第四章园艺植物病毒的脱除、检测及鉴定技术

④ 茎尖分生组织存在较高水平的内源生长素，可抑制病毒的增殖。
植物无病毒苗的培育—方法
（二）培养基

培养基： 一般以White、Morel和MS作为基本培 养基，尤其是提高钾盐和铵盐的含量会有利于茎尖的 生长。 植物激素： 其种类与浓度对茎尖生长和发育具有 重要的作用。适当提高生长素(0.1~0.5 mg/L)与细胞 分裂素的浓度，避免使用易促进愈伤组织化的2，4-D， 宜换用稳定性较好的NAA或IBA，细胞分裂素可用Kt 或 BA。有时需添加活性炭。
长，危害程度越来越严重，种类越来越多。尤其是靠无性繁殖 的作物，由于病毒通过营养体进行传递，在母株内逐代积累， 危害日趋严重。而以种子进行繁殖的种类，可随着世代的交替 而去除病毒，病毒只能危害一个世代。
植物无病毒苗的培育
二、病毒在植物上的危害
病毒的危害给植物生产带来的损失很大，如草莓病
毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄
要采用某种适当的处理、打破休眠才能进行。
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三、其他途径脱毒
（一）愈伤组织培养脱毒
通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈 伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株， 可以得到无病毒苗 理由：①病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度； ② 有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。 缺点：植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株
在35~40℃下处理几十分钟至数月。处理时间因植物而异， 如香石竹于38℃下处理两个月，其茎尖所含病毒即可被清除。 马铃薯在35℃下处理几个月才能获得无病毒苗。

特点：热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。例
如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒。因此热处
理需与其他方法配合应用，才可获得良好的脱毒效果 。
植物无病毒苗的利用
二、无病毒苗的利用
无病毒苗在生产中也要防止病毒的再感染。 生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消 毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地 方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮
作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染。
植物无病毒苗的利用
三、无病毒苗的效果
无病毒苗可以表现出明显的优良效果。 如草莓可增产20％~50％，植株结果多，单果 重增加，上等果比例提高。菊花切花品种的脱毒 株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，切 花较重等特点。
一、热处理脱毒
（一）发现：
1889年印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的
甘蔗(现证明为病毒病)，放在50-52℃的热水中保
持30min，甘蔗就可去病生长良好。以后此方法被
广泛用于防治许多植物的病毒病。 热处理又称温治疗法。
植物无病毒苗的培育—方法
（二）原理
是当植物组织处于高于正常温度的环境中 时，组织内部的病毒受热后部分或全部钝化， 不能生成或生成病毒很少，以致病毒含量不断 降低从而达到脱毒的目的 。
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一、指示植物法
1. 概念：利用病毒在其他植物（指示植物或鉴别寄 主）上产生特定症状（枯斑和空斑）作为鉴别病 毒存在与否和种类的方法。 2. 局限性：它只能鉴定靠汁液传染的病毒。
3. 适用：草本与木本植物
4. 优点：灵敏、准确、可靠，操作方便。
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5. 鉴定方法：

植物无病毒苗的培育—方法
3. 培养条件

温度：22℃左右
由于在低温和短 日照下，茎尖有


光强：2000~3000Lx
光照时间：每天16h 。 微茎尖需数月培养才能成功。 茎尖培养的继代培养和生根 培养和一般器官的培养相同。
可能进入休眠；
所以较高的温度
和充足的日照时
间必须保证。
植物无病毒苗的培育—方法
组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提
高产量、质量。因此，到60至70年代在花卉、蔬菜和果树 等得到广泛的应用。
2. 减少环境污染，有利于保护环境
少药剂的使用。
栽培去病毒植物可减
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第二节 无病毒苗培育的方法
一、热处理脱毒
二、微茎尖培养脱毒
三、其他途径脱毒
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扇叶病毒使葡萄减产10％~18％，花卉病毒的危害一般 会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、 变色等。 由于病毒对植物造成如此严童的危害，所以世界各
国都积极开始重视这方面的研究。
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三、无病毒苗培育的意义
1. 去除病毒危害，提高作物品质与产量。采用生物、物理、
化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。而通过
植物无病毒苗的培育—方法
2. 茎尖的剥离与接种
在解剖镜下，将灭菌的外植体放在一个衬有无 菌湿滤纸的培养皿内（防止茎尖变干 ），用解剖 针将叶片和叶原基剥掉，当一个闪亮半圆球的顶端 分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组 织切下来，可带1~2枚幼叶，然后将其接种到培养 基上。
注意：剥离与接种尽量要快，以防茎尖变褐死亡。
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（三）热处理方法
1. 温汤浸渍处理
适用：休眠器官、剪下的接穗或种植的材料
方法：50℃左右的温水中浸渍10min至数小时
特点：方法简便易行，但易使材料受伤。
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2. 热空气处理


适用：对活跃生长的茎尖效果较好
方法：将生长的盆栽植株移人温热治疗室(箱)内，一般
（四）影响微茎尖培养的因素
1．外植体大小
外植体越大，茎尖越易成活，分化率越高，产生再生 植株的机会越大，但脱毒效果越差； 外植体越小，茎尖越难成活，分化率越低，产生再生植 株的机会越小，但脱毒效果越好。 叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力， 一般认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生 长素和细胞分裂素。
汁液涂抹法：从被鉴定植物上取1~3g幼叶 →
研碎→过滤→取滤液涂抹于指示植物的叶面上→ 保温15~25℃ →接种后2~6d 可见症状出现 。
嫁接接种法：以指示植物作砧木，被鉴定植物
作接穗，常用劈接法。
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二、抗血清鉴定法
1. 原理： 植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋 白，是一种较好的抗原，给动物注射后会产 生抗体，抗体存在于血清之中称抗血清。不

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（三）微茎尖培养方法
茎尖 （shoot tip）
顶端分生组织及其下方 1—3个幼叶原基构成
外 植 体
茎的顶端分生组织 （apical meristem）
茎的最幼龄叶原基上方的 一部分，最大直径约 100um,最大长度约 250um
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1. 外植体的预处理 将带幼叶的茎芽叶片在75％酒精中浸蘸数秒钟 （叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花）或用0．1％次 氯酸钠表面消毒l0min（叶片包被松散的芽，如香石 竹，蒜和马铃薯等）。
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植物组织内病毒含量随与茎尖距离加大而增加的原因
① 在植物体内，病毒易于通过微管系统移动，但分生组织中无此系
统；病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但它的速度 极慢，难以赶上活跃生长的茎尖。
② 活跃生长的茎尖分生组织代谢活性很高，致使病毒无法复制。
③ 若植物体内存在病毒钝化系统，它在分生组织中比在任何其它区 域都有更高的活性而钝化病毒，使分生组织不受浸染。
同病毒产生的抗血清有各自的特异性。用已
知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。
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2. 鉴定方法：
抗原的制备 →→抗血清的采收，分 离→→把稀释的抗血清与未知的病毒植物 的汁液在小试管内混合→→根据沉淀反应 来鉴定病毒种类。
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3. 特点：
特异性高（这种抗血清是高度专一性的 试剂），测定速度快，一般几小时甚至几分 钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒 鉴定中最有用的方法之一。
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三、电子显微镜检查法 病毒有一定的形态（ 球状、杆状、线状等）
和大小（ 0.01~0.3um ）。

采用电子显微镜（分辨率0.0001um）可以直 接观察病毒，检查出有无病毒存在，并鉴定病毒 的种类。 优点：灵敏度高，能在植物粗提取液中定量测 定病毒。

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第四节 无病毒植物的利用
无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有
可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病
毒苗，就应很好地隔离与保存。这些原原种或原
种材料保管得好可以保存利用5~10年。
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• 二、无病毒苗的保存繁殖 • 1、隔离保存：防虫网室 • 2、长期保存： • 低温保存：培养基中，生长缓慢 • 超低温保存：液氮
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（二）茎尖微体嫁接
1. 概念：将无病毒茎尖（ 0.4~1.0mm ）嫁接在培养基上 培养的实生砧木上，以获得脱毒苗木的技术。
2. 适宜：茎尖培养难以生根的植物，如桃、柑橘、苹果等
3. 无病毒茎尖来源成年无病毒植物、温室培养的植物、
热处理植物和脱毒试管苗。
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第三节 无病毒植物的鉴定
从上述途径培育得到的植株，必须经严格鉴定，证明确实 无病毒存在，才是其正的无病毒苗，才可提供给生产应用。
鉴定的方法有多种：
一、指示植物(indicating Plant)法 二、抗血清(antiserum)鉴定法 三、电子显微镜(electric microscope)检查法
植物无病毒苗的培育—方法
2．培养条件
在茎尖培养中，较高的温度和充足的光照有利
于茎尖的培养。
光下培养的效果通常比暗培养效果好，如马铃 薯茎尖培养时，当茎已长到1cm高时光照强度便增 加到4000Lx。