4蛋白质研究技术
Nedd4蛋白家族与肿瘤的研究进展
Nedd4蛋白家族与肿瘤的研究进展泛素-蛋白水解酶复合体通路（UPP）是真核细胞中蛋白质降解的主要途径，在维持细胞正常生理功能中发挥重要作用。
Nedd4蛋白家族作为UPP的核心成员，近年研究已指出Nedd4蛋白家族在肿瘤的发生和發展起着重要作用。
现就Nedd4蛋白家族与肿瘤关系作一综述。
标签：Nedd4蛋白家族；UPP；肿瘤泛素-蛋白水解酶复合体通路（UPP）是一个复杂又有序的特异性蛋白质降解过程，可以降解细胞内错误折叠的和特定时间、空间的蛋白质，是一条重要的非溶酶体降解途径，它在多种细胞内信号分子传导的调节中发挥重要作用。
它通过泛素化修饰与靶蛋白的精细结合，对蛋白质翻译后修饰和降解起了关键作用，参与调控DNA 损伤修复、细胞周期进程、细胞凋亡、抗原呈递、炎症反应等绝大多数细胞事件。
对于肿瘤，UPP能选择性降解癌基因、抑癌基因的产物、激活物或抑制物、凋亡调控蛋白等达到调控细胞突变和肿瘤发生的目的。
Nedd4蛋白家族作为UPP中关键因子，近年来研究其在癌细胞的发生发展，侵袭，转移等课题中已备受瞩目。
人类的Nedd4 家族有9个成员，分别是Nedd4、Nedd4L、Smurf1、Smurf2、Itch、WWP1、WWP2、NEDL1 和NEDL2。
Nedd4家族蛋白不仅参与多种蛋白的生理过程，维持细胞的正常功能，还通过对TGFβ、EGF、IGF等细胞因子介导的信号通路以及原癌、抑癌因子的调控在肿瘤的发生发展中起重要作用。
1 Smurf1Smurf1 在较多肿瘤组织中都呈现高表达。
有研究发现Smurf1的表达水平在乳腺癌中明显高于良性病变且有淋巴结转移的更明显，说明在乳腺癌的侵袭和淋巴结转移过程中Smurf1可能是与乳腺癌转移有关的一个肿瘤标志物。
Yu[1]等研究表明，在儿童横纹肌肉瘤组织及骨肉瘤组织中Smurf1蛋白的高水平表达提高了肿瘤细胞的转移活性，同时通过RNA 干扰Smurf1 的表达，细胞表面突起形成、血管生成受到非常明显的抑制。
10-4-蛋白质组功能模式的研究方法
C端含GAL1转录激活结构域(AD)。
5
系统构建
分别构建含GAL4 BD 和AD 的两个酵母融 合蛋白表达载体；
建立含特殊基因型、适用于双杂交体分析 的酵母菌株。-hybrid）
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Biacore技术提供的数据
特异性 有没有结合？
动力学
结合的速度 有多快？
亲和力
结合的能力 有多强？
抗体与抗原能结合 一个单抗与另一个单抗相比较
吗?
哪一个的结合能力更强?
浓度 结合的量有多少？
有生物活性的蛋白 质浓度是多少?
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Biacore应用领域包含癌症研究、信号传 递、多分子复合物的结构和组装、分子识别、 免疫调节、免疫测定、药物开发、疫苗开发、 瞬时结合检测，药物免疫原性检测。
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（三）蛋白质芯片
构建蛋白质表达谱； 抗原-抗体筛选； 药物靶点筛选； 蛋白质-蛋白质交互作用筛选。
疾病诊断和预警
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蛋白质芯片的类型
生物化学型芯片 化学型芯片 生物反应器芯片
生物化学型芯片
Antibody Array
Antigen Array
Ligand Array
20
21
蛋白质以共价键固定在
基质上
含有与之相
互作用的蛋白质的细胞
裂解液过柱
先用低
盐溶液洗脱下未结合的
蛋白质
然后用高
盐溶液或SDS溶液洗脱
柱上蛋白质
多维
液相色谱耦联质谱技术
（MDLC-ESI-MS/MS） 鉴定靶蛋白的结合蛋白。
主要优点
灵敏度高：高浓度已知蛋白 候选蛋白质与已知的结合机会均等 检测多亚基蛋白质之间的相互作用
蛋白质结构及其功能的研究方法
蛋白质结构及其功能的研究方法随着生物学研究的不断深入，蛋白质作为生命的基本分子，已经成为热门的研究领域。
研究蛋白质结构及其功能不仅有助于理解生命现象，还有助于开发新的药物和治疗方法。
本文将介绍蛋白质结构及其功能的研究方法。
一、X射线晶体学X射线晶体学是目前最常用的研究蛋白质结构的方法。
其基本原理是通过制备蛋白质结晶，并将其暴露在X射线下进行扫描。
X射线与电子云相互作用，会产生衍射，通过解析衍射图谱，可以重建蛋白质的三维结构。
这种方法已经被广泛用于大部分蛋白质的结构解析。
但是，制备蛋白质结晶是一个及其困难和复杂的过程，这也是目前蛋白质晶体学研究的主要瓶颈。
二、核磁共振核磁共振是一种通过探测蛋白质分子核自旋的方法，从而了解蛋白质结构和动态行为的研究方法。
其基本原理是将蛋白质溶解在磁场中，并在其周围施加高频辐射。
蛋白质分子核自旋的能量差距因此被更改，通过对其进行分析，可以解析出蛋白质的核磁共振谱。
这种方法可用于研究蛋白质的构象和动态行为，但是其分辨率相对于X射线晶体学要低。
三、电子显微电子显微是一种用电子束照射蛋白质溶液，并通过电子透射图谱来重建蛋白质结构的方法。
这种方法可以直接观察生物大分子的分子结构，且分辨率较高。
但由于其要求的样品制备和成像条件较为苛刻，因此这种方法应用仍非常有限。
四、质谱质谱是一种通过测量分子的相对质量和相对丰度的方法，以了解蛋白质组分和复杂度的研究方法。
其基本原理是根据电荷-质量比测量分析样品中所存在的离子。
这种方法能够识别蛋白质的氨基酸序列、翻译后修饰，以及蛋白质与其他分子间的相互作用。
综上所述，随着生物学和生物技术的发展，蛋白质结构和功能的研究方法也不断更新与改进。
除了以上介绍的几种方法之外，还有许多其他的方法，例如超分辨率显微、单分子荧光显微等。
这些研究方法的发展和应用，不仅推动了生命科学领域的事业，同时也带动了现代医药和生物工程的发展。
4kda以下小分子蛋白检测方法
4kda以下小分子蛋白检测方法
对于检测4kDa以下小分子蛋白的方法，有几种常用的技术可供选择。
以下是其中几种常见的方法：
1.SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）：这是一种将蛋白质按照分子量大小进行分离的方法。
通过将蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，应用电场使蛋白质在凝胶中迁移，最终根据迁移距离来确定蛋白质的分子量。
2.基于质谱的方法：质谱技术，如MALDI-TOF（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）和ESI-MS（电喷雾质谱），可以用于检测和鉴定小分子蛋白。
这些方法使用质谱分析蛋白质样品，通过测量蛋白质的质荷比，从而确定其分子量。
3.半制备HPLC：高效液相色谱法（HPLC）结合质谱技术，可用于分离和鉴定小分子蛋白。
这种方法通常涉及将样品加载到HPLC柱中进行分离，然后通过质谱分析进行鉴定。
4.Western blotting（免疫印迹法）：这是一种通过将样品中的蛋白质进行分离、转移到膜上并与特定抗体结合来检测特定蛋白质的方法。
虽然Western blotting主要应用于大分子蛋白的检测，但也可以用于小分子蛋白的研究。
第四章 蛋白质的性质、分类及研究方法
多肽序列分析实例
蛋白质研究方法
假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X 1. 如何得到这种蛋白质?
蛋白质的分离、纯化技术 2. 这种蛋白质的大小？
（SDS-PAGE） 3.它的pI是多少？
（等电聚焦） 4. 其他细胞或其他生物体内是否存在？ （Western印迹） 5. 其一级结构如何？
`
• N末端:
• Sanger法（FDNB)
• C端：
肼解法
此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加 热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成 肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-
端氨基酸分离。
RO H2N CH C
R n-1O
Rn O
HN CH C HN CH C OH
几种蛋白酶特异性的比较
蛋白质的各种 间接测定法。
先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的 遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。(DNA测定 序列简单，无法确定最终加工后蛋白质序列、修饰后蛋白 质序列、二硫键信息）
蛋白质一级结构直接测定法的主要步骤
沉降系数S：
大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场 的速度。 或S=v/ω^2‧r。s是沉降系数，ω是离心转子 的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距 离，v是沉降速度。 沉降系数以每单位重力的沉降速度表示， （the velocity per unit force）并且生物大分 子通常为1～500×10^-13秒范围 如令1×10^-13=S 那么生物大分子沉降系数 通常为1～500S S=(p-m)V/f
第四章 蛋白质的性 质分类及研究方法
蛋白质修饰技术与研究
蛋白质修饰技术与研究随着生物学研究的不断深入，针对蛋白质进行修饰的技术也越来越成熟。
蛋白质修饰技术是指在生物过程中，通过一系列的修饰过程对蛋白质进行改变，从而影响其性质和功能。
这些修饰包括糖基化、磷酸化、乙酰化、甲基化等不同类型的化学修饰，并在生物体内的不同部位发生。
在生物质量学等领域，蛋白质修饰技术的研究也备受关注。
首先，蛋白质糖基化是指在糖类分子和蛋白质之间形成化学键。
这种修饰方式是非常常见的，因为几乎所有细胞表面都含有糖类。
根据修饰位置和方式的不同，蛋白质糖基化可以分为N-糖基化和O-糖基化两种类型。
N-糖基化是指糖类修饰蛋白质的氨基酸残基，而O-糖基化则是糖类修饰蛋白质的氢氧基。
这两种类型的蛋白质糖基化均能影响蛋白质的稳定性、生物活性和免疫反应性等性质。
其次，磷酸化是蛋白质修饰的另一种常见形式。
磷酸化通常是指酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸等残基与磷酸分子形成化学结合。
通过磷酸化，可以改变蛋白质的电性、构象和激活状态。
例如，成纤维细胞生长因子（FGF）在磷酸化之后才能与其受体形成配对，从而激发其生物功能。
此外，在肿瘤细胞的生长和扩散过程中，蛋白质磷酸化也常常起着关键作用。
除了上述两种修饰方式之外，乙酰化和甲基化是另外两种常见的蛋白质修饰方式。
乙酰化是将乙酰分子连接到蛋白质的赖氨酸残基上，这可以影响蛋白质的表达水平、激活状态和紧密性。
甲基化则是指在蛋白质的赖氨酸、精氨酸、组胺酸和谷氨酸残基上加上甲基分子。
这种修饰方式通常发生在蛋白质与DNA的相互作用中，可以影响蛋白质的DNA-binding能力和转录调控。
值得注意的是，在蛋白质修饰技术研究领域，不仅仅是单一修饰的探究，而是也要关注在修饰方式复杂的情况下，可能存在的多种修饰模式。
例如，在花生四烯酸（arachidonic acid）代谢途径中，同一个蛋白质可能会经历乙酰化、磷酸化、糖基化等多种修饰方式的叠加，这对于了解生物过程的细节及其表观调控机制具有重要意义。
研究蛋白质结构和功能的方法有何不同
研究蛋白质结构和功能的方法有何不同在生物学领域中，蛋白质是一种重要的分子，它们参与了许多生命过程。
为了深入了解蛋白质的结构和功能，科学家们开发了多种不同的方法。
在本文中，我们将介绍一些研究蛋白质结构和功能的方法，并探讨它们之间的不同之处。
一、X射线晶体学X射线晶体学是一种研究蛋白质结构的重要方法，它利用X射线穿过蛋白质晶体然后在探测器上形成图像，这些图像能够揭示原子间的相对位置。
借助X射线晶体学，科学家们已经解析了许多蛋白质的结构，进一步深入了解蛋白质的功能和如何与其他分子进行交互。
二、核磁共振(NMR)另一种研究蛋白质结构的方法是核磁共振（NMR）。
这种方法能够揭示蛋白质中原子之间的相对位置以及它们如何随时间变化。
NMR适用于那些不能以结晶形式存在的蛋白质，通常作为X射线晶体学的替代方案之一。
此外，NMR也可以用于研究蛋白质在生物环境中的变化。
三、电子显微学电子显微学也可以用来研究蛋白质结构，它对于分析非晶态和大分子的结构更具优势。
在此方法中，组成蛋白质的基本单位将被放置在电子束中以获得非常高分辨率的图像，这通常需要在高真空条件下才能完成。
虽然电子显微学的分辨率不如X射线晶体学，但它已被证明是获得大型生物分子结构的有效方式。
四、互补的方法除了上述方法之外，还有很多其他的技术可以用于研究蛋白质，例如质谱法、红外光谱法、拉曼光谱法等。
这些方法可以提供与X射线晶体学、NMR和电子显微学等技术互补的信息，从而获得更全面的蛋白质结构和功能信息。
总结尽管各种不同的方法在研究蛋白质的结构和功能方面有着很大差异，但它们都能够为我们提供对蛋白质在生命过程中关键作用的详细理解。
这些技术和方法的进一步发展和创新将为我们深入了解生命过程提供更多的机会和可能。
nectin4结构
nectin4结构“Nectin4”是一种细胞蛋白质，它在人体组织中广泛分布且具有多种功能。
本文将从结构、功能和临床应用角度，对Nectin4进行详细介绍。
下文将以清晰的条理，对Nectin4进行讨论。
一、结构特点Nectin4属于Nectin家族，该家族蛋白质的主要特点是它们包含一个或多个免疫球蛋白(Ig)-超家族蛋白质结构域。
Nectin4蛋白质包含一个信号序列、一个外胞膜域、一个跨膜域和一个胞质域。
外胞膜域包含三个Ig样区域，其中第一个Ig样区域对结合细胞外因子特别重要。
该结构特点使得Nectin4能够参与细胞-细胞相互作用。
二、功能作用1.细胞黏附作用：Nectin4与其他Nectin家族成员一样，能够介导细胞与细胞之间的黏附作用。
它可以通过他家族成员Nectin1、Nectin2和Nectin3，以及其他相关的蛋白质如Afadin和Ecto-domaIn-containing proteins 1等相互作用。
2.炎症反应：研究表明，Nectin4在参与炎症反应中起着重要的作用。
炎症相关的细胞因子如TNF-α等可以显著提高Nectin4的表达水平，从而调节炎症过程。
3.生长和发育：早期研究发现，在胎儿发育过程中，Nectin4的表达水平较高。
它参与了许多细胞和组织的发育过程，包括基底细胞生长和上皮细胞的分化。
4.肿瘤抑制作用：最近的研究表明，Nectin4在某些类型的肿瘤中发挥着抑制作用。
例如，在肺癌中发现Nectin4的表达水平降低，与肿瘤的侵袭和预后有关。
因此，Nectin4可能作为肿瘤标记物和治疗靶点，对肿瘤的诊断和治疗具有重要的临床意义。
三、临床应用1.肿瘤治疗：由于Nectin4在某些肿瘤中的表达被认为与预后不良有关，研究人员正在研发针对Nectin4的治疗方法。
例如，一种抗体药物的早期临床试验显示，针对Nectin4的抗体药物能够显著抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。
2.诊断标志物：Nectin4的降低表达与一些肿瘤的发生和发展相关。
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混合蛋白样 品
平衡液
带有配体的树脂 珠（或胶粒）
含配体溶液
洗下未结合的蛋白
收集目的蛋白
Gal：半乳糖
天花粉 凝集素
天花粉凝集素的亲和层析分离
天花粉凝集素是对半乳糖专一的凝集素，用含半乳糖作配 体的琼脂糖交联产物胶进行亲和层析
• 硫酸钠： 30oC以上溶解度太低， 盐析IgG
• 硫酸铵、硫酸钠含少量硫酸，浓溶液pH<4.5, 常需调pH
通过盐析制备的粗提液中盐的浓度都很高，不利于进一步 使用其他方法进行纯化，所以都要通过透析将盐浓度降低。
4.2 透 析
按照分子大
透析袋
小进行分离。
分离取决于 透析袋截留
浓缩的蛋白 混合样品
相对迁移率
2. 等电聚焦电 泳（ IFE）
利用聚丙烯酰 胺凝胶内的缓冲液 在电场作用下沿电 场方向在凝胶内制 造一个pH梯度。
每种蛋白质都 将迁移至与它的pI 相一致的pH处。
凝胶中加有 两性电解质 （pH9-3）
加电场后 在凝胶内形 成一个稳定 pH梯度
加样品， 凝胶染色表明
然后继续 样品按照各自
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶层析原理
比凝胶珠孔径大的蛋白质分子由于不能进入珠内移动得快， 直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。
比凝胶珠孔径小的分子由于可进入凝胶珠的内部，走的路径 长，移动较慢，后被洗脱下来。
由于SDS在电泳条件下是带有负电荷的分子，同时它 有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基 酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是蛋白质分子中 每两个氨基酸残基结合一分子SDS。
加热和SDS使蛋白质变性，还原剂切断蛋白质中的二 硫键。多亚基蛋白质将解离为单亚基。
处理后，肽链都是处于无二硫键连接、分离的状态。
阳离子交换基
强酸性，聚苯乙烯树脂 弱酸性，羧甲基纤维素 弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂
阴离子交换基
强碱性，聚苯乙烯树脂 弱碱性，二乙氨乙基纤维素
时刻要记住：
蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以 蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带 电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。
当蛋白质pH > pI时，蛋白质带净负电荷； 当蛋白质pH < pI时， 蛋白质带净正电荷。
电泳
pI值沿着pH
梯度分布
（＋） 高pH
等 电 聚 焦 电 泳 进 行 过 程 中
低pH （－）
（＋）
高pH
等 电 聚 焦 电 泳 结 束 后
（－）
低pH
3.双向电泳
是一种将等电聚焦电泳 与SDS-PAGE结合的分辨率更 高的一种电泳
第一向电 泳：等电 聚焦电泳
第一向：等电聚焦电泳 第二向：SDS-PAGE
亲和 层析
4.8 蛋白质氨基酸序列的确定
每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列。序列测定包括
确定多肽链的N末端和C末端氨基酸残基、测定氨基酸组成、 测定肽段氨基酸序列和确定二硫键位置等步骤。
双向电泳后的凝胶经染 色后蛋白呈现二维分布图：
水平方向反映出蛋白在 pI上的差异，
垂直方向反映出它们在 分子量上的差别。
聚焦后凝 胶放置在 SDS凝胶 上，进行 第二向电 泳
第二向电泳： SDS-PAGE
pH9
pH9
pH3
分子量大 分子 量小
pH3
（＋） 高pH
等 电 聚 焦 电 泳 进 行 过 程 中
一般电泳缓冲液的pH维持在碱性区，蛋白质带负电荷，向阳 极迁移。
电泳所用的介质通常是凝胶：淀粉凝胶、琼脂凝胶、聚丙烯 酰胺凝胶，蛋白质电泳通常是在聚丙烯酰胺凝胶中进行的。
1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原剂巯基乙醇的 样品处理液对蛋白质样品进行处理（煮沸3～5分钟）。
然后用起始液冲洗，冲洗掉没有结合在柱子 上的蛋白质，只有蛋白X和与它等电点相近的杂 蛋白吸附在柱上。
然后通过盐梯度洗脱，或提高pH的阶段洗 脱或梯度洗脱，获得目的蛋白级分
如果利用阳离子交换树脂从上述混合样品中 纯化目的蛋白，将如何设计实验呢？同学们可以 自己想想，该怎么进行实验。
加 样
阳 离 子 交 换 层 析 过 程
洗脱
洗脱
洗脱
洗脱
4.4 凝胶层析
凝胶层析是按照蛋白质分子量 大小进行分离的技术，又称之凝胶过 滤、分子筛层析或排阻层析。
单个凝胶珠本身是带有交联网状 的珠，像个“筛子”，不同类型凝胶 的筛孔的大小不同。
不同型号的凝胶都有一个分级分离 范围。Sephadex G-75的范围为3-70K， 只能分离分子量介于之间的分子
低pH
（－）
（＋）
高pH
等 电 聚 焦 电 泳 结 束 后
（－）
低pH
双向电泳可以将分 子量相同而等电点 不同的蛋白质以及 等电点相同而分子 量不同的蛋白质分 开。
大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳图
一种目的 蛋白经5个纯 化步骤（分 别取样）的 凝胶电泳图
组织 匀浆
硫酸 铵分级
离子 交换
凝胶 过滤
4.7 电泳
水平纸电泳示意图
样品加在滤纸中间
（凝胶）电泳
电泳能够告诉两个信息：蛋白质亚基的大小及其浓度
电泳的原理：利用不同蛋白质在电场中迁移率的差别达到分 离目的。 一方面不同蛋白质分子在特定电泳缓冲液中因其氨 基酸组成不同，其携带的静电荷不尽相同，致使它们在电场 中的迁移率各异，从而达到分理的目的，另一方面电泳所用 的介质通常是凝胶，凝胶有很多的孔，因此，蛋白质的迁移 速率不仅和它所带的电荷有关还与它的大小相关。
然后置于事先加有透析液的烧杯中，进行透析，隔一段 时间更换一次透析液，一直达到透析要求为止。
经透析后的样品一般须用层析、电泳等方法进一步分级分离
4.3 层析原理
层析也称之色谱，常用于溶液中蛋白质混合物的分级分 离，通常都是在装有不同固相介质的柱子中进行的。
基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，样品中的各 个成分与固相相互作用不同，样品中的各个成分通过固相的速 率产生差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。
SDS-PAGE过程中，小分子走在前头，大分子滞后
电泳方向
混合样品 电泳后
大分子
带孔胶
小分子
按分子 大小分离
电泳 缓冲液
加在槽中的经 SDS处理的样品
夹在两块玻璃 板之间的凝胶
电泳 缓冲液
电源
分子量大 分子量小
电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片
标准蛋白分子量
在一定的凝胶浓度下， 多肽链分子量的对数与 多肽链的相对迁移率成 线性关系，所以可以通 过标准曲线求未知多肽 链分子量。 未 知 蛋 白
• 但这种分子筛效应不同于凝胶过滤层析中的分子筛效应。在 凝胶过滤层析中，大分子被排出在凝胶的孔径之外，因此移 动很快; 在SDS-PAGE中，所有分子都穿过凝胶，很显然大分 子的迁移是最慢的。
• 凝胶通过考马斯亮蓝染色出现不同的蓝色蛋白带。
SDS-PAGE 一般用垂直板 电泳装置
加样
样品迁 移方向
到30％，离心取上清 向上清继续加硫酸铵，直至浓度达到50％，离心收集沉淀
（含肌酸激酶），沉淀溶解于适当磷酸缓冲液溶液。
靶蛋白与 杂蛋白混 合溶液
加盐先使杂 蛋白沉淀
再向离心后的 上清继续加盐 使靶蛋白沉淀
盐析
经用的盐是硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等
• 硫酸铵：温度系数小而溶解度大,蛋白不易变性 25oC 4.1M =767g/L; 0oC 3.9M=676g/L 对蛋白氮的测定有干扰、缓冲力弱
因此凝胶层析按照大分子先出来，小分子后出来将不同大小 的分子洗脱下来。
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤层析过程示意图
在一定条件下，被分离的蛋 白质的分子量的对数与其洗 脱时间（或洗脱体积）成线 性关系，利用分子量已知的 一组蛋白可做标准曲线。
未知蛋白也在同一条件下过 柱，根据得到的洗脱时间或 洗脱体积可从标准曲线求其 分子量
举一例子：
已知蛋白质 X 等电点为6，设计一个利用阴离子交 换柱从混有该蛋白的样品中纯化该蛋白的实验。（假设 混合样品中含有的杂蛋白的pI与目的蛋白的pI绝对值都 相差1以上）。
答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5 的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH7.0以上的缓冲 液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混 合液上样，
○ 曲线表示有活性部分
熊猫脑肌酸激酶纯化：G－100凝胶层析曲线
柱子尺寸：1.6cm×80cm
天花粉毒蛋白 天花粉毒蛋白纯化：G50凝胶过滤层析（1.8cm×100cm）
4. 5 离子交换层析
离子交换层析是利用在一定pH下不同蛋白质带电种类和电 荷量的差异进行分离的技术。柱基质是合成的结合了带电基团的 聚合物。离子交换层析分为阴离子交换层析和阳离子交换层析。
• SDS和巯基乙醇处理消除了蛋白质原有电荷和形状对电泳的影 响，电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白 质原有电荷和形状的影响，而主要取决于多肽链相对分子质 量，所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白 质的相对分子质量
• 在SDS-PAGE中，蛋白质通过凝胶的速率与它们分子量的对数 成反比，大的蛋白质会遇到更多的阻力，它们的迁移速度比 小的蛋白质慢，这实际上是一种分子筛效应。
的分子量。
透析液