慢病毒载体构建步骤
慢病毒载体构建步骤
一、简介慢病毒〔Lentivirus〕载体是以HIV-1〔人类免疫缺陷I型病毒〕为根底发展起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞
均具有感染水平.慢病毒载体的研究开展得很快,研究的也非常深入.该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而到达持久性表达.目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中.由于有些类型细胞脂质体转染效果差,转移到细胞内的siRNA半衰期短,体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制.采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体,然后转
移到细胞内转录siRNA的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用.慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病
毒,在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA,
实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默,为在
原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能,以及产生特定基因表达降
低的动物提供了可能性.慢病毒作为siRNA的携带者,不但具备特异性地使基因表达沉默的水平,而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势,为基因功能的研究提供了更强有力的工具.在所构建的siRNA表达载体中,是由RNA聚合酶田启动子来指导RNA合成的,这是由于RNA聚合酶田有明确的起始和终止序列,而且合成的RNA不会带polyA尾.当RNA聚合酶田遇到连续4个或5个T时,它指导的转录就会停止,在转录产物3'端形成1~4个U.U6和H1RNA启动子是两种RNA 聚合酶田依赖的启动子,具特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达〜21ntRNA 和〜50ntRNA茎环结构〔stemloop〕.在siRNA表达载体中,构成siRNA的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA;也可由载体直接表达小发卡状RNA 〔smallhairpinRNA,shRNA〕,载体包含位于RNA聚合酶ID启动子和4~5T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可折叠成具有1〜4个U3'突出端的茎环结花在细胞内进一步加工成siRNA. 构建载体前通常要通过合成siRNA的方法,寻找高效的siRNA,然后从中挑选符合载体要求的序列,将其引入siRNA表达载体〔筛选〕.二、实验流程〔大致的简单过程〕慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息.慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白.为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体〔自己构建〕和包装质粒〔购入〕同时共转染细
胞,在293T细胞〔购入〕中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整
合到基因组,从而高水平的表达效应分子.大致的实验流程:1.
根据目的基因相关信息〔序列,序列号等〕,构建含有外源基因或siRNA的重组载体;〔即质粒构建,已构建好,质粒可以永久保存〕2.对于测序正确的重组质粒,提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3.使用高效重组载体和病毒包装质粒〔购入〕共转染293T细胞［1］,进行病毒包装和生产,收集病毒液;4.浓缩、纯化病毒液;5.用高质量的病毒液感染细胞〔293T细胞〕;6.通过定量PCR精确测定病毒滴度〔高精确滴定方法〕和Western分析实验结果;7.用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选,通常状况下,筛
选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性.病毒液足够用于一般的动物活体实验.
三、重组质粒构建流程1.基因的获得：shRNA寡核甘酸序列的设计和合成〔将正确序列克隆入载体中,退火形成双链,PCR扩增〕2.回收A.酶切产物的胶回收：一般做50-100ul体系,然后跑电泳回收,回收量一般为30ul.扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段,别离目的条带DNA,然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块,利用胶回收试剂盒回收纯化DNA 片段.试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理,
配备设计独特的离心吸附柱式结构,
使用常规台式高速离心机,在几分钟之内即可以高效回收核酸片段.实验仪器:1、琼脂糖凝胶电泳系统2、紫外观察分析仪3、离心机4、单面刀片5、恒温水浴锅试剂：1、DNA回收试剂盒［2］2、50XAE［3］〔电泳缓冲液Tris-乙酸〕3、ddH2O4、琼脂糖凝胶［4］步骤：1〕使用TAE 缓冲液制作琼脂糖凝胶,然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳〔别离DNA作用〕［5］.2〕在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块,尽可能除去多余的琼脂糖.放入离心管中.3〕按每100mg琼脂糖参加300—600仙l溶月部比例参加溶胶液〔本实验加500ul〕,置55C水浴10分钟,使琼脂糖块完全溶化,期间每2分钟颠例混匀一次促溶.
4〕将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱,12000rpm室温离心1分钟,倒掉收集管中的液体.再将吸附柱放入同一个收集管中.5〕在吸附柱中参加500uI漂洗液,室温
静置1分钟后,12000rpm室温离心30秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中.6〕再在吸附柱中参加500uI漂洗液,12000rpm室温离心15秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中.7〕12000rpm室温空离心1分
钟.8〕将吸附柱放入一个干净的的离心管中,在吸附膜中央参加30ul洗脱缓冲液,室温静置2分钟后,12000rpm室温离心1分钟〔为提升回收效率可再洗脱一次〕,将离心管〔DNA〕贮存于-20C.9〕琼脂糖凝胶电泳〔鉴定作用〕检测回收产物.注意事项：1〕切胶时应快速操作,在紫外灯下时间
长容易伤害到眼睛；2〕澳化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏,故尽量放置于暗室,切带时应使用长波长紫外灯,切胶时间尽量短.3〕胶块一定要充分融化,否那么将会严重影响DNA的回收率.4〕把洗脱液加热,使用时有利于提升洗脱液效率3.连接器材:旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,微量离心管,双面离心管架,台式离心机,干式恒温气浴.试剂：T载体,T4DNA连接酶,连接酶缓冲液,无菌ddWater.操作步骤：PCR产物〔已纯化回收〕与T载体直接连接:〔1〕事先将干式恒温仪〔或冰盒里的水〕温度设定在14~160C〔2〕取4个灭菌的200ul微量离心管,参加:〔需要调整〕4ml目的基因；1mlT载体；T4DNA连接酶〔TAKARA,350U/ul〕;1ml连接酶缓冲液
10xbuffer;mlddWater,总量10ml体
系.〔3〕上述混合液轻轻震荡后再短暂离心,然后置于14°C干式恒温微140C水中〕中保温过夜〔12-16h〕.〔4〕连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4.C
冰箱备用.4.转化原理：目前,感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备,即用低渗CaCl2溶液在低温〔0C〕时处理快速生长的细时获得感受
态细菌.此时细菌膨胀成球形,外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌外表,通过热激作用促进细胞对DNA的吸收.在一定条件下,经过连接后的DNA片段与感受态细胞混合保温,可以进入感受态细胞.进入感受态细胞的DNA分子通过复制、表达,实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状.将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体,即带
有异源DNA分子的受体细胞.目的：连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增,然后提取质粒.器材：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪.
试剂：固体和液体培养基[7]2.含特定抗生素的LB固体培养基CaCl2溶液.4.待转化质粒大肠杆菌感受态细胞制备步骤：1〕从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB液体培养基,37C振荡培养邳h左右〕,直至对数生长期.2〕取菌液转接
至U40mlLB液体培养基中,37C振荡培福h,至OD600值到达之间.3〕菌液转
移到50ml离心管中,冰上放置10min.4〕4C离心0min〔4000r/min〕5〕倒出培养液,将管口倒置以便培养液流尽6〕用冰浴的L氯化钙10ml悬浮细胞,立即冰浴30min7〕4C离心0min〔4000r/min〕8〕倒出上清液,用冰浴的L氯化钙2ml悬浮细胞〔冰上放置〕9〕分装细胞,200ul一份,4C保存.暂且不用的贮存于-70C可保存半年.取其中一份进行转化.质粒DNA的转化1〕取200ul新鲜制备的感受态细胞,参加质粒
DNA2ul混匀,冰浴30min2〕离心管放到42c水浴锅中保温90s〔90s一定要精确,不要摇动试管〕3〕将试管迅速转移到冰浴,冷却1-2min4〕每管加800ulLB液体培养基,37C培端5〕取适当体
积〔100ul〕的复苏细胞,涂布在含有适当抗生素的LB固体培养基上,用灭过菌的玻璃棒涂布均匀,室温正置30min6〕倒置平皿37C,12~16h,出现菌落为了提升转化效率实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度：细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600来限制.2.质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA〔cccDNA〕.
一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%.3.试剂的质量：所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的〔GR.或AR.〕,并用
超纯水配制,最好分装保存于枯燥的冷暗处.4.预防杂菌和杂DNA的污染:整个
操作过程均应在无菌条件下进行.5.抽提质粒〔碱裂解法提取质粒DNA〕原理:本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备.十二烷基磺酸钠〔SDS〕是一种阴离子外表活
性剂,它既能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变性.1〕用SDS处理细菌后,会导致细菌细胞破裂,释放出质粒DNA和染色体DNA.两种DNA在强碱环境都会变性.2〕当参加的酸性乙酸钾降低溶液pH值后质粒DNA将迅速复性,而染色体DNA分子巨大,难以复性.3〕通过离心,大局部细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质沉淀〔SDS的作用下〕除去,而质粒DNA留在上清中.4〕再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤,可得到纯化的质粒DNA.纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质.例如,氯化葩-澳化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时.对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除剩余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求,故在分子生物学实验室中常用.试剂：1.溶液I:50mMmmol/L〕葡萄糖,25mMTris-HCl〔pH,10mMEDTA〔pH.1MTris-HCl〔pH,EDTA 〔pH10ml,葡萄糖加ddH2O至500ml.在10lbf/in2高压灭菌15min,贮存于4C.2.溶液H:NaOH,1%SDS2NNaOH1ml,10%SDS1ml,加ddH2O至10ml.使用前临时配置〔NaOH作用是使细胞裂
解〕.3.溶液田：醋酸钾〔KAc〕缓冲液,pH.5MKAc300ml,冰醋酸,加ddH2O至500ml.4c保存
1MTris-HCl(pH1ml,
备用.4.TE:10mMTris-HCl(pH,1mMEDTA(pH
EDTA(pH,力口ddH2O至100ml.15lbf/in2高压湿热灭菌
20min,4C保存备用.5.苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)6.乙醇(无水乙醇、70%乙醇)7.5XTBE:Tris〞54g,
硼酸,EDTA-Na2•2H2O,ddH2O至1000ml.15lbf/in2高压湿热灭菌20min,4C保存备用.8.澳化乙锭(EB):10mg/mlA(RNA酶A):不含DNA酶(DNase-free)RNaseA的10mg/ml,TE配制,沸水加热15min,分装后贮存于-20Co10.6xloadingbuffer(』梯缓臊淹,％二甲苯青FF,40%(W/V)蔗
糖水溶液.11.1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中,加100mlXTBE,微波炉加热至完全溶化,冷却至60c左右,加EB母液(10mg/ml)至终浓度g/ml(注意:EB为强诱变剂,操作时带手套),轻轻摇匀.缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中,勿使有气泡,静置冷却30min以上,轻轻拔出梳子,放入电泳
槽中(电泳缓冲液xTBE),即可
上样.仪器：(1)塑料离心管架(30孔);(2)10、100、1000L微量加样器;(3)塑料离心管(又称EPPendorf 离心管);(4)低温高速离心机(20000r/min)一台;(5)无菌工作台(6)高压锅,(7)常用玻璃仪器及滴管等.质粒提取步骤:1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落,接种于LB(含相应抗生素)液体培养基
中,37250g振荡培养过夜(约
12-14hr).2.取培养物入微量离心管中,室温离心8000gx1min,弃上满■离心管倒置,使液体尽可能流尽.3.将细菌沉淀重悬于100l预冷的溶液I(50mM糖,25mMTris-HCl(pH,10mMEDTA(pH) 中,剧烈振荡,使菌体分散混匀,(且不至于沉淀).4.加200叱l新鲜配制的溶液II,颠倒数次混匀(不要剧烈振荡),并将离心管放置于冰上2-3min,使细胞膜裂解(溶液II为裂解液,故离心管中菌液逐渐变清).5.参加150^l预冷的溶液加(醋酸甲
AcK),将管温和颠倒数次混匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置3-5min.溶液田为中和溶液,此时质粒DNA复性,染色体和蛋白质不可逆变性,形成不可溶复合物,同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀.6.参加450叱l的烈酿仿/异戊醇,振荡混匀,4C离心12000gX10min.没有PDS沉淀干净的蛋白质置于下层7.小心移出上清于一新微量离心管中,参加倍体积预冷的无水乙醇,混匀,室温放置
2-5min,4C离心12000gx15min.预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次,4C离心8000gx7min,弃上清,将沉淀在室温下晾干.9.沉淀溶于20叱lTE(RNaseA20叱g/ml),37C水浴
30min以降解RNA分子,-20C保存备用.6.重组质粒克隆的鉴定1)通过PCR方法鉴定:以重组质粒为模板,PCR产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR扩
增后电泳鉴定.2)酶切鉴定:双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目
的条带就行了7.质粒DNA的含量及纯度鉴定实验材料：质粒DNA仪器:〔1〕稳压稳流电泳仪⑵可调微量移液器〔3〕水平电泳槽⑷紫外分光光度计〔5〕紫外透射仪等试剂：〔1〕电泳缓冲液:Tris-硼酸〔1xTBE〔2〕加样缓冲液〔6X〕：%,曲酚飕糖〔3〕
澳化乙锭〔EB〕溶液:10mg/ml含量测定:紫外吸收法澳化乙锭荧光强度法纯度鉴定：紫外吸收法和琼脂糖凝胶电泳测定DNA浓度的方法有两种：紫外光吸收法：核酸在260nm处具有强吸收峰,所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量.但有时也会由于所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同.因此,一般在中性pH值左右的环境中进行测定.这种方法常用于测定比拟纯的样品.澳化乙锭荧光强度法:当DNA含量很低以及样品中杂质含量高时,会影响紫外光吸收值的测定,这时,可以采用测定嵌入DNA中澳化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度,因
为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比.测定质粒DNA纯度的方法琼脂糖凝胶电泳四、慢病毒包装流程实验材料、细胞株：293T,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养基为DMEM［8］〔含10%FBS〕.贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞.、菌株：大肠杆菌菌株
DH5ao用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒.、病毒载体系统组成a〕pGC-LV重组载体〔已制备好的〕;b〕pHelper;c〕pHelperDNA溶液的制备〔见上面具体步骤〕:质粒DNA溶于除菌的TE中,以紫外光吸收法测定其浓度及纯度,保证所提质粒DNA的A260/A280在〜之间.、试剂台盼兰、胎牛血清FBSDMSO、DMEM、胰酶、Lipofectamine2000、仪器荧光显微镜、CO2培养箱、生物平安柜、Plus-20离心超滤装置病毒包装细胞293T的培养、活细胞计数〔台盼蓝染色〕用无血清培养基把细胞悬液稀释到200〜2000个/ml〔一般稀释倍数为100彳^〕,在的细胞悬液中参加ml的％的台盼兰溶液.轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞.活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞.、细胞株的冻存1.取培养2〜3天生长旺盛的细胞,
用细胞培养液将细胞配成2X106~2X107/m2.在.1ml细胞冻存管中参加ml细胞悬液,ml小牛血清和ml二甲基亚碉［9］〔或甘油〕,混匀后密封.置4C1小日中20C2小时然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中.、细胞复苏1.从液氮罐中取出细胞冻存管,应带有防护眼睛和手套.2.迅速放入盛有37c水的水浴中,并不时摇动,尽快解冻.3.用70%酒精擦拭消毒后,移至净化台上,吸出细胞悬液至培养瓶中,补加3ml含10%FBS〔胎牛血清〕的DMEM培养基,置温箱培养.4.次日更换一次培养液后再继续培养.、细胞传代1.弃去旧培养液,参加5ml灭
菌PBS溶液,轻轻晃动,洗涤细胞生长面,然后弃去PBS溶液.2.参加2ml胰酶消化液,消化1-2min 直到细胞完全消化下来.
3.参加含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM培养基5ml,用刻度吸管吹打数次,
将瓶壁上的细胞冲洗下来.4.混匀细胞后分至两个新的培养瓶中,继续培养.慢病毒包装细胞转染1〕转染前24h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,以含10%血清的培养基调整细胞密度为x107细胞/20ml,重新接种于15cm细胞培养皿,37.6%CO2培养箱内培养.24h待细胞密度达70%~80%时即可用
于转染.细胞状态对于病毒包装至关重要,因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次
数.2〕转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基.3〕向一灭菌离心管中参加所制备的各DNA 溶液〔pGC-LV载体20叱g,pHelper15载体g,pHelper载体10g〕,与相应体哪ti-MEM[10]混合均匀,调整总体积为
ml,在室温下温育5分钟.4〕将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀,取100l
Lipofectamine2000试剂在另一管中与mlOpti-MEM混合,在室温下温育5分
钟.5〕把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合,轻轻地颠倒
混匀,不要振荡.必须在5分钟之内混合.6〕混合后,在室温下温育20分钟,以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物.7〕将DNA与
Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中,混匀,于37C,5%
CO2细胞培养箱中培养.8〕培养8h后倒去含有转染混和物的培养基,每瓶细胞加入20ml的PBS 液,轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤剩余的转染混和物,然后倒
去.9〕每瓶细胞中参加含10%血清的细胞培养基25ml,于37C、5%CO2培养箱内继续培养48小时.病毒的收获及浓缩1.收集转染后48小时〔转染即可为0小时计起〕的293T细胞上清液.2.于4C,4000g离0min,除去细胞碎片.3.以11m滤器过滤上清液于40ml超速离心管中.4.把病毒粗提液样品参加到过滤杯中〔最多19ml〕,盖上盖子.将过滤杯插到滤过液收集管中.
5.组合好后,做好平衡,放在转头上.
6.在4000xg际需要的病毒浓缩体积.通常需要的时间为10-15分
钟.
7.离心结束后,取出离心装置,将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开.
8.将过滤杯倒扣在样品收集杯上.
9.离心力不超过1000g,时间为2分钟.过高转速会导致样品损失.把离心杯
从样品收集杯上移开.样品收集杯中的即为病毒浓缩液.10.将病毒浓缩液移出,分
装后保存在病毒管中,-80度长期保存.取其中一支进行病毒生物学滴度测定.
慢病毒滴度测定1)孔稀释法测定滴度1.测定前一天,为测定滴度所需的细胞(英茂盛业公司用的293T细胞:贴壁生长)铺板,96孔板,每个孔加4X104个细胞积为100仙12.根据病毒的预期滴度,准备7〜10个无菌的Ep管.在每个管中参加90仙1的无血清培养鸭.取待测定的病毒原液10仙1参加到第一个管甜匀后,取10仙1参加到第二个管中.继续相同的操作直到最后一管4选取所需白^细胞孔,吸去90仙1培濠黑.参加90仙1稀释好的病毒溶液.放入培养箱培养.小时
后,参加完全培养基100仙1.小心操祚要吹起细胞.天后,观察荧光表达情况.
荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少.说明：第一个Ep管中参加10u1病毒原液,记为1E+1叱1;第仔管中进行了第一次十倍稀释,所得病毒原7夜为第一个Ep中的1/10,记为1E+0N1;第任p 管中进行了第二次十倍稀释,所得病毒原液为第二个Ep中的1/10,记为1E-1叱1;依次类推•…郎噌伸进行了第六次十倍稀释,所
得病毒原液为第六个Ep中的1/10,记为1E-5仙1;第/Ep管中进行了第七次十倍稀释,所得病毒原7为第七个Ep中的1/10,记为1E-6N1;2)Rea1timePCR8显
测定滴度样品制备1.检测前一天,对293T细胞传代,每个24孔中加1X105个细胞,体积为5001;2.次日,准备7〜10个无菌的Ep管,在每个管中参加901的培养
基(DMEM+10%FBS);3.取待测定的病毒原液10仙1参加到第一个管箱匀后,取10仙1参加到第二个管中.继续相同的操作直到最后一锅.选取所需白^细胞孔,吸去90仙1培养基.参加稀释好的病毒溶液.放37C5%CO2培养箱中培养；
5.48小时后,参加新鲜培养基500仙1.小心操体要吹起细胞;
6.4天后,抽提
RNA准备做RT-qPCR.总RNA抽提说明：根据Invitrogen公司的TRIZOL操作
说明书进行,均为RNase-free操作.1.去细胞上清,每孔参加1m1
TRIZOL吹打,室温静置5min,后转移至另一新的m1移液管中.2.每管参加2001氯仿,用力震荡15s,室温静置15min.3.4C,12000rpm,1M!n.4.
从每管中吸取上清至另一新的m1移液管.参加等体积-20C预冷的异丙醇,混匀后-20C沉淀10min.
5.4C,12000rpm离心10min后,去上清.
6.参加至少1m14C预冷的5%乙醇,洗涤沉淀及离心管壁.
7.4C,10000rpm离心5min,弃上清.
8.4C,10000rpm再次离心5min,吸去残液,室温枯燥〔不需完全枯燥〕.
9.参加20lRNase-free水[11],至完全溶解,紫外分析测定所抽提RNA的浓度.五、慢病毒感染目的细胞慢病毒感染目的细胞预实验考前须知A.测定慢病毒
对目的细胞的亲嗜性时,需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞〔HEK293T,Hela〕作为平行实验的对照细胞.B.在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基〔培养目的细胞用〕稀释;理论上,含有血清,双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率.慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞.参加puromycin[12]可以筛选稳定表达shRNA的细胞系.puromycin最优浓度筛选：每种细胞对puromycin的敏感性不同,因此,准备建立稳定细胞系之前,需要确定能够在3-5天杀死细胞的最优puromycin浓度.方法如下：1.在6孔板内种植细胞,约2x105/孔,共十孔,CO2孵箱过夜培养.2.第二天,观察细胞密度为80%-90%融合.稀释puromycin至培养基,根据从1g/ml到10g/ml,每隔1g/ml递增的浓度,加至培养孔内.3.第三天观察细胞,每隔一天换一次培养基,最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度.慢病毒感染细胞和稳定细胞系筛选第一天：在60mm培养皿内种植细胞,细胞密度为第二天细胞融合能到达70%-80%,CO2孵箱过夜培养.第二天:准备3ml培养基,参加Polybrene[13],终浓度为8g/ml.将步骤五制备的病毒颗粒ml 加至上述培养基,轻吹混匀.去除60mm培养皿内的旧的培养基,参加含病毒培养基〔Polybrene 能够增加病毒感染的效率,然而,有时候Polybrene对细胞有毒性.这时,可以用ProtamineSulfate 代替Polybrene〕第三天:病毒感染后24小时,可以换用含最优浓度puromycin的培养基.如果病毒对细胞有毒性,可以减少感染时间至4-6小时,然后换用新鲜培养基,24-48小时后换加含puromycin的培养基.最好设立一个对照皿,不加病毒液,参加Ploybrene,观察Polybrene是否对细胞有毒性;如果Polybrene没有毒性,还可以参加puromycin,作为puromycin是否有效的对照.第四天以后：每隔一天换用新鲜含puromycin的培养基,以替换含大量死细胞的培养基.待抗性细胞长满以后,细胞转入10cm培养皿,同时,留一局部细胞在原来的60mm平皿内,待细胞长满后收获细胞,在蛋白或mRNA水平鉴定基因敲低效率.10cm培养皿内的细胞待长满后传代,首先每种稳定细胞系冻存4-5支细胞,待基因敲低鉴定清楚后,解冻冻存细胞,进行表型观察分析.通常情况下,由于慢病毒为复制缺陷型病毒,受感染的细胞不能产生新的病毒,因此从参加病毒颗粒开始,经过5-6次换液后,培养基内已不存在病毒颗粒,可以移至普通细胞培养室内培养研究.转染后24-48h用RT-PCR检测细胞mRNA水平,用WesternBolt法检测
蛋白质水平.RNAi首先变现在mRNA水平下降,其次是蛋白质水平下降.六、感染后的细胞检测方法荧光初步检测假设有荧光,那么表示病毒感染成功,但并不能确定
目的基因是否整合到细胞中待进一步检测,荧光有强弱之分,与病毒参加的量有关.RNA的提取及RT-PCR检测原理由于真核细胞DNA含有很多非编码区,真核生物的DNA转录成为RNA之后,
经过剪切和拼接,去掉这些非编码区,才能形成真正的mRNA,,是否表达真核生物的基因并表达相应的蛋白,只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条途径来测定提取步骤加ImlTrizol,吹打后移至无菌的离心管中；力口100ul氯仿剧烈振荡30s混匀,12000转15min,可看到明显分层；取上层透明液体至新的离心管中,加等体积的异丙醇,混匀静置10min,12000转离心10min,弃上清,加1ml70%乙醇,12000转,离心10min,弃上清,风干剩余液体,最后加DEPC-水溶解RNA,电泳,粗步平U定RNA纯度.步骤:RT是一个
逆转录白^过程,用前一天提取好的总RNA,在参加引物,模版和酶,并在PCR仪的温度设置下,RNA可逆转录为cDNA.PCR是cDNA在模版,引物,酶的作用下进行复制成双链DNAo〔具体步骤省略〕蛋白提取及Western检测western-Bloting:蛋白免疫印迹〔Westernblotting或Immunoblotting〕一般由凝胶电泳、样品的
印迹和免疫学检测三个局部组成.第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,使待测样
品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带.第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上,用得最多的材料是硝酸纤维素膜〔NC膜〕和PVDF膜,蛋白转移的方法多用电泳转移〔转移电泳〕,它又有半干法和湿法之分,现在大多用湿法.第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原.免疫检测的方法可以是直接的和间接的.现在多用间接免疫酶标的方法,在用特异性的第一抗体杂交结合后,再用酶标的第二抗体〔碱性磷酸酶〔AP〕或辣根过氧化物酶〔HRP〕标记的抗第一抗体的抗体〕杂交结合,再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来显示抗原的存在.该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中.
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病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来 的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。对进行稳转细胞株的筛选，为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液提供基础。 二、慢病毒载体构建及包装流程： （一）实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD 酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因 CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装 入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒载体
现今常用的制备慢病毒载体的方法为使用3或者4质粒系统转染293T细胞。此外，也有使用其它几类慢病毒包装细胞系制备慢病毒载体。 瞬时转染制备慢病毒： 细胞：慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编 码基因，转染效率极高。但其贴壁性不好，所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。多聚赖氨酸培养皿可购买，也可自行制备。转染前，细胞密度控制在40-70%比较好。 DNA：每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞，需用30-40 ug不含内毒素的质粒进行转染。质粒的纯度对慢病 毒载体的包装效率非常关键。不同的包膜蛋白表达载体，其使用量也不同。 转染：最经济的转染方法是磷酸钙转染法，虽然其溶液配置影响因素多，不易稳定重复得到最佳的转染结果。其它方法有脂质体法和PEI法。转染48-60后可以收集上清，通过低速离心，然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。如果使用VSV-G包膜蛋白的话，可以通过两次超速离心进行浓缩，从而最高可以获得滴度高达1011-1012 IU/ml的慢病 毒载体。之后可以将病毒载体溶解在PBS，HBSS或者DMEM中，并置于-80℃储存。储存溶液添加血清会帮助提高 病毒冻融时的存活率，然而有些病毒在侵染细胞时，血清会有干扰，所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。 病毒滴度：含VSV-G的慢病毒载体，其滴度在浓缩前一般为107 IU/ml，浓缩之后可以达到109 -107 IU/ml 。含有荧光标记或者其它报告基因的病毒载体，可以通过梯度稀释侵染HeLa或者293，NIH3T3细胞来确定其滴度;不含报告基因的可通过测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或者含量来确定其滴度，比如使用p24gag的elisa试剂盒。一般来说，每4-60 x 103个病毒载体含1ng p24 gag。然而这种方法测出来的滴度并不准确，不同的病毒载体类型，不同的储 存方式，都会导致p24 gag和病毒载体颗粒的比值变化较大。甚至是不同的实验室测出来的都会有差异。亦可使用PCR 法测定滴度，其引物设计针对病毒颗粒的通用cDNA区域，因此不受外源插入片段的影响，也不需要反转录步骤，而且可以用于所有慢病毒载体。 注意事项 1.避免使用小量抽提质粒，其纯度相比中抽和大抽而来的质粒纯度较低，可能会降低包装效率。 2.对于基于HIV-1的慢病毒载体而言，依实验目的，可能需要Vpr或者Rev辅助蛋白因子。有些细胞类型需要这些辅助蛋白的参与才能达到高侵染效率。 3.包装细胞系的质量对高效包装病毒非常关键。转染时，细胞密度在70-90%之间比较合适，过低或者过高密度 都可能会降低病毒包装效率。细胞开始出现汇合时，需要及时更换或者添加新鲜培养基以保持细胞健康状态。 4.氯喹对细胞有毒性，一般将标准使用浓度之下的氯喹与细胞共孵育的时间控制在8小时之内。或者降低氯喹的使用浓度，延长孵育时间。 5.病毒包装时的细胞培养温度需要综合两方面因素考虑：a)，370C最有利于保持细胞健康状态;b)，320C最有利于维持重组病毒的稳定性。 6，收集病毒上清时的离心步骤可以去除细胞碎片以及少数悬浮的293T细胞。必要时，需要过滤以彻底去除一些细胞成分的污染。 7.冻融会降低病毒侵染效率50%，因此需要避免多次反复冻融。病毒放置于4℃时每36-48小时侵染效率下降50%。 8.视实验目的而定，为降低血清成分污染，建议使用低浓度血清培养基。 9.通过使用0.45mm的滤膜不仅可以去除细胞碎片残留，还可以去除VSV-G残留片段对细胞的毒性影响，但同 时也会部分影响病毒滴度，所以过滤步骤需要依据具体实验目的而定。 10.使用TNE重悬病毒沉淀时，虽然低体积会增加病毒浓度，然而由于VSV-G介导病毒与细胞的融合，所以高 浓度VSV-G对细胞会造成一定毒性，而有些细胞对VSV-G引起的毒性比较敏感，因此最终体积需要依据具体实验而定。
慢病毒载体的构建
慢病毒载体的构建 一．构建原理： 慢病毒属于逆转录病毒科, 但其基因组结构复杂, 除gag 、po l 和env 这3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外, 还包括4 个辅助基因, vif 、vp r 、 nef 、vpu 和2 个调节基因tat 和rev 。H IV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒, 第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将H IV 21 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分: 包装成分由H IV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建, 能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白; 载体成分与包装成分互补, 含有包装、逆转录和整合所需的H IV 21 顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV ) 的可能性, 将包装成分的5′ L TR 换成巨细胞病毒(CMV ) 立即早期启动子, 3′ L TR 换成SV 40 po lyA 位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上, 即一个表达gag 和po l 、另一个表达env 。 二．实验操作举例： 一）磷酸钙法转染HEK293T 细胞 1. 试剂配制: 无菌水ddw: 高温灭菌; 分装; 2XHBS: 280mM NaCl 10mM KCl 1.5 mM Na2HPO4 12 mM glucose 50 mM HEPES Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装; 2M CaCl2: 过滤灭菌,分装. 2. 实验过程: 1. 铺细胞: 选择状态良好的293T 细胞传代, 2-3x105 个细胞/35mm dish. 2. 20-24h 后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染.下面就35mm dish 为例,采用以下转染体系: ddw: 105ul plasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul) 2M CaCl2: 16.5ul
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慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程（一） 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应
分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。 包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化
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慢病毒包装实验流程、原理与步骤 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。其中研究最多的是HIV-1慢病毒。 慢病毒载体（Lentivirus vector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基因取代部分基因构建而成。目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。 慢病毒包装实验流程如下： 1.根据目的基因相关信息（序列，基因序列号等）获取目的基因； 2.根据客户要求选择对应载体； 3. 将目的基因构建到慢病毒载体获得含有目的基因的重组载体； 4. 测序鉴定重组质粒，高纯化（不含内毒素）提取的重组质粒； 5. 使用高纯提重组载体和慢病毒包装质粒共转染 293FT 细胞，进行病毒包装并收集上清液； 6. 通过超滤和超速离心浓缩和纯化病毒； 7. 使用病毒液感染 293T 细胞，药物筛选细胞，构建稳定表达细胞系。 慢病毒使用安全及注意事项 1.慢病毒相关实验请在生物安全柜内操作。如果使用超净台请不要打开风机。 2.慢病毒感染实验时，请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不用将身体的任何部位裸露在安全柜内。
Cas9蛋白过表达慢病毒包装构建步骤
Cas9蛋白过表达慢病毒包装构建步骤 概述： 以下采用Polyfect-V转染试剂为例说明慢病毒包装过程。您也可以采用其它品牌转染试剂进行慢病毒包装。转染试剂和质粒用量请参考生产厂家的说明书，也可以通过预实验决定。无论采用哪种转染试剂，3种载体的相对比例应保持不变。 本例中病毒包装采用10cm培养皿。如需用其它规格细胞培养器皿进行转染和病毒包装，请根据细胞相对生长面积对培养液体积和转染试剂用量进行相应调整。 1、转染前24小时，将293V细胞以4-5×106/10cm平皿密度接种，加入10ml 293V培养基37℃，5% CO2培养。细胞转染前密度应达到80-90%。 2、漩涡震荡混匀Polyfect-V转染试剂。 3、准备2个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。 离心管1（质粒DNA） 离心管2（转染试剂） Cas9慢病毒载体5μg Polyfect-V转染试剂20 μl pH1载体3.75μg DMEM无血清培养基480 μl pH2载体1.25μg - DMEM无血清培养基X μl - 总体积500μl 总体积500μl 4、充分混匀。 5、将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。注意加入顺序非常重要。
6、室温孵育转染混合液15分钟。 7、将1ml转染混合液逐滴加入步骤1准备的细胞培养皿，前后晃动培养皿，充分混匀。 8、37℃培养。 9、4-6小时后，用10ml新鲜的293V培养基换液。转染后24小时，用10ml病毒培养基换液。 10、转染后48小时收集细胞培养上清。 11、病毒上清可以直接用于感染目的细胞或者浓缩纯化后感染目的细胞。推荐通过超速离心纯化、PEG6000浓缩纯化或者超滤法浓缩后再感染目的细胞。 12、病毒纯化后可以冻存在-80℃以备以后使用。 注意： 1、Cas9蛋白的基因长4kb，Cas9表达慢病毒的包装效率和感染力比一般慢病毒低，推荐经过浓缩纯化再用于感染目的细胞。 2、Cas9基因较大，包装时产生的空壳病毒（即有病毒外壳，但没有组装进目的基因的病毒）比较多。感染细胞时，这些不正确的病毒会竞争细胞表面受体，造成正确病毒感染率下降。密度梯度离心能去除病毒空壳，因此采用密度梯度离心纯化病毒可以显著提高病毒感染效果。如果没有时间进行超速离心，用PEG纯化法或者超滤纯化对提高提高病毒感染效果有一定帮助。
Crispr Cas9 慢病毒构建的具体步骤及方法
Crispr/Cas9 慢病毒构建的具体步骤及方法 简介 Cas9蛋白的CDS长达4kb，克隆难度和包毒难度都相对大，将Cas9基因高效导入细胞是应用Cas9/CRISPR系统进行基因敲除的难点之一，极大地限制可供选择的将基因导入细胞的方法。并且在用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除时，还需要同时转入识别靶点的gRNA，筛选阳性细胞的抗性基因或荧光基因，用同源重组法进行基因敲除，还需要导入同源重组模板。如此多的基因共同表达，很难得到较高的基因编辑效率，造成后续的阳性克隆筛选和检测工作难度大。慢病毒Cas9表达体系，该体系采用慢病毒体系先在细胞中稳定表达Cas9蛋白，构建稳定表达Cas9蛋白的细胞系，再在该细胞系的基础上导入gRNA和基因敲除实验中用到的其它原件用于特异性基因敲除。 方法： a、实验方案设计更灵活。由于不必表达大蛋白Cas9，可以根据细胞特性选择化学转染、腺病毒、腺相关病毒等多种方法导入或敲除相关基因；
b、提高基因敲除效率。在稳定表达Cas9蛋白的细胞系上进行基因敲除比瞬时转染Cas9进行基因敲除的效率更高； c、可对同一细胞进行多个基因敲除实验。对于需要在同一个细胞系中进行多个基因的编辑或需要长期用一个细胞模型进行多项基因研究，先构建一个Cas9蛋白稳定表达的细胞系可显著提高后续实验的效率，降低实验难度。 优势： a、适用于在同一个细胞系中需要进行多个基因敲除的实验； b、基因敲除效率比直接质粒转染更高； c、提供多种不同荧光和抗性标记的慢病毒表达载体，更易筛选到基因敲除成功细胞； d、接受cas9蛋白稳定表达不同细胞系定制。
步骤流程
慢病毒载体构建步骤
一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。在所构建的siRNA 表达载体中，是由RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA 合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A 尾。当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或5 个T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4 个U。U6 和H1 RNA 启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA 和～50ntRNA 茎环结构（stem loop）。在siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4～5T 转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体（筛选）。二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 大致的实验流程：1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA 的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T 细胞)；6. 通过定量PCR 精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA 的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。三、重组质粒构建流程1.基因的获得: shRNA 寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR 扩增) 2.回收A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。B．PCR 扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA 片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA 条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA 片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA 的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，
慢病毒生产及使用操作技巧介绍材料
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的
出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。 4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。 5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为3 x 106个/ml。 6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。 7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。 （二）293T细胞的传代