细胞毒理学实验技术-MTT
MTT原理方法及操作步骤
MTT原理方法及操作步骤MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种常用的细胞增殖测定试剂，用于定量测定细胞的存活情况。
MTT的工作原理：MTT原理是基于还原型特种金属试剂Florida Cyanide。
MTT可进入细胞内部，被活细胞内的膜连蛋白酶还原为水溶性紫色化合物，甲基化噻唑胺盐（formazan）。
甲基化噻唑胺盐可溶于有机溶剂如DMSO或乙醇。
MTT的量越多，被还原为甲基化噻唑胺盐越多，即细胞活性越高。
MTT的操作步骤：1.预处理细胞将需要检测细胞的培养基倒入培养皿中，将获得的细胞悬液加入培养基中，根据实验要求进行设定浓度和培养时间。
2.处理试剂根据常规的MTT工作浓度（通常为0.5 mg/ml），将MTT试剂精确称取并溶解在无菌的溶剂（例如PBS）中。
3.细胞处理将培养中的细胞培养液抽取约100μl至新的96孔板孔中，并注意控制每个孔中细胞数相同时的培养基体积。
4.加入MTT试剂将所制备的MTT溶液以100μl的体积的溶液加入到培养细胞上，并尽量在操作中迅速搅拌均匀，以使MTT均匀分布。
5.细胞孔板孔的处理将MTT试剂添加到孔中后，覆盖板密封（如用保鲜膜密封）。
然后将培养皿放入暗处，37°C培养孔中的细胞进行inculbation与MTT碳酸酯酶的反应。
通常培养12至24小时，可以根据具体实验情况延长培养时间。
6.细胞孔中溶解甲基化噻唑胺盐将培养平皿中的培养液取出约50μl，悬浮溶解掉的甲基化噻唑胺盐，再加入200μlDMSO混合均匀。
7.测定吸光度将孔中的溶液分别转移到透明壁的96孔板，并使用微孔板阅读装置（Multiskan Spectrum）在570 nm波长下测定吸光度。
DMSO溶液作为空白参照，用作光强的基准。
8.数据分析根据检测吸光度得到的数据，计算出每个孔的平均值，并根据实验要求，进行数据图表分析。
总结：MTT法是一种可靠、灵敏、简单、可重复性好的细胞增殖测定方法。
MTT原理及实验方法
MTT原理及实验方法MTT（细胞代谢试剂）是一种用于测量和研究细胞分裂和代谢活性的化学试剂。
该试剂的工作原理基于细胞的代谢能力，其将细胞内的黄色水溶性四甲基偶氮唑盐（MTT盐）氧化为紫色的可溶性形式，从而通过测量溶解形式的MTT的光密度来反映细胞代谢活性水平。
以下将详细介绍MTT原理及实验方法。
MTT试剂的原理：1.MTT溶解：MTT试剂在组织培养试验中被混合到细胞培养物中。
MTT盐会被细胞内的还原酶还原成紫色的可溶性形式（MTT甲醇溶液）。
2.MTT测定：MTT溶液可以通过酶法分解成无色的N-甲基四唑（NMTT）形式，在MTT试剂中的抗氧化剂溶液（如二甲基亚砷酸钠）将MTT还原成紫色可溶性形式。
MTT还原后的紫色可溶性形式可以通过测量其吸光度来间接反映细胞的代谢活性水平。
MTT实验方法：1.细胞培养：选择需要研究的细胞系，将细胞培养在含有适当培养基和温度、湿度、氧气浓度适宜的培养箱中，培养至细胞数量和生长状态适宜的阶段。
2.细胞处理：将细胞均匀分布到培养皿中，并根据具体实验目的进行适当的处理，如添加药物、感染病毒等。
3.MTT处理：将MTT试剂溶解于无菌磷缓冲盐溶液（PBS）中，并将其加入到培养皿中，使其与细胞充分接触。
4.培养皿反应：将培养皿置于37摄氏度的培养箱中，使MTT试剂与细胞反应，在一定的时间内进行颜色的转换。
5.溶解MTT产物：培养皿中的介质和化合物被抽去，用洗涤缓冲溶液洗涤细胞两次，然后加入甲醇或异丙醇等溶剂来溶解产物。
6.吸光度测量：将培养皿中的溶液转移到96孔板（一般用96孔板可实现高通量），并使用微孔板读数器在570纳米波长下读取吸光度。
此时，高吸光度表示细胞代谢活性较高，低吸光度则表示较低。
MTT实验的注意事项：2.实验时间的选择：根据细胞系的不同，具体实验时间的选择可能不同。
一般来说，选择较长的实验时间可以更好地反映细胞的代谢活性水平。
3.细胞处理剂量：根据具体实验目的，选择适当的处理剂量和培养时间。
MTT实验操作步骤
MTT的操作方法一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethy lthiah iazo (-z-y1)-3,5-di- phenyte trazoliumrom ide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性M TT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formaza n）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MT T的包装为100mg,250mg或1g1.1对于100m g这样的小包装，厂家都是将MT T放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPB S来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20mlPBS，从中先吸取500-1000u lPBS装入含M TT的小管中，吹打若干次后将其移入50m l离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的M TT不残留于管内。
MTT法测细胞毒性
MTT法测细胞毒性试剂MTT溶液四甲基偶氮唑盐（MTT）溶于PH7.2的磷酸盐缓冲液中，浓度为5mg/ml，除菌后2ml分装，于4℃避光保存。
含10%SDS的0.01M HCl SDS 10g浓HCl（36%）86.2 ul定容至100ml，过滤除菌方法1.将SP2/0细胞计数，调节细胞数至105/ml，制备10ml细胞悬液，加入96孔板，100ul/孔，即细胞数104/孔。
空白孔不加细胞悬液。
,37℃条件下培养24小时。
2.5%CO23.每孔加入用含5%血清的DMEM 10倍系列稀释的毒素100ul。
阴性对照孔不加毒素。
,37℃条件下培养72小时。
4.5%CO25.吸除药液120 ul, 每孔加入新鲜配制的MTT溶液20ul,即终浓度为1mg/ml，37℃条件下培养4小时。
6.吸去上清50 ul，每孔加入150 ul含10%SDS的0.01M HCl溶液，震荡30分钟。
7.酶标仪上测定A570。
8.计算细胞死亡率：细胞死亡率（%）=（1-实验组A570/对照组A570）×100%注意1．细胞数范围：（0.5~2）×104。
2．MTT终浓度为0.5~2.5mg/ml，但一般浓度在0.5~1mg/ml就可以获得满意的结果。
3．加入MTT后，37℃条件下培养4~6小时。
4．设置空白与对照空白孔：——+——+MTT+有机溶剂对照孔：细胞+——+MTT+有机溶剂5．DMSO易结冰（其溶点为18~20℃），室温偏低的条件下影响甲肷的溶解，使检测的光吸收值降低，且有机溶剂溶解的时间不能过长，如10分钟就可以获得结果。
用SDS作溶剂可使所测光吸收值数日不变。
mtt检测原理
mtt检测原理MTT检测原理MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）是一种常用的细胞代谢活性检测试剂，被广泛应用于生物医学研究中。
本文将介绍MTT检测的原理和应用。
一、MTT检测原理MTT检测原理是基于细胞代谢活性的变化而设计的一种细胞毒性测定方法。
MTT是一种黄色的晶体，可通过细胞内还原酶的作用而转化为紫色的结晶体形式。
这种还原酶主要是细胞内的线粒体呼吸链中的NAD(P)H脱氢酶。
MTT的转化过程主要包括以下几个步骤：1. 细胞摄取MTT：MTT溶液添加到细胞培养基中，进入细胞内。
2. 还原酶作用：细胞内的还原酶将MTT还原为紫色的结晶体。
3. 结晶体形成：紫色结晶体沉积在细胞内部的线粒体中。
4. 结晶体溶解：细胞溶解液（如DMSO）加入，将结晶体溶解。
5. 检测吸光度：通过读取样品的吸光度，可间接判断细胞的代谢活性。
二、MTT检测的应用MTT检测广泛用于细胞毒性和细胞增殖活性的研究中，可应用于药物筛选、毒理学评价、细胞增殖和细胞凋亡等方面。
1. 药物筛选：MTT检测可用于评估药物对细胞的毒性作用。
通过给予不同浓度的药物处理细胞，再进行MTT检测，可以确定药物的毒性效应和半数致死浓度（IC50）。
2. 细胞增殖：MTT检测也可用于评估细胞的增殖活性。
细胞在不同处理下，如药物刺激、基因敲除等，通过MTT检测细胞的活性变化，从而研究细胞增殖的调控机制。
3. 细胞凋亡：MTT检测可用于评估细胞凋亡的程度。
凋亡细胞的代谢活性降低，通过MTT检测细胞的吸光度变化，可以间接判断细胞凋亡的程度。
4. 毒理学评价：MTT检测可用于评估化学物质对细胞的毒性作用。
通过给予不同浓度的化学物质处理细胞，再进行MTT检测，可以确定化学物质的毒性效应和半数致死浓度（IC50）。
5. 细胞代谢活性研究：通过MTT检测细胞的代谢活性变化，可以研究细胞代谢的调控机制，如细胞内能量代谢的变化等。
MTT实验原理步骤注意事项
MTT实验原理步骤注意事项MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）实验是一种间接法测定细胞的代谢活性的方法。
MTT是一种黄色的溶液，在细胞内会被活细胞的线粒体内还原为紫色的结晶形式。
这些紫色结晶通过一定的溶解步骤转变为紫色的溶液，并使用酶标仪测量其吸光度。
吸光度的变化可以反映细胞的增殖和活性水平，从而评估药物或物质的细胞毒性。
1.细胞培养：选择需要研究的细胞株，并使用细胞培养基将其培养至对数生长期。
2.细胞接种：将对数生长期的细胞用细胞培养基洗涤，获得单细胞悬浮液，并在96孔板中接种相应的细胞密度。
3.处理药物：根据实验需求，选择适当浓度的药物或化合物，并将其加入每个孔中。
4.处理时间：根据需求和实验目的，将药物处理时间设定为不同的时间段。
5.加入MTT溶液：在处理药物和处理时间后，将MTT溶液加入每个孔中，并使其充分与细胞接触。
6.溶解晶体：处理一段时间后，将培养基和MTT溶液完全吸取，然后添加溶解晶体溶液，使晶体溶解。
7.检测吸光度：待溶解晶体完全溶解后，使用酶标仪测量每个孔的吸光度，并将结果记录下来。
8.数据分析：根据吸光度的变化，可以计算得到药物对细胞的毒性，评估药物或物质的效果。
1.培养条件：选择合适的细胞培养基和培养条件，确保细胞能够保持良好的生长状态。
2.细胞密度：将细胞密度恰当控制在合适范围内，避免过度或不足，影响实验结果。
3.药物浓度：选择适当的药物浓度范围，避免浓度过高或过低，影响实验的结果。
4.处理时间：根据需求和实验目的，选择合适的处理时间，使药物对细胞产生明显的影响。
5.溶解晶体溶液：使用溶解晶体溶液时，要充分搅拌使晶体完全溶解，避免气泡产生。
6.数据分析：对实验结果进行正确的数据分析，根据实验的目的和要求进行合理解读。
总结：MTT实验通过将MTT溶液与细胞相互作用，最终通过吸光度的变化来评估药物或物质的细胞毒性。
mtt实验报告
mtt实验报告MTT实验报告引言：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种广泛应用于生物学实验中的化合物。
它具有一种特殊的性质，即可以通过还原型脱氢酶酶促反应，将Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide（MTT）还原为可溶性的紫色产物。
这一反应可以用来评估细胞的代谢活性和细胞存活率。
本实验旨在分析MTT实验的原理、操作步骤以及结果解读，并探讨其在生物学研究中的应用。
一、实验原理：MTT实验的原理基于细胞的代谢活性。
MTT溶液在细胞内被还原为可溶性的紫色产物，其浓度与细胞代谢活性成正比。
通过测量产物的吸光度，可以评估细胞的存活率和细胞毒性。
二、实验步骤：1. 细胞预处理：将需要研究的细胞培养在含有适当培养基的培养皿中，并在恒温恒湿的培养箱中孵育至细胞黏附于培养皿底部。
2. 添加MTT溶液：将MTT溶液加入培养皿中，使其与细胞接触。
MTT溶液的浓度和作用时间可以根据实验需要进行调整。
3. 细胞溶解：将MTT溶液去除，加入溶解剂（如DMSO）溶解细胞内的紫色产物。
4. 吸光度测量：将溶解后的细胞溶液转移到96孔板中，使用酶标仪测量吸光度。
吸光度越高，代表细胞的存活率越高。
三、结果解读：MTT实验的结果通常以吸光度值表示。
通过比较实验组与对照组的吸光度值，可以得出以下结论：1. 细胞存活率：实验组与对照组吸光度值的比较可以反映细胞的存活率。
如果实验组的吸光度值较高，说明细胞存活率较高；反之，说明细胞存活率较低。
2. 细胞毒性：若实验组的吸光度值明显低于对照组，说明实验物质对细胞产生了毒性作用。
3. 药物筛选：MTT实验可以用于药物的筛选。
通过比较不同药物处理组的吸光度值，可以评估药物的效果和毒性。
四、MTT实验的应用：1. 细胞增殖和生长研究：MTT实验可以用于评估细胞的增殖和生长情况，对于研究细胞周期和细胞增殖相关的疾病具有重要意义。
mtt试验原理
mtt试验原理MTT试验原理MTT试验是一种常用的细胞毒性测试方法，被广泛应用于药物筛选、毒性评估、细胞生物学研究等领域。
本文将介绍MTT试验的原理及其在科学研究中的应用。
MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）试验是一种通过测量细胞线粒体脱氢酶活性来评估细胞代谢活性的方法。
MTT试剂会在细胞内还原为可溶性的紫色产物，通过比色法测定其吸光度，可以间接反映细胞的存活水平。
MTT试验的原理如下：首先，将需要测试的细胞接种在培养基中，使其在恰当的条件下生长繁殖。
然后，将待测物添加到细胞培养物中，不同浓度的待测物可以评估其对细胞的毒性作用。
接下来，在特定的时间点，加入MTT试剂到培养物中，允许其在细胞内转化为紫色产物。
最后，通过溶解细胞并测定溶液的吸光度，可以计算出细胞的存活率。
MTT试验的优势在于其简单、快速、经济，并且可以同时测试多个样品。
通过MTT试验，可以评估药物的毒性、筛选抗肿瘤药物、研究细胞增殖和凋亡等生物学过程。
此外，MTT试验还可以与其他实验方法相结合，如细胞周期分析、细胞迁移实验等，从不同角度全面评估细胞的生理状态。
MTT试验的结果常用半数抑制浓度（IC50）来表示药物的毒性。
IC50值是指药物对细胞生长的抑制作用达到50%所需的浓度。
通过比较不同药物的IC50值，可以评估它们的毒性大小，并选择具有较低毒性的药物进行进一步研究。
然而，MTT试验也存在一些局限性。
首先，MTT试验只能反映细胞的存活水平，无法提供关于细胞死亡机制的详细信息。
其次，MTT 试验对于某些药物或化合物可能存在误差，因此需要结合其他实验方法进行验证。
MTT试验是一种简单快速的细胞毒性测试方法，被广泛应用于药物筛选和细胞生物学研究中。
通过测定细胞存活率，可以评估药物的毒性作用，并为进一步研究提供重要参考。
然而，我们也要意识到MTT试验的局限性，并结合其他实验方法进行综合评估。
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DMSO需要避光加入，加入前将孔内液体吸除干 净，注意不要把结晶吸除
铺细胞一定要均匀，减小实验误差
③ MTT实验应用
大规模抗肿瘤 药物及其适宜 浓度的筛选
体外肿瘤细胞 的临床药物敏 感性实验
检测细胞活 性、细胞增殖 力和细胞毒性
生物活性因子 的活性检测、 肿瘤放射敏感 性测定等
因死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原，故成为验材料
MTT溶液 (PBS溶解，5mg/ml。小剂量分装，4℃避光保存，两周内有效。或-20 摄氏度冻存，避免反复冻融)、DMSO
需测定的细胞、中 高 低浓度药物 酶标仪、超净台、显微镜 培养皿、离心管、96孔板、细胞计数板、移液枪等
② 实验方法
接种细胞
培养细胞
呈色
比色
消化细胞，用细胞计数板计数， 调整细胞浓度至104个/ml，接种 至96孔板100μl/孔
A
培养24h后，吸除孔内原培养液， 加入培养液配置的不同浓度药物， 每孔100μl(空白组不做处理)
B
药物反应完成后，配制MTT(培养 液:MTT=5:1)并加入，反应4h
THANK YOU!
感谢聆听
细胞毒理学实验技术
MTT法检测细胞活性
报告人：
CONTENTS
1 实验原理 2 实验材料与方法 3 实验结果与分析 4 实验应用
① 实验原理
• MTT是一种黄色粉末状化学试剂 • 商品名为：噻唑蓝 • 全称为：3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide
MTT是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥 珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下被还原，生成蓝色的甲瓒(formazan)结晶，结 晶的生成量仅与活细胞数目成正比。还原生成的结晶可在二甲基亚砜(DMSO) 中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。 OD值越大细胞活性越强(或药物毒性越小)。
C
吸除MTT后避光加入DMSO 100μl/孔，震荡10min，酶标 仪490nm波长测定OD值
D
③ 实验结果与分析
• 将实验数据拷贝至EXCEL并整理
• 计算细胞存活率(各组值/空白组平均值*100%)
• 使用GraphPad Prism 统计数据并分析
实验注意事项
MTT有致癌性，使用时注意做好防护措施，最好使用 透明一次性乳胶手套