大肠、沙门、志贺菌的培养与鉴定1
沙门菌和志贺菌鉴定流程
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在进行沙门菌和志贺菌鉴定之前，首先要进行准确的样本采集。
沙门氏菌和志贺氏菌的检测ppt文档
肠杆菌科共同特性
相似的形态染色 G-小杆菌，有鞭毛(痢疾杆菌外) 菌毛，某些有荚膜，无芽胞
简单的培养条件 需氧或兼性厌氧，营养要求不高
活泼的生化反应 致病菌 非致病菌
乳糖 发酵 实验
阴性 阳性
SS琼脂培养基
（含胆盐、乳糖、中性红等）
4、抗原构造复杂
鞭毛抗原（H） IgG
K或Vi抗原
菌体抗原（O） IgM
沙门菌检测
• 美国细菌学家Salmon与Smith于1885年分离 出猪霍乱沙门菌。1990年为纪念Salmon，定 名这类细菌为沙门菌属。
• 沙门菌是肠杆菌科的重要致病菌。包括伤寒、 副伤寒甲、乙、丙型，肠炎，鼠伤寒等沙门菌， 现今已发现2324个血清型。
• 在世界各地的食物中毒中，沙门菌食物中毒常 占首位或第二位。规定在药品和食品中不得检 出沙门菌。美国每年报道病例45 000个左右， 实 际 数 量 可 能 多 达 200-300 万 。 伤 寒 每 年 400-500例。
➢ H抗原：为不稳定的蛋白质抗原，加热或用乙 醇处理均被破坏。沙门菌H抗原有两个相,第一 相特异性较高称特异相,用小写英文字母a、b、 c表示，直至z，z以衙用z加阿拉伯数字表示， 如z1、z2、z3等，第二相抗原为沙门菌共有， 称非特异相，直接用1、2、3表示。同时有第 一相和第二相H抗原的细菌称为双相菌，仅有 一相者称单相菌。H抗原是定型的依据，其刺 激机体产生的抗体以IgG为主，与相应的抗血 清呈絮状反应。
抗原构造
• 菌体抗原（o）：不被乙醇、0.1%石炭酸所破 坏。与特异性抗血清呈颗粒状凝集，形成慢， 不易摇散。现已知有50多种，多数沙门菌含有 两种以上的O抗原，有的O抗原是一种菌独有 的，有的是几种菌共有的，凡含有共同特异性 抗原成分的血清型归为一个群，可将沙门菌化 分为42群，按A-Z排列，Z以后的顺序以O51O67表示。引起人类沙门菌病的95%以上都在 A-F 6个群内。
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案实验原理：1、大肠杆菌的性质：大肠杆菌是G--无芽孢直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。
在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。
三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。
生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。
MR试验，吲哚试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S，不能利用枸椽酸盐。
半固体中沿穿刺线向四周生长。
2、沙门氏杆菌的性质：沙门氏杆菌是G-直杆菌。
在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。
能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产吲哚，不分解尿素。
实验材料：含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SC）、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油）实验内容及操作程序：一、培养基制备：制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备：（1）取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。
（2）用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。
（3）用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37°C恒温培养24小时。
三、细菌分离培养：（1）取出培养了24小时的麦康凯平板。
挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37°C 恒温培养24小时。
（2）取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37°C恒温培养24小时。
四、细菌的鉴定纯化：（1）检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。
肠道致病菌的检验与鉴定方式
5、沙门氏菌哪几个菌型具有Vi抗原，Vi抗原对O抗原 血清涟试验有何影响，对含Vi抗原菌，如何做O抗 原血清学试验。
6、沙门氏菌在SS平板，T分离纯化后怎样选用最少的生化试验方法初步鉴 定检验菌是否是沙门氏菌属的细菌。
8、如何进行沙门氏菌的血清学试验。
肠道致病菌的检验与鉴定方式
（1）三糖铁培养的培养
典型沙门氏菌在三糖铁培养上的特征： 表面（-）粉红色、底层（+）黄色、 H2S （+）底层有黑色、有动
力。 在TSI培养基中：表面（+）黄色、 H2S （-）的培养物可排除，其
它培养物均有可能是沙门氏菌。
肠道致病菌的检验与鉴定方式
（2）其余四项生化实验
甘露醇+
靛基质- 靛基质+
乳糖-
乳糖+
靛基质-
靛基质+
靛基质-
痢疾志贺 痢疾志 氏菌1、3、 贺氏菌 4、5、6、 2、7、 9、10型 8型
福氏6型， 鲍氏1、2、 3、4、5、 6、8、10、 12、14型
福氏痢疾菌
（1、2、3、4、
5型）鲍氏5、 宋氏志 7、9、11、13、 贺氏菌 15型
肠道致病菌的检验与鉴定方式
肠道致病菌的检验与鉴定方式
4、表面抗原：
沙门氏菌有三种：Vi、M、5抗原、K抗原 Vi抗原位于菌体的最表层，包围了O抗原，可阻碍O抗原的血清
学凝集试验。破坏Vi抗原：60℃ 30′，100 ℃ 5′ 含有Vi 抗原的沙门氏菌：
伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌
肠道致病菌的检验与鉴定方式
肠道致病菌的检验与鉴定方式
肠道致病菌的检验(沙与鉴门定方氏式 菌（红色）侵入人体细胞
肠杆菌科细菌的培养与鉴定
－
＋＋
－
－
普通变形杆菌 K/A ＋ ＋ ＋ F ＋ ＋ － －/+ ＋
＋
＋－
－
－
奇异变形杆菌 K/A ＋ ＋ ＋ F － ＋ +/－ +/－ ＋
＋
＋－
＋
－
志贺菌
K/A － － － F －/＋ ＋ － － ＋
－
－－
－
－
沙门菌
K/A ＋ ＋ ＋ F － ＋ － ＋ ＋
－
－＋
＋ +/－
注：A：产酸；K：产碱；+：90%以上菌株阳性；-：90%以上菌株阴性；+/-： （50-90）%菌株阳性；-/+：（50-90）%菌株阴性；沙门菌与志贺菌除鉴定到种以 外，还应进行和特异性血清凝集实验鉴定血清型。
大肠埃希菌生化鉴定反应结果
肺炎克雷伯菌(K. Peumoniae)
革兰染色为阴性杆菌，大小为(0.3-1.5) μm×(0.66)μm。单个、成双或短链状排列。可见透明环状荚膜。
革兰阴性杆菌荚膜
肺炎克雷伯菌(K. Peumoniae)
在血琼脂平板上培养18-24h，形成较大、粘、圆形、凸 起、灰白不溶血的大菌落。
沙雷菌属(Serratia)
血平板上形成光滑、湿润、圆形、中心呈颗粒状的菌落。 大多不透明，可呈现白色、粉色、红色菌落。
血平板上黏质沙雷 菌落形态
巧克力平板上黏质 沙雷菌落形态
总
结
肠杆菌科细菌生化鉴定反应选择：氧化酶、触酶、克氏双 糖铁、半固体、甲基红、V-P、枸橼酸盐、苯丙氨酸脱氨 酶、硝酸盐、尿素、赖氨酸脱羧酶(LYS)、鸟氨酸脱氨酶 (ORN)、精氨酸脱氨酶(ARG)。
沙门氏菌和志贺氏菌的检测
生化反应
初步鉴别：三糖铁琼脂
乳糖:蔗糖:葡萄糖=10 : 10 : 1
以酚红作指示剂 当待检菌发酵乳糖或蔗糖时，产酸量多，使整个培养基均呈黄
色；如仅发酵葡萄糖，则产酸少，斜面由于细菌生长分解蛋白 胨而释放氨，酚红显碱性红色、而底层黄色 细菌对培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸钠的还原作用，生 成硫化氢。硫化氢遇硫酸亚铁或柠檬酸铁铵产生不溶性黑色硫化 亚铁。
3）败血症 ：常由猪霍乱沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙 门菌、肠炎沙门菌等引起。有高热、寒战、贫血等严重症状。多见 于儿童及免疫力低下者。
免疫性：主要依靠细胞免疫，牢固。
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二、微生物学检查
• 标本采集
根据疾病的类型、病情和病程的不同分别采集不 同的标本。分离培养原则上于发病第1周采血，第2 周取粪便或尿液，全程均可作骨髓培养。血清学诊
概述 肠道感染细菌
❖肠道感染细菌是通过粪-口传播途径进行传播的一类 细菌。
❖主要包括肠杆菌科细菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、 幽门螺杆菌等。 ❖肠杆菌科中与医学有关的包括：埃希菌属、志贺菌属、 沙门菌属、变形杆菌属等。
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肠杆菌科共同特性
相似的形态染色 G-小杆菌，有鞭毛(痢疾杆菌外)
一般情况下，伤寒沙门菌O抗体的凝集价应在1∶80以上，H抗体凝集 价在1∶160以上，引起副伤寒沙门菌H抗体凝集价在1∶80以上才有 诊断意义
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抗原构造
• 菌体抗原（o）：不被乙醇、0.1%石炭酸所破坏。与
特异性抗血清呈颗粒状凝集，形成慢，不易摇散。现 已知有50多种，多数沙门菌含有两种以上的O抗原， 有的O抗原是一种菌独有的，有的是几种菌共有的， 凡含有共同特异性抗原成分的血清型归为一个群，可
13、大肠杆菌 志贺菌 沙门氏菌属
一大群居住在人和动物肠道中 生物学性状近似的革兰阴性杆菌
多数是肠道的正常菌群
少数为致病菌， 是胃肠传染病的最重要病原菌
肠杆菌科中与医学有关的常见菌属
菌属 埃希菌属 志贺菌属 沙门菌属 变形杆菌属 代表种 大肠杆菌 痢疾志贺菌 伤寒沙门菌 普通变形杆菌
肠 道 杆 菌共同特性
防治原则
口服减毒活菌苗 治疗可用氯霉素等
三、 志贺菌属
是细菌性痢疾的病原菌，通称痢疾杆菌。 形态 无鞭毛（动力试验阴性）有菌毛 生化反应
多数不分解乳糖
对理化因素的低抗力 低于其他肠道杆菌，对酸敏感
抗原与分类 菌种 痢疾志贺菌
福氏志贺菌
根据O抗原分类 群 A
B
分为4群39个血清型（包括亚型）
型 1~10
菌体抗原（O）
5、抵抗力： 不强，对热和化学消 毒剂敏感
一、大肠 埃希菌
是人类和动物肠道中的正常菌群
出生后数小时进入肠道，在肠道中能合 成维生素B和维生素K等供机体吸收利用， 并终生伴随。
为正常菌群，一般不致病
两大原因可以致病 1、条件致病
细菌居住部位改变引起的肠外感染：
尿路感染最常见
2、部分致病菌株
防治原则
控制传染源
切断传播途径 隔离病人，治疗无症状携带者 加强水源管理 疫苗预防接种
提高易感者免疫力 治疗霍乱的关键
及时补充液体和电解质，加抗生素治疗 预防大量失水导致的低血容量性休克和酸中毒
二、副溶血弧菌
1、生物学特性
嗜盐 在培养基中以含3.5%NaCl生长最为适宜 革兰染色阴性、单鞭毛
2、致病性
身中毒症状。
慢性细菌性痢疾：病程迁延二个月以上
微生物学检查
大肠杆菌与沙门氏菌鉴定
大肠杆菌与沙门氏菌的鉴定08动检1班：魏静翟阿官李盼盼尚延丽田方方崔亚婷一、实验目的与要求1、通过本实验了解大肠杆菌及沙门氏菌的主要生化特性与培养特性2、掌握大肠杆菌与沙门氏菌的鉴别方法二、实验器材及试剂温箱、显微镜、载玻片、营养琼脂、接种环、灭菌平皿、麦康凯培养基、无菌试管、伊红美兰培养基、三糖铁培养基、革兰氏染色剂、棉签、火柴等三、实验内容1、直接镜检法：1）操作步骤：a）用棉签沾取适量样液直接涂在载玻片上b）用革兰氏染色剂染色c）显微镜下观察2）预期实验结果：a）大肠杆菌：大肠杆菌为革兰氏阴性菌，中等大小，两端略圆的短粗杆菌，成单个存在，也有成双排列；周身鞭毛，能运动，有时两端着色较浓，要注意与巴氏杆菌区分开来。
b）沙门氏菌：沙门氏菌也为革兰氏阴性菌，无芽孢，大小通常为0.7~1.5um*2.0~5.0um，菌端钝圆，散在，偶有短丝状，无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外均有周身鞭毛，能运动，绝大多数菌株有菌毛。
2、分离培养法：将样液分别划线接种在麦康凯培养基、伊红美兰培养基上，温箱培养24h后观察生长情况，根据菌落的形态、颜色、大小等方面的差异来鉴别大肠杆菌和沙门氏菌。
1）麦康凯培养基（预期实验结果）：a）大肠杆菌：鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润；b）沙门氏菌：无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色。
2）伊红美兰培养基（预期实验结果）：a）大肠杆菌：紫黑色菌落，有的有金属光泽b）沙门氏菌：形态特征与在麦康凯培养基上的相似2、三糖铁培养基穿刺试验1）操作方法：将待检样液穿刺接种于三糖铁培养基中，培养18~24h后，取出观察2）预期实验结果：a）大肠杆菌：穿刺后不变黑，表面呈黄色b）沙门氏菌：穿刺底部有气体，穿刺后变黑，中间为黄色表面为红色3、乳糖发酵试验1）操作方法：将待检样液接种于乳糖发酵管内放于温箱内培养18h后，观察结果2) 预期实验结果：a）大肠杆菌：产酸产气b）沙门氏菌：不产酸产气。
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生化反应
①大肠埃希菌：ａ、氧化酶试验（－） b、KIA：ＡＡ＋－ c、MIU：++②沙门菌： ａ、氧化酶试验（－） b、 KIA：ＫＡ－ ＋／－ c、 MIU：＋－－ ③志贺菌：ａ、氧化酶试验（－） b、KIA:ＫＡ－－ c、MIU:－＋－
血清学试验
志贺菌属的分型鉴定：凡生化反应符合志 贺菌者均需做血清学鉴定。 结果报告： ａ、分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符 合志贺菌鉴定依据者可报告“未分离 到志贺菌属细菌”。 b、经分离鉴定后符合鉴定依据者，可报 告“分离出× ×志贺菌”。 c、经进一步做多种生化反应及和血清学 鉴定报告：“分离出××志贺菌的×型”
血清学试验
沙门菌属的分型鉴定：如果生化反应及形态学检 查疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进 行玻片凝集。 结果报告： a、分离培养未发现可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌 属细菌鉴定依据者，可报告“未分离出沙门菌”。 b、生化反应符合沙门菌、玻片凝集试验结果阳性， 可初步报告为：“分离到××沙门菌”，或“××群 沙门菌”。
步骤与方法
１、形态观察：均为G-杆菌，镜下无多大区 别。
步骤与方法
2、菌落观察 ①大肠埃希菌：a.血平板：灰白色、圆形、 湿润，有的可出现溶血环。b.麦康凯或SS 平板平板：红色菌落。
步骤与方法
2、菌落观察 ②沙门菌属：a.血平板: 灰白色、圆形、湿润。 b. 麦康凯或SS平板:无色、透 明，有的菌属在SS平板上 可形成黑色菌落. ③志贺菌属：麦康凯或 SS上无色透明、中等大小 的菌落。
大肠、沙门和志贺 菌的鉴定
临床微生物学教研室
目的与要求
1、掌握大肠埃希菌、沙门菌属和志贺菌属的 菌落形态、染色特性、培养特性及常见鉴 定实验。 ２、掌握沙门菌属和志贺菌属细种：普通大肠埃希菌、福氏志贺菌和 肠炎沙门菌。 2、培养基：血平板、MAC、SS、中国兰平 板、 KIA等等。 3、试剂：氧化酶试剂、诊断血清、细菌微量 生化管等。 4、其他：载玻片、生理盐水、革兰染液等。