全血DNA提取步骤
PK法提全血DNA步骤
PK法提全血DNA（蛋白酶K法）一、试验原理：苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。
DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。
蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。
当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。
离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。
酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。
氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。
抽提后的DNA 溶液用2倍体积的无水乙醇在1/10 3mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。
二、步骤：1、1ml EDTA－Na2抗凝血于10ml离心管中，加3体积1×RBC裂解液混匀，冰浴30min.2、4度10000 rpm离心10min,弃上清，加入1ml 1×细胞核裂解液（混匀，把沉淀摇起来），再加2ml 1×细胞核裂解液和150µl 20%SDS 摇匀，直至出现粘稠透明状，加20µl 16mg/mlPK,摇匀，37度消化6h以上或者过夜（摇床160r/min）.3、加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温10000rpm 10min.4、用去头的吸头小心将上清液移至另一离心管中（宁少勿多），加等体积（吸下层）酚/氯仿（1:1 V/V）混匀，4度10000rpm 10min.5、小心移上清液，若上清液不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6、将上清液移入另一离心管中，加入2倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA，10000rpm 10min.7、去掉大部分上清，摇匀，将DNA转到EP管中，12000rpm 10min.8、去上清，用70%乙醇洗（加1ml, 12000rpm 10min）2次.9、室温干燥5min，再将DNA溶于50µl 1×TE中。
全血基因组DNA提取试剂盒使用说明
全血基因组DNA提取试剂盒使用说明一、试剂盒组成及存储条件：1.试剂盒包括蛋白酶K、缓冲液、洗涤缓冲液、脱水溶液等。
2.试剂盒应存放在4℃以下避光干燥处，避免冻结。
二、实验前准备：1.准备所需的实验耗材和设备，如离心管、恒温振荡器、离心机等。
2.取出全血样品，可以是新鲜全血或已离心制备的全血细胞。
三、DNA提取步骤：1.取出全血样品，用洗涤液洗涤细胞沉淀并离心收集，去除红细胞。
2.加入蛋白酶K将细胞裂解，释放DNA。
3.加入缓冲液和脱水溶液，沉淀DNA并洗涤。
4.最终稀释DNA并保存在适当的条件下。
四、实验注意事项：1.操作过程中需注意无菌操作，避免污染。
2.加入蛋白酶K的量应准确控制，不要过多或过少。
3.混合溶液时需轻轻摇匀，避免气泡的产生。
4.稀释保存DNA时，需使用无核酸酶的载体溶液，如TE缓冲液。
五、质控及结果分析：1.可以通过琼脂糖凝胶电泳或比色法检测提取的DNA质量。
2.检测DNA浓度和纯度，确保提取的DNA适用于后续实验。
3.可以保存提取好的DNA样品，以备后续实验使用。
六、应用领域：1.该试剂盒适用于从全血样品中提取DNA，可用于基因分析、疾病诊断、遗传研究等领域。
2.可以用于个体基因检测、种群遗传学研究、药物反应性研究等。
总结：全血基因组DNA提取试剂盒是用于从全血样品中提取DNA的重要工具，操作简便、提取效率高。
在实验中需注意操作规范，保证提取的DNA质量和纯度。
该试剂盒广泛应用于科研领域，为基因研究和临床诊断提供了有力支持。
希望上述使用说明能够帮助用户正确、高效地使用全血基因组DNA提取试剂盒。
实验二 全血基因组DNA的提取
实验二：全血基因组DNA的提取一实验目的：1．学习并掌握动物全血提取DNA的方法2．从全血中提取到一定量的纯净的DNA样品二实验原理DNA存在于细胞核中，用细胞裂解液除取红细胞，核裂解液破坏白细胞，氯仿使蛋白质变性，用无水乙醇洗涤DNA，从而得到纯净的DNA分子。
三、实验仪器、材料、试剂（一）仪器1．高速离心机 2．烘箱 3．冰箱4．水浴锅5．微量移液器6．高压灭菌锅（二）材料1．鸡血、2．细胞裂解液3．核裂解液、4．饱和NaCl、5．氯仿、6．无水乙醇、7．ddHO、8.滤纸、9．微量取液器、10.1.5mL/2mL 离心管、11.一次性2手套、12.离心管架、13.记号笔等（三）试剂配制细胞裂解液:10mm/l Tris-Hcl(1mol/L) ,11%w/l蔗糖,5 mmol/L Mgcl2,1%v/vEDTA, 10mm/L Triton 核裂解液：10mm/l Tris-Hcl, 1%w/v SDS, 10mm/L Na2柠檬酸三钠四、实验步骤1．吸取500ul血液至2ml离心管，加入1000ul的细胞裂解液，上下颠倒2-3min。
2．在4°C，6000rpm转速离心3min,弃上清液。
3．重复1-2步（1-3次），直至洗净红细胞，颜色变白为止。
4.加入300ul核裂解液，上下颠倒2min,室温静置2min。
5.加入100ul饱和NaCl和600ul氯仿，轻轻上下颠倒2min, 4°C，6000rpm 转速离心5min。
6.小心吸取上清液（不能吸入下层液体），移至新的1.5ml的离心管。
7.加入600ul冷藏无水乙醇，轻轻摇动，观察有无絮状物质。
8. 4°C，13000rpm转速离心3min，小心倒掉上清液，用滤纸吸取管壁周围的液体，室温下是离心管完全干燥。
（1h左右）9.沿管壁慢慢加入50ul ddHO，然后轻轻吹打均匀。
210.-20°C的冰箱保存。
人全血DNA的提取实验步骤
人全血DNA的提取实验步骤
取2ml抗凝血于无菌15ml离心管
↓3000r/min 离心5min
弃上清，加入适量生理盐水
↓上下颠倒混匀
3000r/min 离心5min
↓
弃上清，加入约5倍体积的无菌ddH2O
↓上下颠倒混匀
室温静置5分钟，4000r/min 离心10min
↓
弃上清，加入约5倍体积的无菌ddH2O重悬白细胞沉淀
↓上下颠倒混匀
4000r/min 离心10min
↓
弃上清，加入STE至2毫升
↓上下颠倒混匀
再加10%SDS 200μl和10mg/ml 蛋白酶K 20μl 混匀
↓置56℃水浴震荡3h
取出观察白细胞消化情况（无可见沉淀），冷却至室温
↓
加入等体积饱和酚，缓慢摇动20min
↓4000r/min 离心10min
小心吸出上清转于另一无菌15ml离心管中
↓
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）缓慢摇动20min
↓4000r/min 离心10min
小心吸出上清转于另一无菌15ml离心管中
↓
向上清中加入1/10体积的3M NaAC（pH5.2），混匀
↓
再加入2倍体积的无水乙醇，缓慢摇动即可见DNA丝状体
↓
用无菌吸管吸出DNA丝状体移至装有1ml70%乙醇的Epp管内
↓
12000r/min 离心3~5min，弃上清。
沉淀用1ml 70%乙醇洗涤1~2次
↓
12000 r/min 离心3~5min，弃上清。
↓
室温风干或DNA风干机抽干
↓
用100μl TE溶解DNA 沉淀。
全血DNA抽提步骤
人淋巴细胞分离液分离血液中单个核细胞1、取新鲜抗凝血1ml，与生理盐水或PBS 1:1混匀后，小心加于1ml的细胞分离液之液面上，以2000rpm，离心20min。
2、分四层，第一层为血浆或组织匀浆液层，第二层为环状乳白色淋巴细胞或单核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
3、收集第二层细胞（淋巴细胞），沉淀反复洗二次即得单个核细胞。
全血提取DNA开始前准备：1、所有的离心步骤均在室温下进行。
2、使AL和ATL中的沉淀溶解。
3、向AW1和AW2溶液中加无水乙醇。
4、将冰冻组织或细胞沉淀平衡的室温。
5、预热孵育器到56℃。
哺乳动物血液（人）：吸取20ul蛋白酶K到1.5ml或者2ml离心管中，加50-100ul抗凝血。
将总体积用PBS补到220ul。
细胞：离心收集5x106个细胞，用200ulPBS重悬，加20ul蛋白酶K。
2、加200ulAL（提前预热到56℃），vortex充分混匀，56℃孵育10min。
3、加200ul无水乙醇，vortex充分混匀。
4、将混合物吸到装有2ml收集管的DNeasy mini旋转柱中，最大速离心1min，弃去收集管及管中液体。
5、将旋转柱装到一个新的2ml收集管中，加500ul AW1，最大速离心1min，弃去收集管及管中液体。
6、将旋转柱装到一个新的2ml收集管中，加500ul AW2，大于14000rpm离心3min，弃去收集管及管中液体。
7、将旋转柱移到一个新的1.5ml微量离心管上。
8、加100ul AE buffer到旋转柱薄膜中央溶解DNA,室温孵育1min，最大速离心1min。
9、可选：重复步骤8增加DNA沉淀的产量。
全血DNA的提取及电泳
分别吸取上述体积的DNA和6×loading dye， 至透明胶布的光滑表面，用移液器吹打均一。
点
样
电
泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照
相
实验注意事项
1. 制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固 不均匀；速度也不可太快，否则容易出现气泡。 2.胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直 向上，不要弄坏点样孔。 3.点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲 液不要太多。
⑵方法： Ⅰ 分离WBC
取1ml 全血 等体积3%明胶
颠倒混匀
37℃静置，5-10min
溶液颜色均一 溶液颜色 上下分层 沉淀颜色为 红色
取上清
4000r/min 离心 ，5min
弃上清
Ⅱ 破碎WBC
加入2ml TES
轻轻敲击管底震荡混匀
溶液全部变为 粉红色
加10滴 10%SDS
颠倒混匀
溶液颜色变暗
Ⅲ 抽提DNA
加等体积
上清液（DNA） 蛋白质层 酚溶液
Tris饱和酚 颠倒混匀，100次， 4000rpm，离心5min 取上清
取下层酚溶液，混 匀后溶液变为均一 的棕色
加等体积氯仿： 异戊醇（24:1） 颠倒混匀，100次 4000rpm，离心5min上清液（DNA） Fra bibliotek白质层 氯仿溶液
混匀后溶液变为均 将上清移入 玻璃试管 一的乳白色
全血DNA的提取及电泳
一、全血DNA的提取 1.实验原理
DNA
由于血液各组分成分颗粒大小及比重不同，利用明胶
的吸附作用，使红细胞沉积在管底，从而与白细胞相 分离。 通过SDS的破膜（细胞膜和核膜）作用，使白细胞释 放出DNA。 然后利用酚和氯仿抽提纯化，分离去除蛋白质。 最后用乙醇沉淀洗出DNA。
从全血和体液中提取基因组DNA的操作步骤(精)
从全血和体液中提取基因组DNA 的操作步骤提取DNA 需要的仪器和试剂：⑴ 1.5ml 离心管⑵ 移液管: 1000ul, 200ul, 40ul 各一支和移液管尖头: 100-1000ul, 1-200ul 各一盒⑶ 微型滤柱（备用）⑷ 小型旋转混合器一台⑸ 小型离心机: 可放入1.5ml 离心管和2ml 收集管.⑹ 恒温水浴⑺ 电冰箱: -20 C, 4 C⑻ 无水乙醇(自备)⑼ 70% 乙醇(自备)⑽ 利普生DNA 提取试剂盒。
内含: ⑴ 裂解液1 ⑵ 裂解液2 ⑶消化液 ⑷纯化液⑸弥散液 ⑹蛋白酶K ⑺ 带钩细玻棒一盒 ⑻ 微型滤柱若干。
提取DNA 前注意：⑴ 使血样品内容物达到室温（15 – 25 C ）。
⑵ 预热水浴到58 C ， 为步骤3作准备。
⑶ 置弥散液于58 C 内，为步骤4或步骤7作准备。
⑷ 所有的离心步骤均在室温下进行。
⑸ lml 全血可提得15-60ug DNA 。
一．从1ml 全血或体液中提取DNA 的步骤：⑴ 裂解1： 取1ml 全血，血桨，血清，淋巴细胞放入到1.5ml 的离心管中，加入400ul 裂解液1。
上下翻转，使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，离心速率为8000rpm ，1min.。
倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。
重复此裂解步骤一次，这次是加入1ml 裂解液1。
最后用移液管吸净所有上层液弃去, 以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液1。
⑵ 裂解2: 在上面离心管中加入1ml 裂解液2。
上下翻转，务必使沉淀物分散， 旋转脉动15秒后放入离心机中离心，8000rpm ，1 min.。
倒掉上清液，可见离心管底部有微量淡红色沉淀。
重复此裂解步骤一次，这次仍然是加入1ml 裂解液2，最后用移液管吸净所有上清液弃去，以使离心管底部的灰白色沉淀不再残留有裂解液2。
⑶ 消化： 吸取蛋白酶K 10ul ( = 0.2mg )加入到上面的离心管中，用移液管尖头反复吹打， 使蛋白酶K 与沉淀物均匀接触后， 加入320ul 消化液，上下翻转离心管， 务必使沉淀物分散于消化液中。
全血提取总DNA实验步骤
全血提取总DNA实验步骤1. 取4 ml全血离心弃血清（已处理），将血球转移至15 ml离心管中，加入Buffer FG1至9 ml（血球过多可12 ml），上下颠倒混匀5次，2,500×g离心15分钟，缓慢弃上清。
2. 把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2分钟。
注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。
将离心管倒置在吸水纸上，可以减少管壁上清的回流。
3. 按照附表配制缓冲液FG2与Proteinase K的混合液（比例100:1）。
注意：此混合液最好现用现配，并在配好后1h之内用完。
4. 加入1.5 ml Buffer FG2/Proteinase K混合液，立即混匀至溶液无团块。
注意：1）如果有多个样品同时操作，加入Buffer FG2/Proteinase K混合液后立即涡旋震荡，不要等所有样品都加完后再震荡。
2）通常涡旋震荡3-4次，每次5秒可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋震荡后发现沉淀中含胶状物质可以再加入300 μlBufferFG2/Proteinase K混合液，再次涡旋混匀。
5. 65℃水浴锅中孵育5分钟，其间颠倒混匀数次。
注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿说明蛋白消化完全。
水浴时间不能过长，防止DNA降解。
6. 加入1.5 ml异丙醇，上下颠倒彻底混匀直至看到DNA，用玻璃吸管吸出沉淀置于1.5 ml 的EP管中。
注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要。
如果样品中白细胞含量少，可能看不到DNA，则至少上下颠倒离心管20次确保沉淀完全。
7. 加入1.5 ml 70%乙醇，涡旋震荡5秒，2,500×g离心5分钟，弃上清。
注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。
8. 把离心管倒置于干净的吸水纸上5分钟，确保沉淀在管中，空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5分钟）。
注意：1）在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。
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从全血中抽提基因组DNA的方法
1、取全血700µL离心，5000rpm，5min，弃去上清液。
2、沉淀物用1mL的红细胞裂解液洗涤3次，5000rpm，5min，弃去上清液，倒干。
3、加入450µL细胞裂解液和6µL蛋白酶K（20mg/mL），55℃～66℃水浴4小时。
4、用等体积的酚、氯仿、异戊醇（25︰24︰1）抽提2次，12000rpm，5min。
5、用2倍体积冰预冷的无水乙醇沉淀（无水乙醇），有絮状沉淀后置于―20℃，沉淀30min。
6、沉淀结束后，12000rpm，5min，弃上清液。
7、用800µlL70%的乙醇洗涤沉淀，12000rpm，3min。
8、弃上清液，干燥。
9、加入50µL 1×TE缓冲液溶解，―20℃保存备用。
附：DNA提取相关试剂配制
1、红细胞裂解液（PH 7.4）
配制量：1L
配制方法：（1）、称量NH4CL 0.802g、NaHCO3 0.84g、Na2EDTA·2H2O
37.22g，置于1L烧杯中。
（2）、向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅
拌溶解。
（3）、加去离子水将溶液定容至1L后，高压灭菌。
（4）、室温保存。
2、细胞裂解液（PH 8.0）
配制量：500Ml
配制方法：（1）、称量NaCL 2.92g、SDS 5g、Tris 0.61g，置于
1L烧杯中。
（2）、向烧杯中加入约300ml的去离子水，搅拌溶解，
在溶解过程中用1mL移液器加入10mL的
TriTon-100。
（3）、溶解后加入20mg/mL的蛋白酶K 3µL.
（4）、加去离子水将溶液定容至500mL后，高压灭菌。
（5）、室温保存。