生态毒理学：第三章 生态毒理学常用实验方法GB格式
3章-生态毒理学研究方法
种或多种污染物单独或联合存在条件下，所导致的影
响或危害。
所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个
体、种群、群落-生态系统各级水平上的反映。
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（二）毒性试验的方式 1.毒性试验的分类 根据毒性试验所经历的时间长短：短期毒性试验，中 期毒性试验和长期毒性试验。 根据试验溶液或试验气体的给予方式：静止式毒性试 验和流动式毒性试验。
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(二)荧光原位技术的基本过程
1.制备和探针标记：
常用的探针信号标记方法有两种： ①直接标记法。将荧光分子直接标记于探针DNA/RNA 上，杂交后可直接在荧光显微镜下检测。 ②间接法。采用一中间分子标记探针，杂交后再用荧 光分子标记的中间分子的亲和物或抗体进行检测。
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2.染色体原位杂交 杂交前变性处理染色体标本，使染色体DNA变为部 分单链，并去掉附着的RNA及蛋白质，变性处理生
八、RAPD技术在DNA损伤检测中的作用
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一、PCR—SSCP技术
(一)PCR—SSCP的基本原理 单链DNA由于有链内碱基配对而具有一定的空间 结构，当DNA链上的碱基(即使是一个碱基)发生 改变时，单链DNA会形成不同的构象，称为单链 构象多态性(single strand conformation
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二、荧光原位杂交技术
(一)荧光原位杂交的原理及特点
荧光原位杂交(fluorescene in situ hybridization， FISH)是20世纪80年代在原位杂交基础上建立起来的 一种高度灵敏、特异性好以及分辨率强的染色体和 基因分析技术，它通过荧光标记的各类DNA和RNA 探针与细胞或组织在玻片上进行杂交，在不改变其 结构的情况下，进行细胞内DNA、RNA某特定序列 的测定，可用于染色体识别、基因定位和基因诊断、 染色体结构畸变和数目改变分析。
环境毒理学常用实验方法
<1 1～ 50～ 500～ 50000～
<10 10～ 100～ 1000～ 10000～
兔经皮 LD50 （mg/kg）
<5 5～ 44～ 350～ 2180～
对人可能致死的估剂量
⑴g/kg 体重 ⑵g/60kg 体重
<0.05 0.05～ 0.5～ 5.0～
<0.1 3.0 30.0 250.0
計算公式
LogLD50=Xm-i(∑P-0.5)
式中Xm—最大劑量的對數值 i—相鄰劑量比值的對數 ∑P—各組死亡率的總和（以小數
表示）
急性毒性分級
為了粗略表示外源化學物急性毒性的強弱 和其對人的潛在危害程度，國際上提出了 外源化學物的急性毒性分級（acute toxicity classification）。但分級標準並 未完全統一
>15.0 >1000.0
LD50影響因素
試驗動物的內外環境各種因素的影響 試驗人員操作熟練程度 受試化學物的濃度或稀釋倍數的影響 同一外源化學物在同一品系動物和同樣
接觸途徑所測定的LD50值也會有一定差 異，甚至可有2～3倍的波動範圍
急性毒作用帶(acute effect zone，Zac)
Zac =
描述性動物實驗研究採用的體外試驗研究的模 型標本包括某些離體臟器、組織切片、原代細 胞、傳代培養細胞、組織勻漿、亞細胞組分， 甚至昆蟲、細菌等
染毒途徑和方式
經口染毒 經呼吸道染毒 經皮膚染毒 其他途徑染毒
經口染毒
➢灌胃 ➢喂飼 ➢吞咽膠囊
灌胃
❖人工給實驗動物灌入外源化學物是經常使用 的經口染毒方法。此時外源化學物直接灌入 胃內，而不與口腔及食道接觸，故而給予的 化學物劑量準確。但是，當待測化學物為氣 態或固體時均需用某種溶劑溶解，液態化學 物往往也需用溶劑溶解
生态毒理学实验
生态毒理学(大三)试验一叶绿素a和叶绿素b含量的测定 20110422一、实验目的掌握叶绿素a和叶绿素b含量的测定的方法。
二、实验原理因叶绿素a和叶绿素b溶于二甲基亚砜（DMSO），叶绿素a和叶绿素b在663nm、645nm处具特有吸收峰，测其光密度值。
根据朗伯比尔定律计算叶绿素a和叶绿素b的浓度。
三、材料用品新鲜植物叶片 721nm分光光度计 DMSO 25ml容量瓶 80%丙酮量筒四、实验步骤1称取100mg绿叶撕碎放入25ml容量瓶中，并向其加入5mlDMSO2然后将其放入65℃恒温柜中保温0.5-4h。
3待到一定时间取出后，向其加入80%丙酮溶液定容至25ml。
4取溶液于663nm、645nm条件下测定光密度值，记下实验数据。
五、实验数据处理将测得的光密度值带入下列公式中计算叶绿素a和叶绿素b的含量Ca=12.7*A663-2.69*A645Cb=22.9*A945-4.68*A663Ct=Ca+CbC(mg/g鲜重)=mg/L*总体积(L)/鲜重(g)试验三重金属铜离子对种子萌发的毒性效应一、实验原理植物种子在适宜的条件（水分、温度和氧气等）下，吸水膨胀萌发，在各种酶的催化作用下，发生一系列的生理、生化反应。
但是，当大量重金属离子存在时会抑制一些酶的活性，从而使种子萌发受到影响，破坏发芽过程，因此通过测定种子发芽情况，就可以预测和评价重金属离子对植物的潜在毒性。
二、实验目的1. 学习掌握植物种子毒性试验的方法2. 确定种子发芽率和伸长率的EC50三、材料，试剂及仪器材料：荞麦，小麦，黄豆试剂：CuSO4 ·5H2O、蒸馏水仪器：培养皿、移液管、滤纸、镊子四、实验步骤1、溶液配制硫酸铜溶液的配置：将硫酸铜按浓度梯度0（对照）、100 mg/L 1000 mg/L、5000mg/L、10000mg/L配置不同浓度的硫酸铜溶液2、种子处理种子经挑选后按每培养皿每种10粒置于垫有两层滤纸直径为6cm的玻璃培养皿,每培养皿加入10mL不同浓度的硫酸铜处理液,处理液浸透滤纸并完全浸润种子, 将培养皿盖好放入室温阳光下进行发芽试验3、观察记录每日向不同处理组添加5mL硫酸铜溶液以保持湿润。
环境毒理学常用实验方法
方法
通常将动物长期暴露于毒物，观察肿 瘤发生情况、类型和恶性程度等指标。
03
细胞培养实验方法
细胞毒性实验
01
02
03
MTT法
通过检测活细胞线粒体中 的琥珀酸脱氢酶来反映细 胞活性，评估毒物对细胞 的毒性作用。
LDH释放法
检测细胞损伤时释放的乳 酸脱氢酶，用于评估毒物 对细胞膜的损伤程度。
中性红摄取法
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数据分析和结果解读
数据统计和分析方法
描述性统计
对数据进行整理、分类、汇总，通过图表展示数据的分布、中心 趋势和离散程度。
推论性统计
通过假设检验、方差分析等方法，推断样本数据所代表的总体特征， 评估不同处理组之间的差异显著性。
多元统计分析
运用主成分分析、聚类分析、判别分析等方法，挖掘数据间的内在 联系和规律，简化数据结构。
研究动物在长时间内暴露于低 剂量毒物后的毒性反应和潜在 危害。
方法
通常将动物长期暴露于低剂量 毒物，观察生长、发育、繁殖 和器官损害等指标。
应用
用于评估毒物的慢性毒性，了 解毒物对机体的长期影响，如 致癌、致畸、致突变等。
致癌性实验
目的
应用
研究动物在长时间内暴露于毒物后是 否诱发肿瘤。
用于评估毒物的致癌性，为环境毒理 学和公共卫生领域提供重要依据。
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分子生物学实验方法
基因毒性实验
02
01
03
单细胞凝胶电泳（彗星实验）
检测DNA链断裂，评估遗传物质损伤。
基因突变实验
通过观察基因突变频率，评估化学物质的致突变性。
报告基因实验
利用报告基因的表达变化，间接反映目标基因毒性。
蛋白表达实验
生态毒理学
生态毒理学实验实验一动物试验的一般操作技术一、目的与要求毒理学的许多试验研究，主要通过动物实验来进行。
而实验过程中技术及生物材料的收集是否恰当，直接影响实验结果的质量。
因此，毒理学实验工作者必须正确地掌握动物实验中的一般操作技术，这是保证试验工作成功的基本条件之一。
本实验要求掌握动物的捉拿、固定、麻醉、编号、采血、处死方法和解剖检查。
二、实验内容和方法（一）实验动物的捉拿和固定方法1、小鼠：捉拿时先用右手将鼠尾抓住提起，放在较粗糙的台面或鼠笼上，在其向前爬行时，右手向后拉尾，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和头颈部皮肤，将其固定于左手手心中，拉直四肢并用左手无名指压紧尾和后肢，右手即可作注射或其他实验操作。
取尾血及尾静脉注射时，可将小鼠固定在金属或木制的固定器上。
2、大鼠：大鼠抓取方法基本同小鼠，抓大鼠时若操作者不熟练，或者大鼠特别凶猛，操作者最好戴上防护手套(帆布或硬皮质均可)。
如若是灌胃、腹腔注射、肌肉和皮下注射时，可采用与小鼠相同的手法，即拇、食指捏住鼠的耳朵及头颈皮肤，余下三指紧捏住背部皮肤，置于掌心中，调整大鼠在手中的姿势后即可操作。
3、豚鼠：豚鼠性情温和，胆小易惊，一般不易伤人，抓取时，先用手掌扣住豚鼠背部，抓住其肩胛上方，拇、食指环握颈部，另一只手托住臀部。
如果在实验时豚鼠频繁挣扎，不宜采用此方法，因为操作者的拇、食指会随动物的挣扎越抓越紧而引起豚鼠窒息。
另外，有时可用纱布将豚鼠头部轻轻盖住，操作人员轻扶住其背部或者让其头部钻到实验人员的臂下，然后进行实验操作。
4、家兔：一手抓住兔颈部的被毛与皮肤，另一手托其臀部或腹部，使其躯干的重量大部分集中在手上。
(二)实验动物的编号、标记和去毛方法1、编号和标记方法：在动物实验中，为了使实验动物个体间或组间区别开来，便于对每个实验动物的反应情况进行观察，必须对实验动物进行编号、标记。
标记的方法很多，但基本原则是：号码清楚、耐久、简便、易认和适用。
生态毒理学实验
生态毒理学实验实验一血清乳酸脱氢酶活性的测定一、实验目的熟悉小鼠的采血方法，学会乳酸脱氢酶活性的测定，理解该酶含量变化的意义。
二、实验原理乳酸脱氢酶(LDH，EC．l．1．27)在以辅酶Ⅰ（NAD+）为氢受体的情况下，催化L一乳酸氧化成丙酮酸（对D一乳酸不起作用）。
LDH存在于各种组织的细胞浆中，其活力约为血清的500倍。
组织细胞膜经损伤，血清LDH即见增高，因此可以用LDH作为衡量细胞膜通透性的指标。
本实验采用比色测定法：以NAD＋为氢受体，LDH催化乳酸脱氢生成丙酮酸，丙酮酸与2，4一二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，该物质在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度呈正比，据此计算LDH活性单位。
三、材料及试剂1．实验动物体重18－20 g的健康小鼠40只，随机分为5组，每组8只，1组为阴性对照，一组为阳性对照组，另3组为不同剂量染毒组。
2．器材注射器、手术剪、镊子、移液管、吸耳球、试管、试管架、恒温水浴锅等。
3．试剂（1）乳酸钠底物缓冲液（pH 10.0）：取乳酸钠溶液（65％－75％）10mL，加入0．lmol ／L甘氨酸溶液125mL、0.l mo/L氢氧化钠溶液75mL，混合。
0.1mol/L甘氨酸溶液：称取甘氨酸1.501g，氯化钠二1.17 g，用双蒸水溶解并定容到200 mL。
（2）辅酶Ⅰ溶液(11.3mmol/L)：称取氧化型辅酶Ⅰ15mg（如含量为70％，则称取2I．4 mg），溶于2 mL双蒸水中，4℃保存，至少可用2周。
（3）2，4一二硝基苯肼溶液（1mmol/L）：称取2，4一二硝基苯肼200mg，加4 mol ／L盐酸250 mL，加水约600 mL，加热助溶，冷却后加水至1000 mL。
（4）0.4mol／L氢氧化钠溶液100mL。
（5）丙酮酸标准液（1mmol/L）：准确称取AR级丙酮酸钠11mg，以乳酸钠底物缓冲液溶解并定容到100 mL，临用前现配。
（6）受试化合物溶液：由指导教师根据本实验室情况自定。
生态毒理学 第3章
(1)绝对致死剂量（LD100） 指能引起所观察个体
全部死亡的最低剂量， 或在实验中可引起实 验动物全部死亡的最 低剂量。
最大耐受剂量（MTD）
绝对致死剂量（LD100） 半数致死剂量（LD50） 最小致死剂量（MLD） 最大耐受剂量（MTD）
(2)半数致死剂量和半数致死浓度
半数致死剂量（LD50）又称致 死中量，指引起一群个体50%死亡 所需剂量。
半数致死浓度（LC50），即引 起一群个体50%死亡所需的浓度。 一般以mg/m3空气和mg/L水来表示。
绝对致死剂量（LD100） 半数致死剂量（LD50） 最小致死剂量（MLD）
(3)最小致死剂量
最小致死剂量（MLD,LDmin 或LD01）指在一群个体中仅引起 个别死亡的最低剂量。低于此 剂量即不能使个体死亡。
危害性(hazard)的意义与危险度相似，但缺乏定 量概念，未考虑机体可能接触的剂量和损害程度，一 般指化学物对机体产生危害的可能性。
（五）剂量
剂量（dose）是指给予机体的或机体接触的外源化 学物的数量。
剂量的单位通常是以单位体质量接触的外源化学物 数量[mg/kg （体质量）]或机体生存环境中的浓度 [mg/m3 （空气） ，mg/L(水)]表示。
3．最小有作用剂量（MEL） 4．最大无作用剂量（MNEL） 5．急性毒作用带(Zac)
半数效应剂量(ED50) 指外 源化学物在一定的时间内按 一定的方式与机体接触，引 起机体某项生物效应发生50% 改变所需的剂量。
半数致死浓度（LC50）， 即引起一群个体50%死亡所 需的浓度。一般以mg/m3 (空 气)和mg/L(水)来表示。
4．最大无作用剂量
1．致死剂量（Lethal dose，LD） 2．半数效应剂量（ED50） 3．最小有作用剂量（MEL）
《生态毒理学》课件
生态风险评估包括问题识别、风险特征描述、暴露评估、效应评估和风险决策等 步骤。
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生态风险评估的案例分析
实际案例分析将帮助我们理解和应用生态风险评估方法。
第六部分：环境毒理学应用
生物监测
生物监测通过对生物体的 观察和测量，评估环境中 化学物质的存在和生物暴 露的潜在危害。
生态毒理学对环境保 护的重要性
污染物的生物转化
污染物在生物体内发生代谢和 转化，可能产生更有毒的代谢 产物。
污染物的生物毒性
污染物对生物体产生有害的生 理和行为效应，可能导致生物 的生存和繁殖能力受损。
第五部分：生态风定活动或污染物对生态系统和生物体造成的潜在危害程度。
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生态风险评估的步骤
生态质量评价的方 法
生态质量评价通常通过监测 和评估生态系统的结构、功 能和物质的状态来进行。
生态风险评价
生态风险评价是一种评估特 定化学物质对生态系统和生 物体的潜在危害程度的方法。
第四部分：污染物的生物学效应
污染物的生物累积
污染物在生物体内积累，可能 导致生态系统的不稳定和生物 多样性的下降。
《生态毒理学》PPT课件
欢迎来到《生态毒理学》PPT课件！本课程将带你深入了解生态毒理学的基 本概念、毒性评价方法、生态风险评估以及生态毒理学在环境保护中的应用。
第一部分：概述
什么是生态毒理学
生态毒理学研究生物与环境之间相互作用的 科学领域，关注物质对生态系统和生物体的 影响。
生态毒理学的重要性
生态毒理学有助于评估和管理环境中的化学 物质对生物体和生态系统的潜在危害。
第二部分：毒理学基础知识
1 毒性的定义
毒性是指化学物质对生 物体产生的有害效应。
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③人体观察（临床观察）中毒、事故、意外 等 ④流行病学研究：研究疾病的分布，探讨病 因，采取措施。
不同阶段的毒理学试验项目
第一阶段----急性毒性试验和局部毒性试 验
第二阶段----重复剂量毒性试验、遗传毒 性试验与发育毒性试验
3. 实验观察指标选择：
实验指标（观测指标）是指在实验观察中用于反 映研究对象中某些可被检测仪器或研究者感知的 特征或现象标志。 实验指标选择的基本条件： （1）特异性 （2）客观性 （3）灵敏度 （4）精确度 （5）可行性 （6）认可性
实验指标选择依据通常有： （1）根据实验的目的、任务和内容选择指标。 （2）根据化学物的种类和用途来选择国家标准、 部委和各级政府发布的法规、规定和行业规范 中相应的程序中的实验方法要求来选择指标。
3.成年的健康实验动物和人可能的暴露途径是 基本的选择
(1)成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物作 为一般人群的代表性实验模型。
幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作 为特殊情况另作研究。
(2)毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模 拟人接触该受试物的方式。
科研设计遵循的三原则
1.对照原则
➢对照的意义在于通过对照鉴别处理因素与非处理因 素的差异及处理因素的效应大小,消除和减少随机化 原则所不能控制的抽样误差及实验者操作熟练程度等 所造成的差异。 ➢在动物实验中，要求相比较的各组间动物的种类、 性别、年龄、体重等尽可能地一致。对照组与实验组 同等重要，两组的动物数应相等。 ➢毒理学实验中常用的对照形式有以下几种：
2.剂量-反应(效应)研究
Biological Response
FEL: Frank Effect Level
有直接显著影响值
最低可见有害作用水平
LOAEL: Lowest Observable Adverse Effect Level
最低可见作用水平
NOAEL:No Observable Adverse Effect Level
毒理学动物实验设计
外推
2.实验动物必须暴露于高剂量 是发现对人潜在危害的必需的和可靠的方法。
一般要设3个或3个以上剂量组，以观察剂 量-反应（效应）关系，确定受试化学物引起毒 效应及其毒性参数。
(1)毒性试验的设计并不是为了证明化学品的安 全性，而是为了表征化学品可能产生的毒作用。 (2)毒理学试验中实验模型所需的动物总是远少 于处于危险中的人群。为了在少量动物得到有 统计学意义的可靠的结果，需要应用相对较高 的剂量，以使效应发生的频率足以被检测。
未观察到损害作用水平
LOEL: Lowest Observable Effect Level
NOEL: No Observable Effect Level
Log[Dose] 无可见作用剂量水平
3.确定毒作用的靶器官
4.确定损害的可逆性 5.其它 ➢毒作用的敏感检测指标和生物学标志 ➢毒作用机制研究 ➢受试物的毒物动力学和代谢研究 ➢中毒的解救措施
个别组的比较 非均匀性 与剂量相关的趋势 个别组的比较 非均匀性 与剂量相关的趋势 变量间的相关性
三、毒理学动物实验设计内容
1.实验动物选择：原则： A.对化合物毒性反应与人接近的动物 B.易于饲养管理 C.操作方便 D.易于获得，品系纯化，价格低廉
2. 实验动物分组与剂量选择、实验期限：
Biological Response
高剂量组 中剂量组：LOAEL 低剂量组：NOAEL
Log[Dose]
(4)自身对照：对照与实验在同一受试者身上进行，如同一个体左 右部位的对比，给药前后的对比，先给甲药后给乙药的对比等 方式。若采用给药前后的对比，总是将用药前作为对照，这实 质上也是一种空白对照。 严格地说，还需要单独设立一个对照 组， 比较实验组与对照组处理前后的效应差值 。
2.重复原则
(1)足够的实验样本数： (2)实验结果的可重复性。
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第三章
毒理学试验
一、毒理学毒性评价试验的原则
毒理学实验通常是毒性评价或安全性评价试验， 通常由权威机构规定评价程序。
在描述毒理学的试验中，有三个基本的原则: 1.外来化学物在实验动物产生的作用，可以 外推于人。 基本假设为： ①人是最敏感的动物物种； ②人和实验动物的生物学过程包括化学物的 代谢，与体重（或体表面积）相关。
3.随机原则
为了减少个体差异这种非处理因素的干拢，应 于实验前将实验动物依统计学原则进行随机分组， 以此达到尽可能降低非处理因素的混杂效应，从 而提高每组动物间均衡性的目的。 随机分组方法： ①随机数字表法； ②计算机软件（如SPSS、SAS、Excel等）方法 。
毒理学的研究方法
①体内试验 也称为整体动物实验，整体研 究动物外推到人
4. 统计学处理方法：
表2 IPCS专家组推荐的统计学分析方法
数据类别和统计学要求 1．“有或无”数据： 动物间的比较
个别组的比较
动物内部比较 2．分级数据： 动物间的比较 动物内部的比较
3．连续数据： 动物间的比较 动物内部比较 变量间的相关性
非均匀性 与剂量相关的趋势 个别组的比较 非均匀性 变量问的相关性
第三阶段----亚慢性毒性试验、生殖毒性 试验和毒动学试验
第四阶段-目的
1.受试物毒作用的表现和性质 在急性和慢性毒性试验中，观察受试物对 机体的有害作用，对有害作用的观察应该是对 每个实验动物进行全面的、逐项的观察和记录。 发现有害作用是进行剂量-反应(效应)研究的前 提。
(1)空白对照：又称正常对照对照组不加任何处理因素，即处理因 素完全空白。
(2)标准对照：指在所谓标准条件下进行观察的对照。如抗结核病 的新药试验，应以链霉素和异烟肼为标准对照药物，且不可用 降低标准对照的办法来提高试验效应 。
(3)阳性对照：毒理学研究中的三致试验( 致突变试验、致癌试验 和致畸试验)，除常规设立空白对照 (阴性对照)外尚需同时设 立阳性对照，即使用必定出现阳性结果阳性受试物(如环磷酰 胺)，以判断该试验方法是否成功。若阳性对照没有出现阳性 结果，则说明该试验是失败的。