微生物检测培训--培养基共21页文档
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微生物检验员培训资料
一. 基础知识（一）微生物基础知识（一）微生物基础知识1.1. 培养基培养基培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。
另外，培养基还应具有适宜的pH 值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。
加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。
但多次反复融化，其凝固性降低。
凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。
一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
灭菌采用高压蒸汽灭菌。
（二）消毒与灭菌知识（二）消毒与灭菌知识5.2灭菌方法灭菌方法灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。
本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。
通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达从而达到杀菌目的。
到杀菌目的。
蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，含水量越高，含水量越高，其凝固所需其凝固所需要的温度越低。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。
（三）洁净室行为规范（三）洁净室行为规范（四）实验室安全知识（四）实验室安全知识二. 基本操作（一）培养基配制、灭菌、使用和保藏1. 配制配制1.1 按照培养基瓶签所示，准确称量一定培养基干粉于合适的容器，加纯化水溶解。
水溶解。
1.2 根据培养基对pH 的要求，用5%NaOH 或5%HC1溶液调至所需pH pH。
微生物检测培训
免疫学检测方法
利用抗原抗体特异性结合的原理，通过免疫学技术检测微生物，如酶联免疫吸附试验（ ELISA）、免疫荧光技术等。这些方法具有灵敏度高、特异性强等优点，但需要特定的抗 体和标记物。
02
样品采集与处理
样品采集原则及注意事项
代表性原则
确保所采集的样品能够真实反 映被检测对象的微生物状况， 避免选择受污染或异常的区域
微生物检测广泛应用于食品工业、医药工业、环保、农业等领域，如食品中的 致病菌检测、药品中的微生物限度检查、环境中的微生物污染监测等。
常见微生物检测方法简介
传统检测方法
包括显微镜观察、平板计数法、生化鉴定法等，这些方法操作繁琐，耗时较长，但成本相 对较低。
现代检测方法
如PCR技术、基因芯片技术、生物传感器技术等，这些方法具有灵敏度高、特异性强、自 动化程度高等优点，但成本较高。
电子显微镜观察
利用电子显微镜的高分辨 率，观察病毒的精细结构 合，进行病毒的鉴 定和分型。
病毒培养技术要点
细胞培养
选择适当的细胞系，进行病毒的 培养和繁殖。
病毒接种与收获
将病毒接种到敏感细胞上，经过一 段时间的培养后，收获病毒。
病毒滴度测定
通过空斑试验、TCID50等方法，测 定病毒的滴度，即病毒的感染力。
细菌计数方法及其优缺点比较
显微镜直接计数法
简单快速，但误差较大
平板菌落计数法
准确度高，但操作繁琐，需时较长
光电比浊法
快速简便，但受细菌种类和悬液浓度影响较 大
滤膜法
适用于水样和空气样品，但需特殊设备支持
04
真菌学检测方法
真菌形态学观察与鉴定
显微镜下的真菌形态
利用显微镜观察真菌的菌丝、孢子等 结构特征。
利用抗原抗体特异性结合的原理，通过免疫学技术检测微生物，如酶联免疫吸附试验（ ELISA）、免疫荧光技术等。这些方法具有灵敏度高、特异性强等优点，但需要特定的抗 体和标记物。
02
样品采集与处理
样品采集原则及注意事项
代表性原则
确保所采集的样品能够真实反 映被检测对象的微生物状况， 避免选择受污染或异常的区域
微生物检测广泛应用于食品工业、医药工业、环保、农业等领域，如食品中的 致病菌检测、药品中的微生物限度检查、环境中的微生物污染监测等。
常见微生物检测方法简介
传统检测方法
包括显微镜观察、平板计数法、生化鉴定法等，这些方法操作繁琐，耗时较长，但成本相 对较低。
现代检测方法
如PCR技术、基因芯片技术、生物传感器技术等，这些方法具有灵敏度高、特异性强、自 动化程度高等优点，但成本较高。
电子显微镜观察
利用电子显微镜的高分辨 率，观察病毒的精细结构 合，进行病毒的鉴 定和分型。
病毒培养技术要点
细胞培养
选择适当的细胞系，进行病毒的 培养和繁殖。
病毒接种与收获
将病毒接种到敏感细胞上，经过一 段时间的培养后，收获病毒。
病毒滴度测定
通过空斑试验、TCID50等方法，测 定病毒的滴度，即病毒的感染力。
细菌计数方法及其优缺点比较
显微镜直接计数法
简单快速，但误差较大
平板菌落计数法
准确度高，但操作繁琐，需时较长
光电比浊法
快速简便，但受细菌种类和悬液浓度影响较 大
滤膜法
适用于水样和空气样品，但需特殊设备支持
04
真菌学检测方法
真菌形态学观察与鉴定
显微镜下的真菌形态
利用显微镜观察真菌的菌丝、孢子等 结构特征。
药典微生物检验培训内容
要点：需用对照培养基（中检所）、回收率 结果判定：1、被 对检 照培 培养 养基 基上 上的 的均 均菌 菌数 数落 落 10平 平 0%70%
2、菌落形态大小应与对照培养基上 的菌落一致
计数方法的验证
目的：考察供试液制备过程中微生物受影响的程度 要点：至少应进行3次独立的平行试验 试验菌种：同适用性检查 验证方法：1、试验组
无菌检查法
• 总则：环境、设备、人员 • 培养基：品种、制备、灭菌、贮存、适用性检查 • 稀释液、冲洗液：品种、制备、灭菌 • 方法验证试验：直接接种法、薄膜过滤法 • 供试品的无菌检查：供试品的处理、对照试验、
直接接种法、薄膜过滤法、培养及观察 • 结果判断
培养基适用性检查
包括：无菌性检查 灵敏度检查
解释：
1、初始值：即0时菌数，供试品加入试验菌， 摇匀，立即取样检查，培养，计数
2、不增加：指对前一个测定时间，试验菌增加 的数量不超过0.5lg（如1类细菌，“第14天 ～28天菌数不增加”，是14天与28天作比较）
3、7天、14天的下降数：均与0时菌数作比较
药品微生物检验替代方法验证指导原则
为什么？
菌液的制备：比浊法 供试品接种： ➢ 取包装完整的供试品至少5份，直接接种试验菌；或取
适量供试品分别转移至5个适宜的无菌容器中，再接菌 ➢ 1 、2 、3 类：105～106cfu/g或ml
4类：l03～104cfu/g或ml ➢ 接种菌液的体积不得超过供试品体积的0.5%～1% ➢ 充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布．
不管采用什么方法，都要进行验证！
微生物限度检查法
• 总则 • 检验量：最小包装单位 • 制备供试液：含抑菌成分 • 细菌、霉菌及酵母菌计数：平皿法、薄膜过滤法 • 控制菌检查：7种.供试液制备、增菌、分离、确
2、菌落形态大小应与对照培养基上 的菌落一致
计数方法的验证
目的：考察供试液制备过程中微生物受影响的程度 要点：至少应进行3次独立的平行试验 试验菌种：同适用性检查 验证方法：1、试验组
无菌检查法
• 总则：环境、设备、人员 • 培养基：品种、制备、灭菌、贮存、适用性检查 • 稀释液、冲洗液：品种、制备、灭菌 • 方法验证试验：直接接种法、薄膜过滤法 • 供试品的无菌检查：供试品的处理、对照试验、
直接接种法、薄膜过滤法、培养及观察 • 结果判断
培养基适用性检查
包括：无菌性检查 灵敏度检查
解释：
1、初始值：即0时菌数，供试品加入试验菌， 摇匀，立即取样检查，培养，计数
2、不增加：指对前一个测定时间，试验菌增加 的数量不超过0.5lg（如1类细菌，“第14天 ～28天菌数不增加”，是14天与28天作比较）
3、7天、14天的下降数：均与0时菌数作比较
药品微生物检验替代方法验证指导原则
为什么？
菌液的制备：比浊法 供试品接种： ➢ 取包装完整的供试品至少5份，直接接种试验菌；或取
适量供试品分别转移至5个适宜的无菌容器中，再接菌 ➢ 1 、2 、3 类：105～106cfu/g或ml
4类：l03～104cfu/g或ml ➢ 接种菌液的体积不得超过供试品体积的0.5%～1% ➢ 充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布．
不管采用什么方法，都要进行验证！
微生物限度检查法
• 总则 • 检验量：最小包装单位 • 制备供试液：含抑菌成分 • 细菌、霉菌及酵母菌计数：平皿法、薄膜过滤法 • 控制菌检查：7种.供试液制备、增菌、分离、确
微生物验证专题知识培训
b.干热法：利用物理学，171℃-1小時、160℃-2 小時、121-3小時 : 玻璃器皿
微生物验证专题知识培训
第191页9
洁净工作室
1 无菌检验试验室分无菌操作间和缓冲间 2 进入无菌操作间应有些人净和物净设施 3 无菌操作间内禁放杂物，每次试验后清洁消毒,并定时清洁、
灭菌,每七天彻底消毒一次,臭氧,消毒液0.1%新洁尔灭/75% 酒精/其它交替使用 4无菌操作间定时进行环境监测，可订为 2周~3月，平时试验 中实时做
4.菌种转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 5.各种菌种应按要求时间接种，普通在接种三次后作一次
全方面判定，注意菌种有没有污染及变异，如发觉变异时， 应及时更换。
微生物验证专题知识培训
第3页3
全部存在菌种应具备清单。 保留菌、毒种传代或冻干均应填写专用统计，菌
种管上应有牢靠标签，标明菌种编号、代次、批 号、日期 培养、在药品微生物检验时，可进行简单染色镜 检，以确保在试验中所用菌种正确。 致病菌与普通菌种要分开管理。 保留菌种传代、移种后，销毁原菌种之前，应仔 细检验新旧菌种标签是否正确。
微生物验证专题知识培训
18.2% 64.2% 96.1%
33.1% 87.2% 99.8%
?
?
?
第252页5
上述无菌测试结果启示
含有少许微生物污染产品批次也有可 能“经过”无菌检验
一批产品染菌率越低，依据无菌检验 结果来判定整批产品无菌，其风险就 越大
微生物验证专题知识培训
第262页6
怎样用无菌检验来证实整批产品无菌
微生物验证专题知识培训
微生物验证专题知识培训
第1页
菌种、培养基、试验室环境管理 无菌检验及方法验证 微生物程度检验及方法验证 年版药典增修订情况
微生物验证专题知识培训
第191页9
洁净工作室
1 无菌检验试验室分无菌操作间和缓冲间 2 进入无菌操作间应有些人净和物净设施 3 无菌操作间内禁放杂物，每次试验后清洁消毒,并定时清洁、
灭菌,每七天彻底消毒一次,臭氧,消毒液0.1%新洁尔灭/75% 酒精/其它交替使用 4无菌操作间定时进行环境监测，可订为 2周~3月，平时试验 中实时做
4.菌种转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 5.各种菌种应按要求时间接种，普通在接种三次后作一次
全方面判定，注意菌种有没有污染及变异，如发觉变异时， 应及时更换。
微生物验证专题知识培训
第3页3
全部存在菌种应具备清单。 保留菌、毒种传代或冻干均应填写专用统计，菌
种管上应有牢靠标签，标明菌种编号、代次、批 号、日期 培养、在药品微生物检验时，可进行简单染色镜 检，以确保在试验中所用菌种正确。 致病菌与普通菌种要分开管理。 保留菌种传代、移种后，销毁原菌种之前，应仔 细检验新旧菌种标签是否正确。
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18.2% 64.2% 96.1%
33.1% 87.2% 99.8%
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上述无菌测试结果启示
含有少许微生物污染产品批次也有可 能“经过”无菌检验
一批产品染菌率越低，依据无菌检验 结果来判定整批产品无菌，其风险就 越大
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怎样用无菌检验来证实整批产品无菌
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第1页
菌种、培养基、试验室环境管理 无菌检验及方法验证 微生物程度检验及方法验证 年版药典增修订情况
微生物检验技术培训PPT课件
• 供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜， 每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，且总冲洗量不得 超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。
21
第21页/共80页
二、无菌检查
2. 直接接种法
• 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试 品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培 养基和胰酪大豆胨液体培养基中。
• 除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的支 /瓶数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基 和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：1。
• 除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供 试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐 流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养 基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量 和高度同方法适用性试验。
24h~48
【10版：改良马丁（琼脂）培养 20~25℃
基】
h 【10版：
上制黑述成曲培每霉养1m物l含用菌pH数7.小0于沙或版无1氏：用菌00葡改适氯c萄良宜化fu糖马方钠的琼丁法-菌蛋脂琼制悬白斜脂成液胨面斜孢。缓培面子冲养 培悬液基养液或基【0】1.90%无2℃菌3 】-氯2化8钠5溶d~液7d
23
第23页/共80页
二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•结果判断
• 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生 长。否则，试验无效。
• 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生 长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管 显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定， 除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物 非供试品所含。
20
浮游菌 cfu/m3
沉降菌 （）
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二、无菌检查
2. 直接接种法
• 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试 品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培 养基和胰酪大豆胨液体培养基中。
• 除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的支 /瓶数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基 和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：1。
• 除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供 试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐 流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养 基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量 和高度同方法适用性试验。
24h~48
【10版：改良马丁（琼脂）培养 20~25℃
基】
h 【10版：
上制黑述成曲培每霉养1m物l含用菌pH数7.小0于沙或版无1氏：用菌00葡改适氯c萄良宜化fu糖马方钠的琼丁法-菌蛋脂琼制悬白斜脂成液胨面斜孢。缓培面子冲养 培悬液基养液或基【0】1.90%无2℃菌3 】-氯2化8钠5溶d~液7d
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二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•结果判断
• 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生 长。否则，试验无效。
• 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生 长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管 显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定， 除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物 非供试品所含。
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浮游菌 cfu/m3
沉降菌 （）
微生物的培养基详解演示文稿
毒效果，然后使用 紫外线 进行物理消毒。
• （4）实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒； • （5）饮水水源用 氯气 进行消毒。
• 3．灭菌方法： • （1）接种环、接种针、试管口等使用 灼烧 灭菌法； • （2）玻璃器皿、金属用具等使用 干热 灭菌法，所用器械是 干热灭菌箱 ； • （3）培养基、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法，所用器械是 高压蒸汽灭菌
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖
与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗 ？为什么？
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培 养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
第24页，共34页。
选择培养基
• 加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌
• 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌
二 无菌技术：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，
所有防止杂菌污染的方法。
• 阅读P8---P9说出消毒和灭菌有何不同？
(1)常用消毒的方法：
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔
灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 ……
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形 瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手 时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物 污染培养基。
第23页，共34页。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培 养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培 养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水 珠落入培养基，造成污染。
• （4）实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒； • （5）饮水水源用 氯气 进行消毒。
• 3．灭菌方法： • （1）接种环、接种针、试管口等使用 灼烧 灭菌法； • （2）玻璃器皿、金属用具等使用 干热 灭菌法，所用器械是 干热灭菌箱 ； • （3）培养基、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法，所用器械是 高压蒸汽灭菌
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖
与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗 ？为什么？
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培 养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
第24页，共34页。
选择培养基
• 加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌
• 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌
二 无菌技术：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，
所有防止杂菌污染的方法。
• 阅读P8---P9说出消毒和灭菌有何不同？
(1)常用消毒的方法：
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔
灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 ……
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形 瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手 时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物 污染培养基。
第23页，共34页。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培 养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培 养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水 珠落入培养基，造成污染。
微生物检测培养基和实验基本操作技术
鉴别用培养基
名 称 用 途 蛋白胨水培养基 乳糖胆盐发酵培养基 靛基质和霍乱红试验 大肠杆菌发酵乳糖试验
0.5%乳糖发酵培养基 半固体培养基 三糖铁琼脂培养基（TST）
氰化钾基础培养基
肠道菌生化试验（复发酵） 动力试验和菌种保存 肠杆菌糖发酵及硫化氢反应
沙门氏菌分离
脱羧酶试验对照培养基
细菌脱羧酶试验
4. 深入液面下 2 ~ 4 mm
无菌操作 – 取菌技巧 4
5. 慢慢释放按钮，即可 吸取液体
无菌操作 – 接种技巧
1. 试管前端过火
2. 打开試管盖
无菌操作 –接种技巧
方法二：以安 全吸球吸取菌 液，放入新的培 养基中，向下排 出菌液
方法一：以接
种环沾菌，放
入新的培养基中 接菌
方法三：以
Pipetman 吸取
（三）培养基制备的基本方法和注意事项
• • • • • • • • • 培养基的制备记录 培养基成分的称取 培养基各成份的混合和溶化 培养基pH的初步调正 培养基的过滤澄清 培养基的分装 培养基的灭菌 培养基的质量测试 培养基的保存
1、培养基的制备记录
每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及 其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时 间制备的日期和制备者等。 记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的 培养基一同存放、以防发生混乱。
4. 试管斜倾，放入接种环
无菌操作 – 取菌技巧 1
5. 试管前端过
火，盖上試管盖
6. 接种环烧 红灭菌
无菌操作 – 取菌技巧 1
5. 試管前端 过火，盖上 試管盖
6.接种环 烧红灭菌
无菌操作 – 取菌技巧 2
(方法二：plate 反面拿起)