域。
通过对这个结构域的分子工程改造，研究人员可以对GFP进行改造，使其在其他物种内表达并发光。
二、发光细菌GFP的应用GFP已成为生物医学领域的热门研究课题。
由于GFP可以与其他蛋白质相结合，并且不会对细胞造成任何影响，能够用于实现对生物系统的准确研究。
GFP可以制作成质粒，通过质粒转染等方法，将其导入到需要研究的细胞内。
利用GFP可准确观察到细胞内各种蛋白质分子的定位和表达等情况。
1、生物病理学：GFP在生物病理学领域已经有了广泛的应用。
与其他标记方法相比，GFP标记具有许多优势。
第一，当有多种标记时，GFP在背景噪音中更易于辨认；第二，直接观察细胞在活体状态下的各种功能，例如细胞的表面形态、细胞器的运动等。
2、分子生物学：GFP已经成为分子生物学中最重要的分子标记技术之一。
通过观察GFP标记蛋白分子的表达、定位和交互关系，有助于更好地理解生物化学反应。
利用GFP标记，研究人员可以更好地分离和分析蛋白质、DNA和RNA，进一步深入研究生物化学反应。
3、神经科学：大多数神经科学家利用GFP生物标记技术，将化学物质或电压灵敏的通道与GFP合并。
发光菌在环境毒性检测中的应用
进行监测。利用发光菌对污水处理厂的进出水进行持续监测表 明， 经处理 过后的水质毒性有了明显的降低， 还 发现初级沉淀不能有效 的降低污水 的 毒性， 而毒性的去除主要是在生物处理 阶段 。 除此之外 ， 发光菌还能够评估 化合物的毒性并探 讨毒性指标和 化学指标 的联 系。
３ ． ２发 光 菌 应 用 于 大 气 污 染 毒 性 的 监 测 利用发光菌进行大气污染监测早期出现在四 ｆ 一 年 代。 将 火 力 发 电厂 排
概括如下 ： 细 菌中的黄素单核苷酸在细菌荧光酶 的催化 下发生氧化反应而 放 出光子 ， 从而发 出荧光 。 一般此 荧光 的波长 范围在 ４ ２ ０ — ６ ７ ０ ｎ ｍ， 最大 的发
射波长为 ４ ９ ０ ｎ ｍ， 因此 发 光 菌 发 出的 光 呈 现 蓝 绿 色 。这 个 过程 可 以用 以 Ｆ 反应 式 表 示 ： Ｆ ＭＮＨ２ ＋ Ｏ２ ＋ ＲＣＨＯ 细 菌 荧 光 酶 ＲｃｏｏＨ＋ Ｆ Ｍ Ｎ＋ Ｈ２ ０＋ｈ
３ ． ３发光 菌 用 于 土 壤 污 染 毒 性 的监 测 目前 ， 由于大量农药的使用， 我 国各 地 土 壤 都 受 到 了不 同程 度 的 污 染 ， 危 害 十 分 严 重 。因此 近 些 年 有 人 对 发 光 菌 用 于 七壤 污 染 毒 性 监 测 做 了相 关 研 究 。 通 过 将 土 壤 中 的 毒 性 物 质抽 提 到 水 溶 液 中， 再 用 发 光 细 菌进 行 监 测
科 学研 究
礴湾
发光菌在环境毒性检测 中的应用
潘 涛 朱小亮 王 海 燕
（ 江苏新源水 务有限公司 ２ ２ ３ ８ ０ ９ ） 摘 要： 发光细菌法在环境毒性检测 中是一种快速 、 灵敏 、 低成本 的生物检 测方法 ， 受 到人们 的』 泛 重视。本文就发光菌的形态、 生理 、 生态 以及应用 原理 等进 行 了简述 ， 并对发光菌在环境毒性检测中的应用进行 了概述 。 关键 词 ： 发光菌 ； 环境污染 ； 毒 性 监 测
发光细菌法原始记录
发光细菌法原始记录
（最新版）
目录
1.发光细菌法的概念与原理
2.发光细菌法的实验方法
3.发光细菌法的应用领域
4.发光细菌法的优缺点
5.发光细菌法的未来发展方向
正文
发光细菌法是一种利用发光细菌的光信号来检测环境变化的生物传
感技术。
其原理是某些细菌在生长过程中会自然产生发光蛋白，当环境发生变化时，细菌会调整发光蛋白的表达量，从而改变发光强度。
通过检测这种光信号，就可以获得环境变化的信息。
发光细菌法的实验方法主要包括采样、分离、培养和检测等步骤。
采样时需要选择合适的环境样本，然后通过分离技术将发光细菌分离出来。
在培养阶段，需要为细菌提供适当的营养条件，促进其生长和发光。
最后，通过光学检测仪器检测发光强度，获得环境变化的信息。
发光细菌法广泛应用于环境监测、生物医学和食品安全等领域。
例如，可以利用发光细菌法检测水体中的有机污染物、重金属离子和生物毒素等，评估水体质量和污染程度;也可以用于检测食品中的细菌和真菌等污染物，保障食品安全。
发光细菌法具有多种优点，例如灵敏度高、检测速度快、操作简单、成本低等。
但也存在一些缺点，例如易受环境因素干扰、光学检测仪器精度有限等。
未来，发光细菌法有望在多个领域得到更广泛的应用。
例如，可以利
用发光细菌法检测空气中的有害气体和颗粒物，评估空气质量;也可以用于检测疾病标志物和药物浓度，实现疾病诊断和治疗的个体化和精准化。
发光细菌
优点： 由于发光细菌具有生长迅速、周 期短、测试费用低、同高等动物有着类似 的理化特性和酶作用过程，使其具有因快 速、简便、费用低廉、灵敏度高的特点， 能在短时间内得到可靠的毒性资料的优点， 因此被较多地用于毒性检测 。
发光细菌的发光原理
• 在这些特殊的氧化反应过程中能够产生自由能，这些自由能能够 使最后的产物处于激发态，从而能够产生光子。 • 发光细菌生长初期发光很弱，对数生长中期发光强度达到高峰， 稳定期时发光强度下降。
发光细菌法简介
发光细菌检测原理
• 发光细菌法是利用灵敏 的光电测量系统测定毒 物对发光细菌发光强度 的影响。 • 发光细菌含有荧光素、 荧光酶、ATP等发光要 素，在有氧条件下通过 细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高， 处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增 强。
发光细菌的分类
• 明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）可在牛马的死尸和肉中繁 殖；它侵入人体则会产 生发光尿。
发光细菌的发光原理
• 一般来讲，在所有的生物发光细菌系统中，分子态的氧是直接或间接地 参与其生物化学反应的。 • 在细菌发光体中，分子态的氧氧化FMNH (还原态的黄素单核苷酸)和长 链脂肪醛，在这些反应中生成的能量不是用来质子梯度的建立、渗透反 应以及ATP的合成，而是直接以光的形式释放出来。 • 在这个反应模式中共有3种酶参与，分别为FMN还原酶，荧光素酶和脂肪 酸还原酶。
发光细菌法
• 一、发光细菌简介
1.发光细菌的分类 2.发光细菌的发光原理
• 二、发光细菌法简介
1.发光细菌检测原理 2.发光细菌检测方法 仪器与材料 测定步骤 3.发光细菌法的应用
测定工业废水的毒性 测定水域(水体)的毒性
发光菌的生物毒性测试方法
结果与数据处理
Байду номын сангаас1 相对发光度的平均值
相对发光度（%）=Hgcl2管或样品管发光量/CK管发光量 再求相对发光度平均值 2 建立并检验HgCl2浓度与其相对发光度均值的相关关系 先求出线性回归方程，再在一定的P值条件下查表进行r检测， 验证相关方程成立，然后做出两者的关系曲线，按照同样的方 法检测样品浓度与其相对发光度均值的相关性。
发光菌的生物毒性测试 方法
实验原理
1 发光菌的发光机理 细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化， 将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为 FMN 及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长 为450-490nm处的蓝绿光。 2 实验原理 当发光细菌接触有毒污染物时,细菌新陈代谢则受到影 响,发光强度减弱或熄灭,发光细菌发光强度变化可用发 光检测仪测定出来。在一定浓度范围内,有毒物浓度大 小与发光细菌光强度变化成一定比例关系,因此可通过 发光细菌来监测环境中的有毒污染物。发光细菌应用最 多的是明亮发光杆菌,可以监测各种水体,对气体中可溶 性有毒物质,可先通过吸收、溶解在溶液中,再来观察其 对发光细菌的影响。
仪器介绍
DXY-2型生物毒性测试仪是基于毒性物质对 特殊的发光细菌的发光度的抑制作用而设 计的，它通过测定发光细菌发光度的变化， 量度被测环境样品中由重金属和其它有机 污染物所造成的急性生物毒性。
实验步骤
1 仪器的预热15min和调零 2 试管排列和滴加3%Nacl及样液
取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和 Nacl溶液，将安瓿瓶置于含有冰块的保温 3 细菌冻干菌剂复苏 瓶中，注入Nacl溶液混匀，2min后菌即复 取2ml测试管加2mlNacl3%溶液，10μ L复苏 苏发光 发光菌液，颠倒摇匀，测试发光量，倍率 4仪器检验复苏发光细菌冻干粉质量 调至X2，发光量高于600mv，此冻干粉可 用 发光菌液复苏满15min，用10μ L微量注射 器准确吸取10μ L复苏菌液，逐一加入各管 5 给各测试液加复苏菌液 摇匀（精确计时，记录到秒） 拔出样品室的盖子（红指示灯亮），将待 测样品液比色管放入，盖好盖子，抓住盖 子顺时针旋转（此时只绿指示灯亮）约16 读数 2s读数，抓住盖子顺时针旋转至原处（只 红指示灯亮）向上拔出盖子，取出样品。
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发光细菌
一、填空题
1．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441—1995)，若须排除pH影响，应先将水样和氯化钠溶液的pH进行调整，具体为：含铜水样的pH调整为，含其他金属水样的pH调整为 5.4，含有机化合物水样的pH调整为。
2．《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T15441-1995)适用于、和实验室条件下可溶性化学物质的水质的急性毒性监测。
3．发光菌急性毒性试验中，样品的急性毒性水平可用相对发光度、
或等来表示。
4．淡水型的发光菌急性毒性试验中，样品的急性毒性水平则用相对发光度、
和等来表示。
5．用青海弧菌Q67进行发光菌急性毒性测定时，环境温度在℃之间均可进行，但在测试过程中要求温度波动在±℃内。
二、判断题
1．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441-1995)，用发光菌测定样品的毒性非常简便，冻干粉经复苏后即可用于进行样品的测定。
( ) 2．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T15441-1995)，若须测定包括pH影响在内的急性毒性，不应调节水样pH。
( )
3．在进行发光菌急性毒性试验中，对含有固体悬浮物的样品须离心或过滤去除，以免干扰测定。
( )
4．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441-1995)，氯化汞母液可在2～5℃冰箱里保存6个月，而氯化汞工作液在2～5℃冰箱里只能保存24h。
( )
5．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441-1995)，在测定有色样品时，先要进行颜色干扰的校正，计算出因颜色引起的发光量校正值。
( ) 6．进行淡水型发光菌急性毒性试验时，苯酚溶液的保存和氯化汞溶液相同。
( ) 7．EC50值越小，表示受试物的毒性也越小。
( )
8．进行淡水型发光菌急性毒性试验时，当水样原液的相对强度在50％以上时，可用发光抑制率(％)、EC50值和参比毒物苯酚浓度来表示样品的毒性大小。
( ) 9．进行淡水型发光菌急性毒性试验时，影响发光强度大小除样品的毒性外，还和温度、样品与发光菌的作用时间有关。
( )
10．进行淡水型发光菌急性毒性试验时，冻干粉复苏液在复苏数分钟后，在暗室中肉眼应见绿色荧光，否则就不能使用。
( )
11. 淡水发光菌冻干粉需用0.8％的氯化钠复苏，样品和参比毒物的配制需使用3g／100ml的氯化钠溶液。
( )
三、选择题
1．进行淡水型发光菌急性毒性试验时，毒性测定最迟应在采样后6h内进行，否则应在2～522下保存样品，但不得超过 h。
( )
A． 12 B．24 C．36 D．48
2．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441-1995)，发光菌冻干粉在2～5℃冰箱内可有效保存个月而不致失活。
( )
A．2 B．4 C． 6 D． 8
3．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441-1995)，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过±℃。
( )
A． 1 B．3 C．5 D．7
4．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441-1995)的要求，在制作氯化汞标准曲线时，当氯化汞标准溶液为0.10mg/L时，发光菌的相对发光度为50％，其误差不超过±％。
( )
A． 5 B． 10 C． 15 D．20
5．制作淡水型发光菌急性毒性试验的苯酚标准曲线时，其回归方程应符合统计学检验要求(P＜0.90)，并且EC50值应在 mg/L之间。
( )
A．50～150 B． 10～100 C． 150～250 D． 100～200
6．青海弧菌Q67冻干粉剂，封存于安碚瓶中，在－18℃以下可有效保存个月而不致失活。
( )
A．2 B．4 C．6 D．8
四、问答题
1．简述根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441-1995)进行发光菌急性毒性试验时，如何设置样品试验浓度组。
2．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441-1995)的要求，简述如何对发光菌冻干粉复苏后进行质量检验。
3．发光菌急性毒性试验结果EC50的含义是什么?如果某一样品发光急性毒性试验得出EC50为2.36mg／L,，试解释该结果。
4．用青海弧菌Q67进行发光菌急性毒性测定时，简述如何对测试结果进行质量控制。
5．用青海弧菌Q67进行发光菌急性毒性测定时，简述如何对样品进行预处理。