PI法和Annexin V／PI法检测蓝舌病毒HbC3诱导人肝癌细胞的凋亡
细胞凋亡的几种常见检测方法
细胞凋亡的几种常见检测方法细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种用流式细胞仪进行测定的方法。
一、AnnexinV/PI法在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。
磷脂结合蛋白V（AnnexinV）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与PS具有高度的结合力。
因此，AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。
碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
方法： 1、悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ulBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ulBindingBuffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
2、贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。
注意事项：1、整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
2、操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。
二、Hoechst33342/ PI法：单纯的PI染色能够观察DNA直方图上凋亡细胞的亚G1峰，但只能代表G0/G1期发生凋亡，无法观察S期和G2期发生的细胞凋亡。
而且，细胞经过固定后无法对活细胞和死细胞进行区分。
Hoechst 33342可以穿透细胞膜，进入正常细胞和凋亡细胞，与DNA结合，能在紫外线下显示蓝色荧光，而且染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。
顺铂诱导肝癌细胞凋亡的实验研究
顺铂诱导肝癌细胞凋亡的实验研究细胞凋亡作为生物细胞对内外信号刺激的一种反应，在正常细胞的发育过程中精确调控细胞的死亡过程。
肿瘤的发生与正常的细胞凋亡过程被抑制，破坏了细胞增殖与凋亡之间的平衡有一定关系。
顺铂因其可抑制癌细胞的DNA复制过程，抑制癌细胞分裂，而被广泛应用于临床治疗肿瘤。
我们观察了顺铂对肝癌细胞株HepG2凋亡的诱导作用，从而探讨其作用机制。
1 材料与方法1.1、药品和试剂：RPMI-1640培养基（购自Gibco公司），胎牛血清（coring公司），顺铂（Gibco公司），Annexin-V/PI试剂（Invitrogen公司）。
倒置显微镜（尼康TS100F）流式细胞仪（Beckman Coulter公司）。
1.2 方法1.2.1 细胞系及培养：人肝癌HepG2细胞株引自大连医科大学中心实验室。
用含10%胎牛牛血清、100 u/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素的RPMI－1640 培养液, 在37 ℃、5% CO2 条件下作常规悬浮培养，每2-3天换液传代培养。
1.2.2 细胞培养及药物处理：取对数生长期细胞，细胞用0.25%胰蛋白酶消化后,配成5×105/L的细胞悬液分别接种于24孔板中培养，24 h细胞贴壁后，弃上清。
实验组分别加入浓度为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL的顺铂处理细胞，对照组不加药，另设空白对照组（只有培养基，无细胞），每组设置复孔，全湿条件下，37℃、5% CO2 培养箱中培养。
1.2.3 细胞形态学观察：取对数生长期细胞, 以每孔5×105个接种于6孔板中,24 h细胞贴壁后，弃上清。
分别加入不同浓度顺铂处理细胞，每6 h于倒置显微镜下观察活体细胞形态。
1.2.4 流式细胞仪分析细胞凋亡：实验组，对照组和空白对照组细胞培养24h，48h后用0.25%胰蛋白酶消化，PBS漂洗两次，调整细胞浓度至106/mL，取100μl细胞悬液，加入5μl Annexin－V/FITC 10μl及浓度为50μg/mL的PI液10μl，室温避光孵育15分钟后，加入PBS液400μl，用流式细胞仪进行流式细胞术定量检测。
线粒体在蓝舌病毒HbC_3株诱导人肝癌细胞凋亡中的作用
线粒体在蓝舌病毒HbC_3株诱导人肝癌细胞凋亡中的作用汪艳;易有荣;崔冶建;董长垣【期刊名称】《武汉大学学报：医学版》【年(卷),期】2006(27)4【摘要】目的:探讨BTV-HbC3对人肝癌Hep-3B细胞线粒体功能和膜电位的影响及其与细胞凋亡关系。
方法:利用透射电镜和荧光显微镜观察Hep-3B细胞感染BTV-HbC3在24,36,48 h的凋亡情况与其线粒体形态变化;噻唑蓝(MTT)法检测其线粒体功能;流式细胞仪检测经Rh123/PI染色的BTV-HbC3诱导该细胞线粒体跨膜电位(△Ψm)和Annexin V/PI染色的细胞凋亡率。
结果:Hep-3B细胞感染病毒在24,36,48 h时可导致线粒体功能下降,同时使线粒体膜电位显著降低,细胞凋亡率显著增加。
结论:BTV-HbC3通过诱导凋亡来抑制人肝癌细胞的生长,其机制与线粒体跨膜电位下降有关。
【总页数】5页(P425-428)【关键词】蓝舌病毒HbC3;细胞凋亡;线粒体;膜电位;人肝癌细胞【作者】汪艳;易有荣;崔冶建;董长垣【作者单位】武汉大学医学院病毒学国家重点实验室;武汉大学医学结构生物学研究中心【正文语种】中文【中图分类】R373.1【相关文献】1.蓝舌病毒HbC3株诱导人肝癌细胞Hep-3B的凋亡 [J], 汪艳;雷森林;郭淑芳;高婧;戴莹;董长垣2.PI法和Annexin V/PI法检测蓝舌病毒HbC_3诱导人肝癌细胞的凋亡 [J], 汪艳;刘春新;易有荣;崔冶建;朱珺;董长垣3.人肝癌细胞感染蓝舌病毒HbC_3株超微结构的动态观察 [J], 汪艳;雷森林;郭淑芳;易有荣;董长垣4.蓝舌病毒HbC_3株与蓝舌病毒10型标准株感染人肺腺癌SPC-A-1细胞的生物学特性比较研究 [J], 雷森林;肖安涛;刘春新;陈保平;方萍;董长垣5.蓝舌病毒HbC_3株诱导人肝癌细胞Hep-3B的凋亡 [J], 汪艳;雷森林;郭淑芳;高婧;戴莹;董长垣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
流式细胞仪检测早期细胞凋亡：AnnexinVPI双染色法
流式细胞仪检测早期细胞凋亡：AnnexinVPI双染色法流式细胞仪检测早期细胞凋亡:Annexin V/PI双染色法作者：发布日期：(2009-06-24) 浏览次数：0次细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。
这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。
PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。
巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。
Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。
因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。
PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。
两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。
因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。
凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如（PI）有拒抗染性，坏死细胞则不能。
细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。
因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。
在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为Annexin V -/PI-；右上象限是凋亡晚期细胞或凋亡继发性坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为早期凋亡细胞，显现Annexin V +/PI-（图1）。
图1 细胞凋亡的Annexin V-FITC/PI检测法试剂准备结合缓冲液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2Annexin V-FITC溶液碘化丙锭（PI）溶液实验步骤1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，500~1000r/min离心5min，弃去培养液。
FITC-AnnexinVPI双染色法检测凋亡细胞
FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞一、实验目的a)了解凋亡细胞的变化及检测方法。
b)了解FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞的原理及方法。
二、实验原理a)细胞凋亡是细胞内由多个基因控制的死亡程序被活化而导致的细胞自杀（cell suicide）。
膜磷脂酰丝氨酸原来位于细胞膜的内部。
在细胞凋亡早期，细胞膜上的膜磷脂酰丝氨酸外翻与AnnexinV结合，使其被染成绿色。
在细胞凋亡晚期，细胞膜破裂，使得PI进入细胞当中与DNA结合，使其被染成红色。
b)细胞坏死（cell necrosis）：是由外部化学、物理或生物因素的侵袭而造成的细胞崩溃裂解，也被描述为细胞谋杀（cell murder）。
c)喜树碱（camp tothecin，CPT）是一种植物来源的抗肿瘤药物，可诱导肿瘤细胞凋亡。
d)Annexin V是一种可与磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）特异结合但不能通过正常细胞膜的物质。
碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一种发出红色荧光的DNA结合染料，也不能透过活细胞完整细胞膜。
e)细胞凋亡早期，细胞膜PS由膜脂双层内侧转位至外侧，FITC标记的AnnexinV（AnnexinV-FITC）即可与其结合，使细胞膜处呈绿色。
细胞凋亡中晚期，膜通透性变大，PI可进入细胞与核内DNA结合。
f)激光共聚焦显微镜（LSCM）以单色激光作为光源，并用附设光源针孔(pinhole)使光源成为点光源.除此之外，在检测器前方也有一个检测针孔，点光源对标本内焦平面上的每一检测针孔后的光电点扫描，标本上的被照射点在检测针孔成像，由倍增管或冷电耦合器件逐点或逐线接受，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像，光源针孔与检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔，焦平面以外的点不会在检测针孔成像，这就是所谓的“共聚焦”，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。
鉴定细胞凋亡的常用方法
鉴定细胞凋亡的常用方法细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，是维持生物体正常生长发育和组织修复的重要机制。
凋亡与疾病的关系密切，如肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等。
因此，鉴定细胞凋亡的常用方法对于疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
本文将介绍几种常用的细胞凋亡鉴定方法。
一、TUNEL法TUNEL法是一种基于末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP-nick end labeling，TUNEL)技术的细胞凋亡检测方法。
该方法通过在细胞凋亡时，末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP-nick end labeling，TUNEL)将标记物dUTP标记在DNA的3'末端，然后使用荧光显微镜观察标记物的荧光强度。
该方法的优点是操作简便，结果准确可靠，适用于多种样本类型的细胞凋亡检测。
二、Annexin V-FITC/PI双染法Annexin V-FITC/PI双染法是一种流式细胞术检测细胞凋亡的方法。
该方法通过Annexin V结合细胞膜上的磷脂酰胆碱(PS)和PI结合细胞核DNA，将细胞分为四个区域：Annexin V-FITC(-)/PI(-)区域表示正常细胞；Annexin V-FITC(+)/PI(-)区域表示早期凋亡细胞；Annexin V-FITC(+)/PI(+)区域表示晚期凋亡细胞；AnnexinV-FITC(-)/PI(+)区域表示坏死细胞。
该方法的优点是高灵敏度和高特异性，可以同时检测细胞凋亡和坏死。
三、DNA Ladder检测DNA Ladder检测是一种检测细胞凋亡的传统方法。
该方法通过电泳分离DNA，检测DNA的大小和形态是否发生变化，如出现约180bp 的DNA片段，则提示细胞凋亡。
该方法的缺点是需要较多的细胞样本，且不能区分细胞凋亡的早期和晚期。
四、Caspase活性检测Caspase是细胞凋亡的重要调节因子，Caspase活性检测是一种检测细胞凋亡的方法。
该方法通过检测Caspase活性的改变来判断细胞凋亡的程度，如Caspase-3活性增加，则提示细胞凋亡。
Annexin V-FITC-PI Apoptosis Detection Kit细胞凋亡
Apoptosis Detection Kit
Vazyme Biotech Co., Ltd
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4.1 样品染色
6/操作注意事项
1. 由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析。 2. 对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集 漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色；处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤 细胞，胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI 摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨 酸与Annexin V-FITC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接 触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大 ，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应尽量不用EDTA，EDTA影响Annexin V与PS 的结合。 3. 实验中如需要固定细胞，比如在检测凋亡的同时检测细胞周期，只能选用Annexin V-FITC，不能选用Annexin V-EGFP，因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发 荧光的能力。固定前需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育，并用Binding Buffer洗 掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加并会产生细胞碎片，可 以和Annexin V结合，对结果产生干扰。 4. 如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与 Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗 去血小板。 5.试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 6. Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。
AnneinV,PI双染方法
Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。
用标记了FITC的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。
Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。
将AnnexinⅤ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。
离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基；用冷PBS洗涤细胞两次；用400ul 1X Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1 X 10 cells/ml；在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。
5. 加入10ul PI后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟；在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
使用流式细胞仪正确分析Annexin V-FITC/PI双染的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。
因为荧光补偿设置与PMT的电压直接相关，所以不同仪器之间的补偿不同。