微生物检验实验室嗜血杆菌属检验标准操作规程
CNAS-GL028：2018《临床微生物检验程序验证指南》
CNAS-GL028临床微生物检验程序验证指南Guidance on the Verification of Procedures used in the Clinical Microbiology中国合格评定国家认可委员会前言本文件由中国合格评定国家认可委员会（CNAS）制定，是对CNAS-CL02：2012《医学实验室质量和能力认可准则》和CNAS-CL02-A005:2018《医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明》中有关临床微生物检验程序验证所做的具体解释和指导，供医学实验室和评审员参考使用。
本文件的附录A和附录B为资料性附录。
本文件代替：CNAS-GL41：2016。
本次为换版修订，相对于CNAS-GL41：2016，本次换版仅涉及文件编号改变。
临床微生物检验程序验证指南1 范围本指南适用于申请认可或已经认可的医学实验室规范其临床微生物检验程序验证的技术活动，也可供认可评审员在评审过程中使用。
本指南主要适用于医学实验室临床微生物检验，其他领域的实验室可参考使用。
临床微生物检验程序，也称临床微生物检验方法，在本指南中统一称为临床微生物检验程序（以下简称“检验程序”），包括显微镜检查、分离培养和鉴定、药物敏感试验等各项检验活动。
2引用文件3 术语和定义4 检验程序验证4.1在常规应用前，应由实验室对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证。
实验室应从制造商或方法开发者获得相关信息，以确定检验程序的性能特征。
实验室进行的独立验证，应通过获取客观证据（以性能特征形式）证实检验程序的性能与其声明相符。
验证过程证实的检验程序的性能指标，应与检验结果的预期用途相关。
细菌鉴定和药敏系统的验证，应按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其它已知菌株对商业鉴定系统（包括自动、半自动、手工）每种板（条/卡/管）的鉴定/药敏结果符合性进行验证。
注：已确认的检验程序是经国家卫生管理部门批准的体外诊断医疗器械使用说明书中规定的程序，或国际公认标准或指南中的，或国家、地区法规中规定的程序。
医院微生物室血液感染病原体检验操作规程
医院微生物室血液感染病原体检验操作规程1、标本采集(1)、采集时间和次数血标本一般应在病人发热初期或根据不同的发热情况在未用抗生素前采集做细菌培养，提高阳性率需连续三次采血进行培养。
(2)、采血部位及抽血量一般抽取肘静脉血。
采血量为成人5-10ml，儿童为3～5ml。
(3)、结果观察：培养72小时后若肉眼或自动血液培养仪报告仍未细菌生长，则盲目移种一次，仍未细菌生长，向临床发出一级初级报告：“血液经72小时培养无细菌生长”：为避免漏诊，应在培养5天、7天时再作盲目移种培养。
疑为亚急性细菌性心内膜炎、真菌血症等时，血培养至少连续培养2～3周，仍无细菌生长方可报告为阴性。
2、检验程序血液标本（无菌采集）72小时盲目移种（初级报告）传统方法或自动血液培养仪指示有细菌生长涂片、染色、镜检需氧培养及CO2培养直接药敏试验（血平板、巧克力琼脂）观察菌落涂片、染色、镜检纯培养血清学鉴定ATB Expression报告3、血培养瓶中不同表现为不同细菌生长：浑浊并有凝无块金黄色葡萄球菌均匀浑浊，发酵葡萄糖产气多为革兰阴性菌微浑浊，有绿色变化肺炎链球菌表面有菌膜，培养基清晰，底层容血枯草杆菌表面有菌膜，膜下有绿色浑浊铜绿假单胞菌血细胞层上面有颗粒状生长，自上而下的溶血溶血性链球菌4、血液及骨髓标本中常见病原菌革兰阳性菌革兰阴性菌肺炎链球菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌伤寒及其它沙门菌表皮葡萄球菌变形杆菌溶血性链球菌产气肠杆菌粪肠球菌肺炎克雷伯氏菌铜绿假单胞菌粪产硷杆菌沙雷氏菌流感嗜血杆菌布鲁氏菌5、报告结果5.1、在血液中检出沙门氏菌，必须以血清凝集试验为依据报告血清型。
5.2、血液正常情况下应是无菌的，如培养出细菌即为致病菌，应报细菌的种属及药敏试验结果。
5.3、血培养阳性均作为危急值报告。
微生物实验室操作规程【SOP】2024
正文内容：1. 培养基和试剂的制备和保存1.1 培养基的制备- 确保实验室用水质量符合要求，执行水质监测。
- 配制培养基时，按照配方的比例准确称量和混合各种成分。
- 制备后的培养基要经过高温高压灭菌处理，并记录相关信息。
1.2 试剂的准备与保存- 确保试剂的纯度和质量。
- 试剂的保存应遵循相应的储存条件，如低温、干燥、避光等。
2. 微生物实验室的清洁和消毒2.1 实验台面和设备的清洁- 实验结束后，及时清洁实验台面和设备，移除残余的微生物和污渍。
- 使用合适的清洁剂和消毒剂，遵循正确的清洁和消毒程序。
2.2 垃圾处理和废弃物管理- 将实验室生活垃圾与实验废弃物分类投放，遵循垃圾分类和废物管理的要求。
- 在实验室内配备明显的废弃物容器，并定期清理和更换。
3. 生物安全操作和防护3.1 实验室内的个人防护- 实验室工作人员应穿戴实验室指定的个人防护装备，包括实验服、手套、口罩等。
- 定期检查和更换个人防护装备，确保其完好无损。
3.2 操作台上的生物安全柜使用- 使用生物安全柜操作时，按照正确的使用方法进行操作。
- 养生物安全柜使用后，要及时清洁和消毒。
4. 微生物实验的准备和操作4.1 实验准备- 在进行微生物实验前，要仔细阅读实验方案和相关文献，了解实验目的和操作步骤。
- 准备所需的培养基、试剂、设备等，并确认其完整性和有效期。
4.2 微生物实验操作- 操作前要洗手并戴好手套，保持操作台面的清洁。
- 严格按照实验方案的指导进行操作，确保实验过程的准确性和可重复性。
- 实验过程中注意观察实验样品的变化，并记录相关数据和观察结果。
5. 实验数据记录和结果分析5.1 数据记录- 在实验过程中，实验人员要及时、准确地记录实验数据和观察结果。
- 记录的数据要清晰可辨，并加以正确的标注和注释，以便后续的数据分析和结果验证。
5.2 结果分析与总结- 在实验完成后，仔细整理和分析实验数据，得出结论并进行结果的可靠性评估。
微生物限度检查标准操作规程
微生物限度检查标准操作规程一、引言。
微生物限度检查是指在制药生产过程中，对原料药、辅料、中间体、制剂等药品进行微生物检查的一项重要工作。
微生物限度检查的目的是为了保证药品的质量和安全，防止因微生物污染而引起的药品变质和危害患者健康的风险。
本操作规程的目的是规范微生物限度检查的操作流程，确保检查结果准确可靠。
二、适用范围。
本操作规程适用于制药企业进行微生物限度检查的操作人员，包括检验员、操作人员等。
三、术语和定义。
1. 微生物限度，指药品中允许存在的微生物的最大数量，通常以菌落形成单位（CFU）或细菌总数来表示。
2. 微生物限度试验，是指对药品中的微生物进行检查的一种实验方法，包括细菌总数、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、霉菌和酵母菌等指标。
3. 标准菌株，指已经鉴定并保存在实验室中的具有代表性的微生物菌株。
四、操作流程。
1. 样品准备。
（1）取样品，按照规定的取样方法，从所检查的药品中取得代表性样品。
（2）样品处理，根据检测要求，对样品进行必要的处理，如稀释、均质等。
2. 培养基制备。
（1）准备培养基，根据检测要求，准备所需的培养基，包括琼脂培养基、液体培养基等。
（2）灭菌处理，对培养基进行高压蒸汽灭菌处理，确保培养基的无菌状态。
3. 菌种接种。
（1）接种方法，根据检测要求，选择适当的接种方法，包括平板法、涂布法等。
（2）接种数量，根据微生物限度试验的要求，按照规定的接种数量接种标准菌株。
4. 培养条件。
（1）温度控制，根据不同的微生物菌种，控制培养的温度，通常为30-35摄氏度。
（2）培养时间，根据微生物限度试验的要求，培养一定的时间，通常为24-48小时。
5. 菌落计数。
（1）观察菌落，根据培养基上的菌落形成情况，进行菌落计数。
（2）结果判定，根据菌落计数的结果，判定样品中微生物的数量是否符合规定的限度要求。
五、质量控制。
1. 内部质量控制，每批次微生物限度试验前，进行内部质量控制，确保实验条件的稳定性和可靠性。
微生物限度检查操作规程
微生物限度检查操作规程《微生物限度检查操作规程》一、目的微生物限度检查是用于确认产品是否符合微生物水平要求的一种分析方法。
本操作规程的目的是制定微生物限度检查的操作步骤，确保检查结果的准确性和可靠性。
二、适用范围本操作规程适用于所有需要进行微生物限度检查的产品，包括食品、医药和化妆品等。
三、操作步骤1. 准备工作：清洁实验室工作台面和仪器设备，准备所需的培养基和试剂，并确保仪器设备的正常运转。
2. 取样：按照产品的取样标准，从不同批次或不同位置进行取样，并确保取样的代表性。
3. 样品制备：将取样的产品进行样品制备，包括稀释、搅拌和过滤等步骤，以便于后续的微生物检查。
4. 培养：将样品接种在适当的培养基上，根据不同的微生物种类和要求进行培养，并进行恒温培养一定时间。
5. 计数：在培养一定时间后，对培养基上的菌落进行计数，并按照标准方法进行结果的记录和确认。
6. 结果判定：将检查结果与产品的微生物限度标准进行比对，根据结果作出是否合格的判定。
7. 结果记录：将微生物限度检查的结果进行记录，包括样品信息、操作步骤、检查结果和判定等信息，并将结果报告给相关部门或供应商。
四、注意事项1. 操作人员应具备一定的微生物检测知识和操作技能，严格按照操作规程执行。
2. 实验室应保持清洁、卫生，并进行定期消毒和验证。
3. 实验室设备应定期维护和校准，确保设备的准确性和可靠性。
4. 所使用的培养基和试剂应符合相关标准，存放在干燥、阴凉、避光的环境中。
5. 检查结果应及时报告，并根据结果采取相应的控制措施。
以上就是《微生物限度检查操作规程》的主要内容，希望能够帮助大家更好地进行微生物限度检查，确保产品质量和安全。
临床医学检验考试辅导《微生物检验》其他革兰阴性杆菌及检验讲义
其他革兰阴性杆菌及检验●考点◆ 嗜血杆菌属·生物学性状·临床意义·微生物学检查◆ 军团菌属、鲍特菌属、布鲁菌属【内容讲解】其他革兰阴性杆菌：◆ 一些无动力，无芽胞，菌体小，形态近似球杆菌，对营养要求较苛刻的小杆菌。
◆ 主要包括嗜血杆菌属、鲍特菌属、布鲁菌属等。
一、嗜血杆菌属◆ 一类无动力、无芽胞的革兰阴性小杆菌，常呈球杆状，有时呈杆状、长丝状等多形态。
◆ 与临床有关的为9个种，即流感、副流感、溶血、副溶血、嗜沫、副嗜沫、杜克及埃及嗜血杆菌。
◆ 人工培养基中加入新鲜血液才能生长，故称嗜血杆菌。
（二）流感嗜血杆菌简称流感杆菌，不是流感的病原菌。
1.生物学性状（1）形态与染色：◆ 急性感染标本，如脑脊液中多为短小球杆菌，恢复期病灶或长期人工传代培养呈球杆状、长杆状、丝、状等多形态性。
◆ G-，着色较浅。
石碳酸复红或美蓝单染色，两端浓染现象。
◆ 毒力株（粘液型菌株）在营养丰富的培养基上，6～8h有明显荚膜，在陈旧培养物中荚膜消失。
◆ 无鞭毛，无芽胞。
（2）培养特性：◆ 需氧菌。
初次分离培养时，最好在5%～10%C02环境中，以促进其生长。
◆ 普通培养基中须加入X和V因子，才能生长。
◆ 巧克力琼脂平板上生长较佳：圆形、光滑、湿润、边缘整齐，呈露滴状的小菌落。
48h后可形成直径1.0～1.5mm灰白色较大的菌落。
有荚膜菌株的菌落呈轻度粘稠。
◆ 卫星现象：有助于对流感嗜血杆菌的鉴定。
当流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上共同培养时，由于后者能合成较多的V因子，可促进流感嗜血杆菌的生长，在葡萄球菌菌落周围生长的流感嗜血杆菌菌落较大，离葡萄球菌菌落越远的菌落越小。
◆ 液体培养基中：有荚膜的菌株呈均匀混浊生长，无荚膜的R型菌株则为颗粒状沉淀生长。
（3）生化反应：◆ 对糖发酵不稳定。
一般分解葡萄糖只产酸，不分解乳糖或甘露醇，对麦芽糖、蔗糖或糊精的发酵不稳定。
◆ 还原硝酸盐。
有荚膜菌株产生吲哚。
细菌鉴定中应注意的问题
细菌鉴定中应注意的问题细菌是自然界中数量最大、分布最广、种类最多的病原体，其不仅代谢活力强，繁殖也非常快，并且易于变异，这些特性使得临床进行细菌鉴定时面临着较大的困难。
虽然临床在微生物检验方面不断更新技术、采取各种质量控制措施，但细菌鉴定过程中依然存在许多问题，检验人员若是不加以注意，将很难获得正确的鉴定结果，自然也谈不上对患者病情的准确诊断和有效治疗。
本文试分析阐述细菌鉴定各个环节中应该注意的一些问题。
一、标本采集环节我国有超过8成的医院在细菌标本的采集上存在问题。
以痰液标本为例，大部分痰液标本不合格的原因都是标本中存在除了痰液之外的其他呼吸道分泌物，这些分泌物污染了痰液标本，使其达不到痰液标本要求的质量标准，检验人员不得不将不合格的标本打回，由采集人员再次采集标本，这不仅浪费时间，还会给患者带来不适。
再以尿液标本为例，临床检验要求尿液标本应为患者晨起后的新鲜中段尿，若是刚刚排出的尿液，容易受到膀胱、尿道下段等泌尿器官中其他菌群的污染。
此外，对于术后感染分泌物或外伤分泌物，应采集深部的分泌物，医院要求细菌常规培养不得检出厌氧菌，否则会影响对厌氧菌的诊断准确性，若是采集浅表位置的分泌物，标本将会与空气接触，进而被污染。
此外，细菌标本应确保采集足量，以免需要二次采集。
二、标本送检环节细菌鉴定结果不仅与标本采集质量有关，与送检环节是否合乎规范也有密切联系，送检的过程中若是保存的容器开放，与外界空气和微生物接触，将会导致标本被污染。
此外，尿液标本应在采集后尽快送交实验室进行检验，以免因为尿液营养丰富而在较长的时间内有细菌大量繁殖，导致鉴定结果出现偏差。
血液标本也要尽快送检，若是保存时间过长、保存环境温度过高，血液标本将有可能发生凝血、溶血、变质等问题，也会影响鉴定结果的准确性。
三、分离鉴定环节（一）分离培养环节在进行细菌的分离培养时，应该基于标本的来源、病原菌可能的类型来选择适合的孵育环境和培养基，若有特殊需要，还需要选择特殊的培养基。
临床微生物实验室血培养操作标准
临床微生物实验室血培养操作标准1 范围本标准规定了血培养标本临床微生物检验的技术要求。
本标准适用于开展血培养的临床微生物实验室。
2 术语一套血培养：从同一穿刺点同时采集的血液标本，分别注入需氧和厌氧瓶；静脉输液港：一种植入皮下，可长期留置在体内的静脉输液装置；HACEK菌群：嗜沫嗜血杆菌、伴放线放线杆菌、人心杆菌、啮氏艾肯菌和金氏金菌；血培养污染率：一般由凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌、芽孢杆菌、痤疮丙酸杆菌和微球菌等污染引起的阳性瓶占总送检瓶数的比例。
3 导言人体血液中有很多物质，包括溶菌酶、白细胞、免疫球蛋白、补体等，可在几分钟内将入侵血流的微生物清除。
当微生物感染超出人体免疫系统的防御能力时，人体不能将微生物局限于原始感染的部位，或在治疗中不能通过切除、引流等措施清除感染源，那这些微生物将侵入血液迅速繁殖形成菌血症或真菌血症。
一过性菌血症常发生于对感染灶的外科处理、黏膜的创伤操作和易污染的外科手术，亦可发生于全身或局部感染的早期；间歇性菌血症常发生于腹腔等部位未能及时引流的脓肿；持续性菌血症常发生于感染性心内膜炎等血管内膜感染以及伤寒和波浪热的最初几周。
菌血症是临床急症，应尽快采集血液进行培养。
血培养是对入住急诊科、ICU患者、移植患者以及静脉插管患者的败血症进行早期诊断的一种方法，并根据阳性血培养病原菌的药物敏感性试验，可为临床医生提供最佳的抗菌药物治疗方案，对降低病死率有很大帮助，血培养对于临床诊断和预后评估也具有重要的意义。
4 血样采集和培养瓶接种4.1 采血指证可疑感染患者出现以下一种或几种特征时，可以考虑采集血培养：发热（≧38℃）或低温（≤36℃），寒战，白细胞计数增多（计数＞10.0×109 /L，特别有“核左移”时）或减少（计数＜3.0×109 /L），皮肤黏膜出血，昏迷，多器官衰竭，血压降低，C反应蛋白、降钙素原（PCT）、1，3-β-D-葡聚糖（G试验）升高及突然发生的急性呼吸、体温和生命体征改变。
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微生物检验实验室嗜血杆菌属检验标准操作规程
1. 概述
嗜血杆菌属包括流感嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、杜克嗜血杆菌等9个种。
临床上以流感嗜血杆菌最为常见。
2. 标本类型
血液、痰、脑脊液标本。
3.鉴定
3.1 形态与染色革兰阴性短杆菌。
3.2 培养特性在巧克力琼脂平板上35℃培养18~24小时，形成微小、无色透明似露滴状的菌落。
在血琼脂平板上形成极小、圆形、透明的菌落，并有“卫星现象”。
3.3 生化反应分解葡萄糖，不分解蔗糖和乳糖，吲哚、触酶和硝酸盐还原试验均为阳性。
3.4 鉴别要点
3.4.1 本菌属特征革兰阴性细小杆菌，多形性，菌落为无色透明似露滴状，卫星现象阳性，生长需要X、V两种因子，普通培养基不生长。
3.4.2 流感嗜血杆菌的种间鉴别见表
嗜血杆菌鉴别的关键性试验
-
+
+
-
+
+
-
+
+ 注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴
性，“V”为11-89%菌株阳性，“W”为弱发酵反应。
3.5 操作步骤
3.5.1 涂片、革兰染色呈革兰阴性短小杆菌。
3.5.2 鉴定从巧克力琼脂平板上挑取可疑菌落，用微
生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。
4.药敏
参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20
最新版本文件。
5.质量控制
见《质量管理程序》。
6.检验结果解释与分析
如果检出β-内酰胺酶阳性流感嗜血杆菌则提示对青霉素、
氨苄西林、阿莫西林耐药（耐药机制大多为TEM型β-内酰胺酶）。
如果流感嗜血杆菌β-内酰胺酶阴性，而对氨苄西林耐药，则对阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、头孢克罗、头孢他啶、头孢尼西、头孢丙烯、头孢呋辛均耐药。
7.临床意义
流感嗜血杆菌常寄居于正常人呼吸道（在呼吸道定植者可达到人群的50%），当机体抵抗力下降时，可引起人类呼吸道感染；也也可随血液入侵组织内部，引起脑膜炎、关节脓肿或其他部位的化脓感染。
副流感嗜血杆菌寄居在人类的上呼吸道，可引起呼吸道感染，偶尔引起心内膜炎等。
8.鉴定流程
参考文献
[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解，第二版，上海：上海科学技术出版社，2007
[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编，全国临床检验操作规程，第三版，南京：东南大学出版社，2006
[3]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-GL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南，2008
编写人：AAA、BBB 操作人：本室操作人员批准人：。