TRANSWELL 细胞迁移 侵袭实验
Transwell小室底层的一张有通透性的膜（一般为聚碳酸酯膜），将其放置于孔板中，小室内称上室，培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
服务内容
1、细胞共培养：研究某一细胞分泌产物对另一细胞性能的影响；
2、趋化实验：研究某一细胞分泌产物对另一细胞迁移的影响；
研究某一因子或蛋白对细胞迁移的影响；
3、肿瘤迁移实验：研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。
服务流程
1、细胞共培养：
（1）在下室中接种能够分泌细胞因子或特定蛋白产物的细胞，在上室中接种效应细胞；（2）按照实验要求培养一定的时间；
（3）检测效应细胞性能的改变：可通过流式细胞仪检测表面分子、细胞凋亡等；
2、趋化实验：
（1）在上室中接种效应细胞，下室中接种能够分泌特定产物的细胞或加入因子；
（2）计数进入下室的细胞数可反映分泌产物或因子对特定细胞的趋化作用；
3、肿瘤迁移实验：
（1）在上室中接种效应细胞，下室中加入待测样品；
（2）计数进入下室的细胞量，可评价该样品对肿瘤细胞迁移能力的影响；
客户提供状态良好的细胞；我们提供实验结果与实验方法报告单。
细胞迁移和侵袭实验
细胞迁移和侵袭实验 实验准备： 细胞，24孔板，transwell小室（8μm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒 实验设计： 实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。 实验操作（请细读注意事项）： 一、细胞侵袭实验 1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。 2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。 3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使 用液。 4.把枪头剪去一小段（约3 μm）后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel使用液轻轻 加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。 5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。 6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞， 制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。 7.按照每孔200 μL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加 入10%FBS+培养基500 μL，放入37 ℃孵箱培养。 8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒 在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。 9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液， 再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。 10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。 11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。
细胞迁移侵袭实验操作步骤
实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的
实验中细胞铺板的方法
于侵袭、迁移等试验的细胞计数及铺板 [实验步骤] 1、准备工作用 75% 的酒精擦拭双手，同时用酒精棉球擦拭超净台。2）将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）3）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。 2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlPBS液清洗一遍，四个方向晃动倒掉。 3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿内,拍皿，上下左右铺匀，37°消化30分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全. 4、加入4ml的含5%血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液，然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min. 5、弃上清。用PBS 3ml 洗细胞，吹打或涡旋混匀，洗2次，离心1000rpm,3min.弃上清。 6、配细胞稀释液（BSA 终浓度为0.1%）每种细胞需3ml稀释液,共6个样品，所以配20ml稀释液(无血培20ml+10%BSA 200ul.) 7、细胞沉淀中加3ml细胞稀释液，吹打混匀，即得稀释过的细胞悬液。 8、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品计数2次，算均值。（8个大格总数/8=数值*104） 9、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用细胞稀释液补。 普通的细胞计数及铺板(免疫荧光，WB等不需定量) [实验步骤] 1、准备工作用75% 的酒精擦拭双手，同时用酒精棉球擦拭超净台。2）将 培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）3）倒置显 微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。 2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlPBS液清洗一遍，四个方向晃动倒掉。 3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿内,拍皿，上下左右铺匀，37°消化30分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全. 4、加入4ml的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液，然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min.若细胞较多，则需稀释。 5、取上述1ml细胞悬液，在加1ml含血清的新鲜培养基，混匀。 6、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品对角线计数2次，算均值。 7 、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用含血清的新鲜 培养基补。
Transwell侵袭实验全面总结
Transwell侵袭实验全面总结 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1．Transwell trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable support s）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（T ranswell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有－μm，根据不同需要
可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。下图是一个Trans well装置的纵切面 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养 液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择μm以下孔径。常用、μm。我们实验室用的是μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义
抗肿瘤药物5氟尿嘧啶对肿瘤细胞 迁移的影响 欧阳学文 （细胞划痕法） 实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。 图1 肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细
胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料
细胞迁移划痕实验
细胞迁移实验技术 —划痕实验 一、基本原理 细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例如72h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。 二、操作步骤 1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 2．在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%。 3．第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜(不同孔之间最好使用同一只枪头)。 4．PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。 5．放入37℃5%CO2培养箱，培养。可按0，6，12，24h时间点取样，拍照(具体时间依实验需要而定)。 6.统计方法：使用ImageJ软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值。
三、注意事项： 1.在用PBS 缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。 2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（<2%）否则细胞增殖就不能忽略。 3.按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。
Transwell实验 超详细
Transwell侵袭实验总结 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1.Transwell 关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。 更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 下图是一个Transwell装置的纵切面
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。
肿瘤细胞侵袭实验(Tumour Invasion Assay)
肿瘤细胞侵袭实验（Tumour Invasion Assay ） 肿瘤细胞侵袭实验（TumourInvasionAssay ）可以：（1）研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响；（2）一些抑制血管生成的新药研究；（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。 实验方法 Matrigel 基质膜模型 实验方法原理 Matrigel 是从小鼠EHS 肉瘤中提取的基质成分，含有LN 、IV 型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um ，而且膜孔都被Matrigel 覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel 的滤膜放在以Blind Well 腔或MICS 腔上下室之间，铺有Martrigel 面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN 、FN 或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel 的用量有关，选择 25ugMartrigell 铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE 染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel 的细胞数。另外用Transwell 小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell 小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel ，加入细胞72h 后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll 腔中培养 72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel 而直接将8um 孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN 或FN 或在滤膜下表面铺上LN 或FN ，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。 实验材料 Matrigel 基质胶试剂、试剂盒 DMEM 结晶紫染料溶液醋酸低血清DMEM 培养基FBS-DMEM 培养基IFN-γ仪器、耗材 24-transwell (Coster)离心管冰箱离心机移液枪枪头枪头盒实验一、溶液配制
肿瘤学研究常用实验技术及方法
肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题 1.表观遗传的科学内涵 三个特点？ a)基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性； b)细胞外环境长期作用的结果，有可逆性； c)分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化 2.变性高效液相色谱(DHPLC)技术在肿瘤研究中的应用 DHPLC 的主要应用？ Separation of DNA, MSI, LOH, STRs, Q-PCR, detection of mutation , SNPs, oligos, RNA. 3. 蛋白质分离纯化及鉴定 i.分离纯化蛋白质的方法有哪些？ 盐析，透析，离心，凝胶过滤（分子筛）层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析。 ii.等电聚焦电泳（IEF）与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）有何不同？ 等电聚焦电泳：利用蛋白质分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。 SDS-PAGE:蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷的差异。在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以 说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关 iii.两种等电点相近的，分子量相差较大的蛋白质应该首选那种分离方法？SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 iv.蛋白质印迹（Western Blotting）过程中应注意的事项有哪些？ 1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意 防护。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。 3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超 载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。
细胞运动及迁移检测方法的比较与选择
细胞运动及迁移检测方法的比较与选择关键词：细胞仪器分析仪试剂标准物质北京标准物质网 一.transwell试验 transwell技术是检测细胞运动能力的经典方法，由于其原理简单、操作相对简便，该法目前已被广泛用于检测不同类型细胞的运动能力。内室底部的薄膜是整个实验装置的核心部分，待测细胞的直径决定了薄膜孔径的选择。通常情况下，薄膜的孔径应略小于细胞的直径以防止细胞直接漏入到外室。transwell试验对细胞运动和迁移能力的评价主要依赖于对转移至底膜外侧细胞的染色和计数。甲紫是transwell试验中常用的细胞染料，在染色前需要使用棉签将底膜内侧的细胞拭去以免残余的细胞着色后影响最终的细胞计数和统计。然而，通常使用棉签很难将膜内侧的细胞全部拭去，因此这是制约本试验精确度的主要因素之一。同时，甲紫染色后的细胞计数常由操作者在显微镜下完成，导致实验的最终结果缺乏稳定性和准确度。此外，该方法只适宜于终点检测法，难以实时检测细胞的运动变化。 目前已有改良的方法或实验装置可弥补以上几点不足。如在对发生迁移的细胞进行定量分析时，可以荧光染料将细胞着色，而后将底膜外侧的细胞经处理(如胰酶等)转移至计数板内，使用电子计数器对细胞总数进行定量分析。又如Roche 和AceaBio公司联合开发的xcELLigenee系统，将经典的transwell实验装置与微电子阻抗感应系统整合，实现了对细胞运动的实时监测。微电子阻抗系统所检测到的微电阻与细胞的数量，伸展状态，贴壁紧密程度等多项生理指标密切相
关，将其整合于内室底部微孔膜的下表面上，当细胞迁移至微孔膜底面时，则可引起细胞微电阻的升高，通过记录微电阻的变化可精确的反映细胞的运动状态。该系统提高了传统transwell的精确度，同时可以获取细胞运动的实时动态数据。然而，由于该系统需要借助于特殊的仪器设备，且成本相对较高，因此常应用于大规模及高通量的筛选工作。 二、二维平面内细胞运动的检测方法 1.划痕试验原理简单，操作便捷，不需要借助特殊的实验仪器，适用于任何具有贴壁特性的细胞，因此在细胞运动的检测中应用广泛。本方法中，细胞运动的能力反映为划痕宽度的变化，通常情况下划痕由实验操作者以移液器的吸管端划出，导致划痕的宽度并不均一，因此在一定程度上影响了划痕愈合度的评估。同时，有观点认为超过24小时的检测并不能排除细胞增殖对划痕愈合的影响，尽管在实验过程中通过降低培养基的血清浓度可在一定程度上削弱细胞增殖的影响，但划痕试验中观察时间点的设置仍宜控制在24小时以内。此外，在人为制造划痕时可对周围细胞产生一定的机械损伤，可能会影响划痕边界周围细胞的活性和运动潜能。同时，脱落的部分细胞可能在培养板静置后重新在无细胞区域定植和迁移，从而制造划痕愈合的假象。 目前，Applied BioPhysics公司推出了基于微电阻感应系统的划痕试验装置。借助于整合在细胞培养板l的电极，通过电流的脉冲刺激可产生宽度恒定均一的无细胞区域。同时通过检测无细胞区域的微电阻的增加，可以判断细胞向内迁移的数量。这种改良后的装置实现了实验条件的标准化和实验结果统计的精准化，但其对设备器材的要求和成本均相对较高。
肿瘤细胞侵袭和迁移研究的实验技术改进
肿瘤细胞侵袭和迁移研究的实验技术改进 【摘要】肿瘤的基础研究一直是医学类研究的热点，研究者发现恶性肿瘤细胞具有高度侵袭和迁移的特性，对于侵袭和迁移特性的研究具有现实指导意义，而实验技术是基础研究中重要的一个环节，本文针对研究肿瘤细胞侵袭和迁移的几种常用实验技术，提出相应的改进建议。 【关键词】肿瘤；侵袭；迁移；实验技术 肿瘤的治疗一直是生物医学类研究很重要的一部分，恶性肿瘤成为威胁人类健康和生命的主要疾病之一，近些年来，我国及全世界的恶性肿瘤发病率和死亡率都呈上升趋势。近年来肿瘤相关研究取得了很大的进展，但恶性肿瘤具有的高度侵袭和迁移特性成为肿瘤治疗失败的主要原因之一，因此肿瘤细胞的侵袭和迁移是抗肿瘤研究中的热点。 1.检测肿瘤细胞的侵袭性和迁移性的常用实验技术 基础研究对临床工作有着推动作用，注重基础研究不仅利于提高医务工作者的素质，并且利于开展交流合作，推动行业发展，肿瘤疾病治疗的研究工作最终还是要从基础研究做起。实验技术对于基础研究的发展有着至关重要的作用，实验技术的发展推动基础研究的进步。研究肿瘤细胞侵袭和迁移特性时，常用的实验技术有Western blot、免疫组化、Transwell小室测定法、划痕实
验等，对这几种实验技术进行优缺点分析能够为科研工作者提出建议，让科研工作者在研究过程中少走弯路，具有一定的现实意义。 1.1检测肿瘤细胞侵袭和迁移相关蛋白 肿瘤细胞侵袭和迁移相关蛋白有CD147、MMP-2、MMP-9、VEGF 等。CD147是免疫球蛋白家族中一个高度糖基化的跨膜蛋白，能够调控MMPs的表达，刺激MMP-2、MMP-9的产生，MMP-2、MMP-9能降解细胞外基质的蛋白成分，并且诱导VEGF的产生，促进血管的生成，在恶性肿瘤的侵袭和转移中起关键性作用。研究证实，这些蛋白的表达水平都与肿瘤细胞的恶性程度、肿瘤的侵袭和迁移有着密切的联系，通过实验来检测蛋白的表达水平，一定程度上可了解肿瘤细胞的侵袭和迁移特性。 在基础研究中，通常可以通过Western blot来检测侵袭和转移相关蛋白的表达水平，从而确定肿瘤细胞的侵袭性和迁移性是否存在差异，这种方法一定程度上是可以让研究者间接了解肿瘤细胞的侵袭性和迁移性的变化，并且Western blot的方法可以量化蛋白的表达水平，但缺点是检测蛋白表达水平对于判断侵袭性和迁移性不够直观，实验步骤较为复杂，抗体和蛋白的亲和力存在差异，并且抗体价格相对比较昂贵，因此此方法存在一定的局限性。 1.2Transwell小室测定法 Transwell小室测定法可用于测定肿瘤细胞的侵袭性和迁移性，
(完整版)Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义
抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响 （细胞划痕法） 实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官， 长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。 图1肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力， 核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即 所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时， 往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培
养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。 细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。 下图即为划痕实验的示意图，图中可见，在细胞层上出现一道空痕（A），当加入药物后， 由于药物的作用使细胞迁移受到抑制(B)，而未加入药物的细胞保持了原有的迁移能力，在 一段时间后通过迁移将划痕掩盖(C)。 A B C 图2实验结果（A表示在单层细胞上划出的一道痕；B表示加入抑制剂，为阳性对照组； C 表示未加入抑制剂，为阴性对照组） 一、实验目的 1．了解肿瘤细胞转移的基本原理
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay) 实验介绍?细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。 1材料准备:?可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:? Corning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)?2步骤与流程?2。1基质胶铺板: 用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。?２、2制备细胞悬液?①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。但这一步并不就是必须得、 ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。?２。3接种细胞 ①取细胞悬液１00μl加入Trａnｓwelｌ小室、?②24孔板下室一般加入600μl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。?③培养细胞:常规培养12-４８h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。２４h较常见,时间点得选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目得影响也不可忽视、?2、４结果统计 直接计数法,“贴壁"细胞计数,这里所谓得“贴壁”就是指细胞穿过膜后,可以附着在膜得下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞、 取出Ｔｒanｓｗelｌ小室,弃去孔中培养液,用无钙得PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。?0、1%结晶紫染色２０mｉｎ,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用ＰBS洗3遍。?４00倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。 实验材料 (１)Tｒａnｓwell ｃhamber: 24—ｗell, 8。０-μm porｅ meｍｂranes (C ｏｒning) (2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10%血清培养基,PBS,0.02%ＥＤTA (３)固定液:甲醇 (４)染色液:Giemsa染液 (5)封片剂:中性树胶 (６)其她:小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片 操作步骤
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验(cell migration assay) 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径与经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤: 1材料准备: 可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster与Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM与1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1%(g/ml)PBS结晶紫) 2步骤与流程 2、1基质胶铺板: 用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2、2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不就是必须的。 ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1－2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2、3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基,特别注意的就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。 ③培养细胞:常规培养12－48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2、4结果统计 直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”就是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。 0、1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。 实验材料 (1)Transwell chamber: 24-well, 8、0-μm pore membranes (Corning) (2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10％血清培养基,PBS,0、02％EDTA
肿瘤迁移和侵袭试验
肿瘤迁移和侵袭试验——Millicell小室测定法 【实验材料】 1、肿瘤细胞及其所需培养液； 2、Transwell小室（Millipore公司，直径12mm，孔径8μm）； 3、人工基质胶（ECM，Sigma公司）； 4、24孔细胞培养板； 5、无水乙醇、苏木精、伊红染液，棉签； 6、载玻片、手术刀片。 【实验步骤】 1、接种细胞前一天，将ECM胶与预冷的无血清和抗生素（双无）1640按1：7的比例以总量32μl铺在 transwell小室的上室面，注意不能有气泡产生；再将小室置于24孔细胞培养板内，超净台内紫外线照射过夜。（做肿瘤迁移实验则不需要此步） 2、接种细胞：用不含血清的培养液制备单细胞悬液，将细胞密度调整为2.5×105个/ml，取400μl加入 上室中；在下室即24孔板内加入600μl含20%FBS的1640培养液。 3、细胞培养：将24孔板置于37℃、5%CO2细胞培养箱内，培养24小时。 4、固定细胞：待培养时间结束后，吸尽上室内液体，小心取出上室，用湿棉签檫去膜上面未穿过膜的细 胞，自然风干后以无水乙醇置于细胞培养箱内固定20min。 5、细胞染色：固定后的细胞先以苏木精染色20min，清水清洗一遍；再用伊红染色20min后清水清洗一 遍。 6、细胞计数：染色完毕后将小室自然风干，用手术刀片沿压痕将小室膜轻轻切下，置于载玻片上在显微 镜下观察、计数。 【注意事项】 1、由于ECM在室温或温度更高的情况下极易凝固成胶状，且此过程为不可逆的，因此建议在配制人工 基底胶时可在冰上操作；
2、ECM与双无1640的比例可根据试验情况在1：5到1：10之间调节； 3、接种细胞之前一定要细胞计数，细胞密度最好不要超过5×105个/ml； 4、下室内的培养液亦可换成小鼠成纤维细胞系NIH3T3条件培养基，制备方法：用含10%FBS的1640 培养液在37℃、5%CO2条件下培养，在细胞长势良好的情况下换成双无培养液继续培养24小时，然后收集培养上清液，冰冻保存备用。 5、细胞培养的时间依肿瘤细胞类别有所不同。 6、细胞固定及染色时应注意每次都要将小室风干，必要时可将小室倒置。 7、Harris苏木精染液配制方法： 苏木精1.0g 硫酸铝钾15g 无水乙醇10ml 蒸馏水200ml 先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精，再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min 后稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖住瓶口。使用之前用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。 8、伊红染液配制方法： 伊红Y 0.5~1.0g 蒸馏水100ml 先将伊红Y加入蒸馏水中，用玻璃棒将伊红搅起泡沫后过滤，每100ml加冰醋酸1滴。 附： 正常胃癌SGC7901细胞株
肿瘤细胞侵袭试验(Tumour Invasion Assay)原理和实验步骤
肿瘤细胞侵袭试验（Tumour Invasion Assay）原理和实验步骤一、原理 Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用Trans well小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll腔中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。