酶联免疫法测定蜂蜜中氯霉素残留量(二)
动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定
动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定
动物源性食品中氯霉素类药物残留的测定是一项重要的检测工作，这些药物残留的存在可能对人体健康产生一定的危害。
准确、快速地检测这些残留物的含量是非常必要的。
氯霉素类药物是一种广谱抗生素，常用于预防和治疗动物的感染病。
如果动物在屠宰前一段时间内使用了这些药物，残留物可能会在食品中存在。
对于人类来说，摄入这些残留物可能会引起过敏反应、中毒甚至诱发耐药菌株。
第一种是高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）。
该方法具有快速、准确、灵敏、选择性高等特点。
将样品进行提取，利用有机溶剂将残留物从食品中分离出来。
然后，使用HPLC将残留物进行分离，并通过串联质谱进行定性和定量分析。
该方法可以同时测定多种氯霉素类药物的残留，且可以达到非常低的检测限。
第二种是酶联免疫吸附测定法（ELISA）。
该方法是通过抗体与药物残留物结合来进行检测的。
将样品中的残留物与标记有酶的抗体结合，在搅拌的条件下进行反应。
然后，通过酶标仪检测残留物与酶的结合程度，从而确定残留物的含量。
由于该方法操作简便、快速，且具有较高的灵敏度和选择性，因此广泛应用于动物源性食品中氯霉素类药物残留的测定中。
测定动物源性食品中氯霉素类药物残留的方法有很多种，每种方法都有其优缺点。
在具体实验中，需要根据实际需要选择合适的方法进行测定，以确保结果的准确性和可靠性。
蜂蜜中的氯霉素的测定
蜂蜜中的氯霉素的测定方法：SPE基质：蜂制品应用编号：101238化合物：氯霉素固定相：ProElut PLS色谱柱/前处理小柱：ProElut PLS 60mg / 3ml 50/pkg商品编号：68003样品前处理：1、提取称取10 g 蜂蜜于50 mL 离心管中，加入10 mL 水，于涡旋混合器上混合3 min，待样品完全溶解后加入20 mL 乙酸乙酯，高速涡旋混合5 min，3000rpm 下离心5 min，上层溶液转入100 mL 烧瓶中。
下层溶液再加入20 mL 乙酸乙酯，高速涡旋混合5 min，3000 rpm 下离心5 min，合并两次上层液于同一烧瓶中，减压浓缩至干，用3×1 mL 20% 的甲醇水溶液溶解残渣，待净化。
2、净化a 活化：依次用3 mL 甲醇和3 mL 水活化ProElut PLS 60 mg/3 mL (Cat.#68003)，流出液弃去；b 上样：将待净化的样品液加入柱中，流出液弃去；c 淋洗：用3 mL 20% 甲醇水溶液淋洗，淋洗液弃去，并将PLS 柱抽干；d 洗脱：用3 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液；e 重新溶解：在40 ºC 下用氮气将洗脱液吹至近干，然后用1 mL 40% 甲醇水溶液定容，供HPLC 分析色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18(2) 250 x 4.6 mm ID, 5 μm (Cat. #99603) HPLC应用101320作者：迪马科技文章出处：P109关键字：蜂蜜，氯霉素，SPE，ProElut PLS 摘要：适用于蜂蜜中氯霉素的测定。
图例： 1. 氯霉素。
WB02 蜂蜜中氯霉素残留快速检测背景知识概要
农产品与食品质量检测技术教学资源库
蜂蜜中氯霉素残留快速检测背景知识
1蜂蜜定义按世界卫生组织（WHO)和联合国粮农组织（FAO)所属的食品法典委员会（CAC)所下的定义：
蜂蜜是蜜蜂从活的植物蜜腺或其他部位采来的花蜜，经蜜蜂充分酿制、储存于巢房的甜蜜物质。
这个定义从蜂蜜的来源、蜂蜜的成熟过程和蜂蜜成品的性质来规定蜂蜜的含义：一是蜂蜜的来源系植物蜜腺的花蜜，也包括甘露蜜，但不包括味糖而产生的“糖蜜”；二是蜂蜜的成熟过程系蜜蜂经过酿制储存在蜂巢内，蜜蜂刚采集的花蜜不是蜂蜜，未成熟的也不是蜂蜜；三是蜂蜜成品系一种具有甜味的物质。
从这个定义可以看出，蜂蜜离不开蜜蜂、植物和蜜蜂的酿造，离开这几个条件就不能算是蜂蜜，所以蜂蜜是无法人造的。
2为什么蜂蜜中会含有氯霉素？
蜜蜂容易感染一种细菌从而产生“幼虫腐烂病”，这种病对蜂产业危害极大，可能导致整个蜂群死亡，而且这种细菌很难完全清除，需要不断处理。
氯霉素是一种强力抗生素，只允许作为药物用于人，而且只在其他手段都无效的情况下使用。
有的蜂场用它来处理蜂房控制幼虫腐烂病，就可能导致蜂蜜中检出氯霉素。
3氯霉素对人体有哪些影响？
氯霉素作为抗生素很高效，但是它可能带来严重的副作用。
有的人对它很敏感，只需要摄入很少的量，就能对骨髓造成伤害，不能产生足够的红细胞、白血细胞或血小板，也就是再生障碍性贫血。
动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定
动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定氯霉素是一种广泛使用的广谱抗菌药物，被用于治疗多种细菌感染症。
然而，由于氯霉素残留可能对人体健康造成潜在危害，因此在食品中残留的限制值被严格规定。
本文介绍了动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定方法。
1. 氯霉素残留的危害氯霉素对人体健康的潜在危害主要表现在以下几个方面：（1）引起过敏反应。
氯霉素过敏反应的发生率较高，可能表现为皮疹、荨麻疹等过敏症状，严重者可发生过敏性休克。
（2）影响肝、肾功能。
氯霉素在人体内主要经肝脏和肾脏代谢，残留较高可导致肝、肾功能受损。
（3）导致骨髓抑制。
氯霉素可以抑制人体骨髓造血功能，导致贫血、白细胞减少等症状。
（4）产生耐药菌株。
过度使用氯霉素会导致细菌产生抗药性，从而增加人类感染疾病的难度。
2. 氯霉素类药物的种类（1）氯霉素（2）磺胺甲噁唑（5）酰胺类药物，如阿莫西林、青霉素等。
为了保证动物源性食品中氯霉素类药物残留不超过规定的限制值，需要对食品样品进行残留的测定。
下面介绍几种常见的测定方法。
（1）高效液相色谱法。
该方法具有灵敏度高、分离能力强等优势，是目前最常用的氯霉素类药物残留测定方法之一。
（2）液相色谱-质谱联用法。
该方法可以实现极低浓度的氯霉素类药物残留的灵敏检测，但设备价格较高，操作相对复杂。
（3）比色法。
该方法通过化学反应分析药物残留，具有快速简便的优势。
但由于其灵敏度较低，检测结果精确度较差。
（4）酶联免疫吸附法。
该方法基于药物与相关抗体的特异性结合，具有灵敏度高、快速等优点。
其缺点是对样品质量要求较高，且价格相对较贵。
4. 结论。
氯霉素类药残留测定——免疫分析法(一)
氯霉素类药残留测定——免疫分析法（一）(2)免疫分析法(immunoassay， IA) 基于抗原与抗体特异性反应的免疫分析技术，向来是兽药残留迅速检测和样品筛选办法的讨论热点。
CAPs的二氯酰胺醇和硝基苯结构与大分子蛋白结合后可作为彻低抗原，并有效制备相应的抗体。
从20世纪80年月后期开头，免疫法在众多的CAPs残留检测办法中进展快速。
免疫法主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、发射免疫分析法(RIA)、胶体金免疫层析法(GICT)、免疫传感器(IS)、荧光免疫分析法(FIA)等。
其中，用法最普遍的是ELISA办法。
1)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)ELISA作为筛选办法，样品处理容易，样品通量大，检测成本低，不需复杂仪器设备，与普通仪器办法相比，检测限更低，且挑选性高。
因此，ELISA办法在现场监控和日常大批量检测工作中有着广大的应用前景。
Campbell等于1984年领先报道了采纳竞争ELISA办法检测CAP残留。
采纳市售的酶联抗兔免疫球蛋白抗体和添加底物，样品中游离的CAP 和固定在固相上的CAP与特异性兔抗体竞争性结合，酶活性与样品中CAP的浓度成反比，用分光光度法测定。
囫囵分析过程小于24h。
该ELISA办法的定量范围在1～100ng/mL之间；对CAP和TAP具有交错反应。
何方洋等用重氮化办法将CAP与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联，制备免疫抗原和包被抗原，ELISA鉴定。
将偶联抗原用弗氏佐剂乳化后免疫兔子，制备多克隆抗体，沉淀法初步纯化，亲和层析法进一步纯化。
建立竞争ELISA法检测CAP，办法LOD为0.3ng/mL。
魏书林等利用活化酯法合成CAP抗原，作为免疫原免疫兔子得到CAP的单克隆抗体，建立了CAP间接竞争ELISA办法。
结果显示抗体效价可达1：640000，半数抑制剂浓度(IC50)为1.3ng/mL，LOD达到0.05ng/mL，线性检测范围为0.1～36.45ng/mL，在0.5ng/g、1ng/g、2.5ng/g、5ng/g添加浓度水平，鸡肌肉组织中的回收率为55.4%～119%。
蜂蜜中氯霉素的检测
蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法液相色谱—串联质谱法
新方法学考察报告
依据蜂蜜中氯霉素的测定方法液相色谱—串联质谱法进行以下实验：
1、标准曲线的建立：
精密量取氯霉素标准储备液中间液（0.1µg/ml）适量，用空白样品提取液配制成浓度为 0.5ng/ml、1.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml 的标准工作液，现配现用。
将标准工作液依次从低浓度到高浓度测定，每一浓度进样3针，按其所得峰面积与对应的对照溶液浓度作标准曲线，得出以下回归方程及相关系数（标准曲线图谱附后）。
表1 氯霉素的回归方程表
氯霉素的回归方程及相关系数表明：在0.5ng/ml～100.0ng/ml的浓度范围内呈现良好的线性关系。
2、回收率实验：
精密称定5g试样，置于50ml离心管中，添加氯霉素标准工作液使浓度为0.10µg/kg、0.20 µg/kg，按实验方法操作测得其回收率。
根据以上实验结果表明在所添加的浓度范围内的回收率为80%～110%，批内批间RSD值均<20％。
3、实验结论：
通过实验得出：按照液相色谱串联质谱法操作可以较好地将蜂蜜中的氯霉素药物提出，标准曲线呈现良好的线性关系，并且准确度、精密度均达到标准规定的要求，实验过程简单、可行，实验结果可靠。
蜂产品(蜂蜜、蜂王浆)药物残留快速检测指南
和导致食品残留，包括我国在内的许多国家对四环素类残留实施例行 监控。
2.4 氨基糖苷类（Aminoglycoside antibiotics,AGs） 链霉素（Streptomycin）和双氢链霉素(Dihydrostreptomycin)同属于 氨基糖苷类抗生素，均具有耳毒性和肾脏毒性，能损害脑神经、耳蜗 神经，对近端肾曲管有损害，造成血尿、肾功能衰退等。 2.5 喹诺酮类（Quinolones,QNs） 恩诺沙星（Enrofloxacin）和环丙沙星（Ciprofloxacin）属喹诺酮 类药物，能引起中枢神经系统不良反应，而且有潜在的致癌性和遗传 毒性，同时还容易使病菌产生耐药性。 2.6 有机磷农药（Organophosphorus Pesticide，OP） 有机磷农药多为高毒性、高残留，易造成水源、食品、农作物、 环境等污染，严重威害人体健康。人中毒后会出现头昏、头痛、恶心、 呕吐、腹痛、腹泻和呼吸困难等症状，重度者可出现肺水肿、昏迷、 呼吸衰竭、脑水肿。 2.7 其它药物 主要是种类繁多的杀虫剂，均对人体健康有不同程度的危害。
② 磺胺二甲基嘧啶检测项目： 灵敏度：10ppb； 特异性：与其他药物无交叉反应； 样品处理时间：10~20分钟； 检测时间：5分钟左右肉眼判断结果，10分钟后判断无效；
③ 四环素检测项目： 灵敏度：20ppb； 特异性：与其他药物无交叉反应； 样品处理时间：10~20分钟； 检测时间：5分钟左右肉眼判断结果，10分钟后判断无效；
④喹诺酮类检测项目： 灵敏度：2ppb； 特异性：与其他药物无交叉反应； 样品处理时间：10~20分钟； 检测时间：5分钟左右肉眼判断结果，10分钟后判断无效；
⑤链霉素检测项目： 灵敏度：20ppb 特异性：与其他药物无交叉反应； 样品处理时间：10~20分钟； 检测时间：5分钟左右肉眼判断结果，10分钟后判断无效；
定量ELISA法检测蜂蜜中氯霉素残留量研究
预防接种是一项充分利用社会各方面的资源所开展的一项有益于接种人群及社会的一项系统的工程,分析预防接种所带来的效益更有利于对我国卫生资源进行合理配置,以最小的成本投入以获得最大的收益。
(收稿日期:2004-01-10)定量ELISA法检测蜂蜜中氯霉素残留量研究刘1 高世同2 吴丽明2 黄薇2 林敏1 ①摘要 目的:检测深圳市市售蜂蜜中氯霉素的残留量,以掌握蜂蜜中氯霉素污染的情况。
方法:氯霉素定量酶联免疫检测法,利用抗体与抗原间免疫化学反应,酶标氯霉素结合体与样品检体中氯霉素残留物同时竞争固定在酶标孔的氯霉素抗体,待检体中氯霉素的含量愈高,显色反应愈浅,待检体中氯霉素的含量愈低,显色反应愈深。
结果:经检测46个国内不同地方生产的在深圳销售的蜂蜜样品,检出含有氯霉素的有13个样品,有33个样品未检出。
结论:此氯霉素残留量检测方法快速可靠、敏感性高、特异生强,对食品中氯霉素的筛查有重要的推广价值。
关键词 酶联免疫法 氯霉素 残留量 调查 蜂蜜中图分类号:TS207;X836;O657 文献标识码:A 文章编号:1001-9561(2004)03-0265-02Abstract Objective:T o detect Chloramphenicol residues in honey in S henzhen supermarket,and investgate contamination of Chloramphenicol res idues in food.M ethods:The qual itative CAP ELISA is based on the specific immuno-chemical reactions between antigen and antibody.It rel ies on the competition of CAP-HRPO conjugate are added into w ells,if the d rug is present in the sample,it w ill compete w ith the drug-H RPO conjugate to bind to the limited anount of antibody,which is innobil ized on the microtiter w ell.When a s ufficient amount of drug ispresent,the drug w ill satu rate the antibody.Thus the enzyme-substrate reaction w ill not generate and only light color shown,indicating a positive result.If there is a negative sampl e,it w ill generate deep color after the enzyme-s ubstrate reaction.Results:46honey sam ples comes from all over of C hina w ere investegaed,13sample show ed pos itive concentration,and the concentration is higher than FDA criterion concen-tration.Conclusion:Together w ith these results,competitive S LISA can detect CAP residues in sample,and show ed higher s enstivity and spe-cial ity.The mothed can used in the field.Key Words Chloramphenicol ELISA Residues Honey 随着经济的发展,人们的生活质量日益提高,对食品卫生安全问题更加重视。
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酶联免疫法测定蜂蜜中氯霉素残留量（二）
7.1 提取称取2g试样，精确到0.01g，置于25 mL具塞离心管中，加
入4 mL水和4 mL(4.2)，在液体混匀器上充分混匀2 min，使试样彻低溶解。
在振荡器上振荡10 min，以4000r/min离心10 min,精确
吸取上层1 mL于10 mL具塞试管(5.7)中，用氮气吹干仪在50℃吹干。
加入0.5mL缓冲溶液(4.1.8)溶解残渣，供酶标仪测定。
此溶液含试样量0.5g，稀释系数为1。
7.2 测定条件以下全部操作应在20℃～24℃室温下举行。
7.2.1 酶标仪测定条件：酶标仪测定波长为450 nm。
7.2.2 洗板条件如下： 7.2.2.1 洗板机洗板条件：采纳条式抽干和注
满，洗涤次数八次，每次注水量为250uL～350uL。
7.2.2.2 入工洗板条件：洗涤次数五次以上，每次注水量为250 uL。
7.2.3 氯霉素试剂盒中全部试剂的温度均应回升至室温(20℃～24℃)后方可用法。
标准溶液(4.1.2),氯霉素酶标志物溶液(4.1.3)和氯霉素抗体溶液(4.1.4)等均按1份试剂＋10份缓冲溶液举行稀释与制备。
每次测定所用的稀释液均应现配现用。
7.2.4 将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准及样品等在微孔架上的位置(模板图)。
7.3 测定测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。
7.3.l 分离吸取50uL稀释的酶标志物、氯霉素标准溶液、样品溶液和氯霉素抗体等按模板图位置，依次加入各自的微孔底部，然后，用封口膜密封孔条以防溶液挥发。
持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育2h。
7.3.2 将微孔架置于洗板机上，按设定的洗板程序洗板后，将微孔架反扣在吸水纸上并反复拍打。
此步骤既要去除微孔中过多的残液，又不能使微孔干燥。
7.3.3 快速加入50uL酶基质和50uL发色剂于微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育30min。
7.3.4 快速加入100uL反应停止液于微孔底部。
然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔架置于酶标仪中，在450 nm处测量吸光度(加入反应停止液后应在60 min 内读取吸光度)。
7.4 平行实验按以上步骤，对同一标准、同一样品
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