蛋白质相互作用技术研究的几种技术

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bait
proteinX
cDNAforX
DNAb in d in g d o m a in transfection tran s fo rm e d
yeast
X
yeast plasmid expression vector
predator
unknow
tis s u e
b a it
predator
X
二、谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验 (GST-pull down）原理
GST-融合蛋白 + 谷胱甘肽-琼脂糖球珠 X GST
Y 细胞裂解物
4℃下孵育2h tube
X GST Y
GST pull down实验流程
（1） Glutathione 琼脂糖珠预处理。 （2） GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10μl已经
（6） SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析.
四、双分子荧光互补技术( bimolecular fluorescence complementation , BIFC)
BiFC技术是将荧光蛋白（GFP、YFP、CFP） 分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别 与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互 作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在 空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发 出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目 标蛋白是否具有相互作用，对研究蛋白质相互作 用有重要意义。
bait
XY prey
transcription machinery lac 2
-galactosidase
X-gal
blue color
NH2
Gal4
BD
A
+
Gal4
NH2 AD B
COOH 共转化
Gal4
B AD
COOH
Gal4
BD
A
Promoter
Reporter
举例
酵 母 双 杂 交 基 本 过 程
（4） 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗 体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗 体与protein A琼脂糖珠偶连。
（5） 免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底。将上清小心吸去，琼脂糖 珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次。最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟。
BIFC的优势
在最接近活细胞生理状态的条件下观察到 其相互作用的蛋白发生的时间、位置、强弱、 所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号 分子对其相互作用的影响等。
五、生物发光共振能量转移（ＢＲＥＴ） 技术
ＢＲＥＴ技术是近年来出现的一种新的检测 蛋白质－蛋白质相互作用的技术。是建立在非辐 射能量转移的基础上，在一个发光或荧光供体发 光酶（lux）和一个荧光受体（如绿色荧光蛋白G ＦＰ）之间会发生能量转移。供体发光酶在相应 底物存在时发射光波。能量受体是荧光蛋白，在 一定波长范围内吸收光波，并在一定的波长范围 内发射光波。
处理过的beads置于1.5ml离心管中， 4℃, 摇床孵育过夜。 （3） 孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃,500g离心
5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上， 用1ml冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。 （4） 将菌体用溶菌酶处理，之后破碎细菌壁，最大转速 4℃离心20min,收集上清液。 （5） 将细胞裂解液上清加入beads中，混匀，4℃，摇床3h。 （6） 3h后，用冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次。 （7） 加15μl 2×SDS上样缓冲液，煮沸5min. （8） SDS-PAGE,Western Blot或质谱仪分析。
蛋白质相互作用研究技术
汇报人: 布沙热木.阿布力孜 玛伊热.努热艾合买提 .玉苏甫 阿布力米提.

常用蛋白质相互作用的研究技术
酵母双杂交 谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pull down） 免疫共沉淀 双分子荧光互补技术(BIFC) 生物发光共振能量转移（ＢＲＥＴ）技术
一、细菌双杂交系统
Two-hybrid system 是90年代初发展起来的新 方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用的基因。 基本原理：
Y
does X bind with a protein?
to tal m R N A re v e rs etra n s c rip ta s e
cDNA y e a s t p l a s m i d e x p r e s s i o n v e c t o r
transfection
activation domain
• 组成部分：（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表 达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）与AD融合的 蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白 （prey）；（3）带由一个或多个报告基因的宿主 菌株。
F i s h i n g w i t h t h e y e a s t t w o - h y b r i d s y s t e m
三、免疫共沉淀原理
• 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原 之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经 典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用 的有效方法。
• 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多 蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固 化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白， 那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。 再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者 间的相互作用。
真核生物的转录因子大多是由两个结构上分 开、功能上独立的结构域组成的,如GAL4 （酵母 转录激活蛋白Gal4的基因）。这两个结构域各具 功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表 达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则 无法完成激活功能。
• 酵母激活因子 GAL4：N端：147个氨基酸组成的 DNA结合域(BD)， C端：113个氨基酸组成的转录 激活域(AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激 活序列(upstream activating sequence，UAS)结 合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转 录。
三、免疫共沉淀原理
免疫共沉淀实验流程
（1）将菌体用溶菌酶处理，冰上裂解30min,之后破碎细菌 壁，最大转速4℃离心30min,收集上清液。冰上裂解30min,
（2） 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加 1μg相应的抗体加入到细菌裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过 夜。
（3） 取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次3,000 rpm离心3 min。
将两个目的蛋白分别和供体和受体形成融合 蛋白，两个目的蛋白之间距离足够近并发生相互 作用，即可检测到ＢＲＥＴ信号。
蛋白质之间相互作用研究的重要性
蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形 成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成 者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制 与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢 等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。
transfection
e x t r a c t p la s m id s
re-transformed yeast
X
Y
?
agar plate
positive yeast containing
bait plus predator!
th e fishing was good!
end of slide show