四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型建立与考察
肝损伤动物模型研究进展
肝损伤动物模型研究进展内容摘要：肝疾病；毒物，四氯化碳；醋氨酚；疾病模型，动物肝损伤是各种肝脏疾病的病变结果，对肝损伤的防治目前仍是一个严峻的课题。
通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病的发生机制，筛选保肝药物，探索保肝作用原理，具有重要的现实意义。
现将近年来国内外对实验性肝损伤动物模型分类、作用原理、造模方法及其优缺点等研究进展作综述和探讨。
1化学性肝损伤动物模型1.1四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）CCl4导致肝损伤的主要机制目前认为与其自身和自由基代谢产物有关。
CCl4代谢产生的自由基进入机体后，在肝脏经细胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基和三氯甲基过氧自由基，攻击肝脏细胞膜上的磷脂分子，使得细胞膜、内质网膜发生氯烷化和脂质过氧化，损伤细胞膜、细胞器；还能与膜脂质和蛋白质大分子进行共价结合，影响蛋白质代谢，并且破坏膜结构和功能的完整性，钙离子内流增加，影响细胞正常生理功能，最终导致肝细胞胞质中的可溶性酶渗出，细胞死亡[1]。
CCl4所致肝损伤可分为急性和慢性。
急性肝损伤：赖力英等应用4mL/kgCCl4剂量灌胃可诱发SD大鼠急性肝功能衰竭，死亡率达85%[2]。
慢性肝损伤：Zhang等采用2mL/kgCCl4腹膜内注射SD大鼠，每周2次，持续9周可伴有肝细胞坏死和明显炎症的肝硬化[3]。
CCl4导致肝损伤是经典模型之一，能准确反应肝细胞功能、代谢及形态学变化，重复性好且经济。
但CCl4同时还损伤动物的心、脾、肺、肾、脑等器官，另外，蒸汽和液体可由呼吸道、皮肤吸收，对人体也有一定毒性，操作时应注意。
1.2α萘基异硫氰酸酯(αNaphthylisothiocyanate,ANIT)ANIT是一种间接肝毒剂，其主要损害是通过膜脂质过氧化反应，致使肝细胞变性、坏死、胞内血清谷丙转氨酶(ALT）大量溢入血流，同时还导致胆管上皮细胞肿胀坏死，引起毛细胆管增生及小叶间胆管周围产生炎症，从而造成胆管阻塞，形成明显的胆汁淤积，并伴随以点状坏死为主的肝实质细胞损害，产生梗阻性黄疸，出现高胆红素血症和胆汁分泌减少。
建立急性肝损伤模型
一、四氯化碳急性肝损伤模型[造模原理]四氯化碳(CCl4 )是无色透明液体,不溶于水.CCl4的毒性主要与其活性代谢产物有关.在肝内CCl4惊NADPH和肝微粒体细胞色素P450混合功能氧化酶的作用,生成活泼的三氯甲基自由基和氯自由基.这些自由基能与细胞内和细胞膜上大分子发生共价结合,引起富含不饱和脂肪酸的生物膜发生脂质过氧化,导致膜结构和功能完整性的破坏,肝细胞损伤坏死.三氯甲基自由基还能抑制细胞膜和微粒体膜上该泵的活性,食Ca2+内流增加,从而引起细胞中毒死亡;三氯甲基自由基能与蛋白质形成共价键,损害线粒体,使还原型辅酶Ⅰ(NADH)及ATP在肝内生成减少,脂肪酸氧化抑制,影响肝脏能量生成障碍,并使三酰甘油和脂肪酸在肝细胞内蓄积.[实验动物]体重18-22g的小鼠、体重150-180的大鼠或体重4-45kg的家兔.[操作方法]用CCl4 在不同动物可以多种方法引起急性肝损伤.一般用花生油将CCl4 稀释为所需浓度. CCl4 致急性肝损伤所需剂量和用法见表8-1[模型评价与注意事项]1.( CCl4肝损伤模型是最常用的急性肝损伤模型,造模方法简单,成功率高,重复性好，价格低廉。
2．CCl4剂量不宜过大，以免造成动物中毒死亡。
3：CCl4是无色澄清的有毒液体，有特殊气味，难溶于水。
CCl4 一般用花生油、橄榄油、豆油等植物油混合成所需浓度，有时也可与矿物油(如液体石蜡)混合。
以植物油为例，10％CCl4的配制方法是：取5ml植物油和5g阿拉伯胶，置于乳钵中研匀，再加lOml纯CCl4。
研匀，然后加蒸馏水lO~15ml调成乳状，最后加蒸馏水至lOOml，用前摇匀。
4．用CCl4复制肝损伤模型的主要缺点是,不同动物个体肝损伤的程度差异较大. 还有研究表明，小鼠接受CCl4后肝脏病理学改变与血清ALT等生化指标改变的相关性不如大鼠好。
5 CCl4 液体和蒸气可以从呼吸道、皮肤吸收,对人体有一定毒性，操作时应注意防护.二、D-半乳糖胺急性肝损伤模型[造模原理]D-半乳糖胺(D-galactosamine)引起急性肝损伤的机制尚不完全清楚。
四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝炎模型筛选
CCl4 在体内对肝脏的亲和力很强, 在肝细胞内质网中经细胞色素 P450 依赖性混合功 能氧化酶的代谢, 生成三氯甲烷自由基、二氯甲烷自由基和过氧化三氯甲烷自由基, 可与细 胞膜大分子共价结合,使酶的功能丧失, 细胞膜发生脂质过氧化, 破坏肝细胞膜的结构和功 能完整, 使蛋白质合成障碍; 并通过抑制细胞膜上 Ca2 + 泵的活性, 使 Ca2 + 离子大量内 流, 导致肝细胞损伤, 从而使胞浆内转氨酶渗入血液中。 服务项目：
200×
立，以保证模型稳定可靠 2. 对病理损伤程度进行量化评分分析，更加客观评价药物的治疗肝炎的疗效 3. 可提供相关的 WB、IHC、real time-PCR、ELISA 细胞因子分析服务，深入研究药物
作Hale Waihona Puke 机理正常组：中央静脉及其周肝细胞
200×
模型组：肝细胞灶状坏死
200×
受试药物组：静脉周围少量炎细胞浸润
考察受试样品对四氯化碳（CCl4）诱导的小鼠肝炎的保护作用 服务内容：
1. 四氯化碳（CCl4）诱导的小鼠肝炎模型制备 2. 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药物三个剂量组，每组 10 只
动物 3. 血清生化指标检查谷丙转氨酶 ALT、谷草转氨酶 AST 4. 病理损伤程度分级量化评分及病理照片 客户提供：受试样品、阳性对照药 我们提交：详细实验报告 服务周期：3 个月 服务收费：根据实验方案确定，请咨询 服务特点： 1. 通过生化指标谷丙转氨酶 ALT、谷草转氨酶 AST、病理检查综合判断肝炎模型的建
伤寒头对CCl_4致小鼠急性肝损伤的保护作用及其机理
伤寒头 ,急性肝损伤, 保护机理
H ep a t o pr ot ec t ive Effec t sa nd M ec h a nism o f H er b o f Sh a ngh a nt ou on t h e C Cl nd u c edAc u t e Li ve Inj u r in M i ce 4-i
W u W ende * H o u Xi a o l u Xi nGuiu Hua ng C h a o ei C h en J i a nd a o
A ni ma la n dV e t er i na rC ol lege o f G u a n g iU n i ver si t ,N a nni n g,5 30005 *C or r esp o n di ng a ut ho r , d 0194@ 163. co m
DO I :10. 3969/ ga b. 030. 00095 1
In t h e� e p er i m ent ,m � a l ea ndfem a l es i t h eq u a lq u a nt i t ,36 a ni ma l s,K u nm i ng m i c e, er er a nd o ml di vi ded i nt o 6 gr o u ps b ei gh t su c h a s c o nt r o lgr o u p,m o d el gr o u p ,d r u g p o si t i ve gr o u p ,H er b o f Sha n gh a nt ou d o se gr o u p s.Ever gr oupi ng su c c essi ve a d mi ni st r a t i o nf o r3 d ,1 h a f t ert he l a st hi ghd o se,m i dd l ed o se a nd l o
四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型建立与考察
基金项目!河南省科技创新人才计划C杰出青年项目"%&)%""&%""!"$%国家-十三五.科技重大专项课题"!"%'RU%"$!&&"+C""!$ 作者单位!%"""(#北京解放军总医院第五医学中心中医肝病科"付双楠#宫?$%河南中医药大学"高达#郭佳佳#苗明三#朱平生$ 通信作者!朱平生#!"#$%!LE)8$,65E+,6! %!+*(G"%宫?#!"#$%!6G,6"#,("!!%+(*(G"
期间自由饮水(摄食#第'天开始联苯双酯组以&*+!& "6+96灌胃#空 白 对 照 组 及 模 型 组 灌 胃 等 剂 量 蒸 馏 水#每天%次#连续灌胃$'%第%&天腹腔注射"*%? 浓度 44=) 橄榄油溶液制备急性肝损伤模型#分别于 造模后((+(%!和!)E后处理各组动物#以%"?水合 氯醛按"*"( "=+%"6麻醉动物#摘眼球取血#) \# )""";+"$,离 心 %& "$,#取 血 清#采 用 全 自 动 生 化 分 析仪测各组生化指标 2=K 及 2IK'
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肝损伤实验报告（论文资料）
急性肝损伤对药物作用的影响【目的】1、学习制作CCl4肝损伤模型。
2、观察肝损伤时对地西泮药效的影响。
3、观察肝损伤时肝脏大体病理形态的改变。
4、检测肝损伤时肝脏谷丙转氨酶（ALT）的活性。
【器材】紫外可见光分光光度计1台，恒温振荡水浴器1台，台式高速离心机1台，小鼠笼及饮水瓶2套，组织剪1把， 1ml注射器3只，250ml烧杯1只，一次性试管（5ml）6支，试管架4个，1.5mlEP管8个，苦味酸1瓶，冰块1盆，鼠料1包，垫料1包。
【药品】20% CCl4溶液，地西泮注射液，ALT（谷丙转氨酶）检测试剂盒，生理盐水200ml，蒸馏水100ml。
【动物】雄性昆明小鼠8只，体重25~30克。
【方法】每组4只小白鼠，饲养于同一鼠笼中。
2只作为对照；2只作为CCL4肝损伤模型动物，以苦味酸号标记。
1、CCl4肝损伤动物模型的制作：模型组小白鼠腹腔注射0.1ml/10g 的20%CCl4溶液，对照组小白鼠腹腔注射0.1ml/10g的生理盐水。
饲养过夜。
2、CCl4肝损伤对地西泮催眠作用的影响：24h后，取对照组和模型组小白鼠各1只，分别腹腔注射5mg/ml地西泮50mg/kg。
观察并记录其入睡时间（翻正反射消失时间）。
3、肝脏大体病理形态观察：入睡小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏，观察大体病理形态（颜色、结构等变化）。
4、血清制备：取对照组和模型组小白鼠各2只，断头取血，收集到EP管中，静置10分钟，4000rpm离心10分钟，取上清50ul，稀释10倍为待测样品。
5、血清ALT测定：ALT活性计算公式：C样=（A样/A标）× C标C：浓度（活性单位U/L），A：吸光度值， C标为100 U/L【结果】1、CCl4肝损伤对地西泮催眠作用的影响（数据以x±s表示，做组间t检验）实验组别地西泮入睡时间（S）生理盐水组215.40±70.47CCl4肝损伤组59.35±14.89t检验过程:（1）建立检验假设，确定检验标准H0：μ1=μ2,两组不同处理实验小鼠注地西泮后入睡时间的总体均数相同H1：μ1≠μ2,两组不同处理实验小鼠注地西泮后入睡时间的总体均数不相同ɑ=0.05（2）计算检验统计量由原始数据计算得：n1=20,∑X1=4308 ∑X²1=1027254 ¯X1=215.4n2=20,∑X2=1187 ∑X²274885 ¯X2=59.35运用统计学公式计算得：S²c=(n1-1)S²2+(n2-1)S²2/（n1+n2-2）=2730.19S¯x1-¯x2=16.5233算得t=|¯X1-¯X2|/S¯x1-¯x2=9.444(3)确定P值，作出推断结论V=n1+n2-2=38；查t界值表得，t0.05/2,38=2.024,t0.01/2,38=2.712,本例t> t0.01/2,38,P<0.01，差异有统计学意义,拒绝H0，接受H1，故可认为CCl4肝损伤对地西泮催眠作用有影响。
急性肝损伤动物模型
CCl4在肝细胞内质网 450作用下生成多种自 在肝细胞内质网P 由基， 由基，如： CCl4+e CCl3-（三氯甲基自由基） 三氯甲基自由基） +Cl- （氯自由基） 氯自由基） 进而引起膜脂的脂质过氧化， 进而引起膜脂的脂质过氧化，胞浆内 Ca2+浓度升高而致肝细胞坏死。 浓度升高而致肝细胞坏死。
注意事项和模型评价
急性CCl4肝损伤模型是经典的实验性 急性 肝损伤模型。 肝损伤模型。在形态学上主要表现在肝小 叶中央区坏死和脂肪变性， 叶中央区坏死和脂肪变性，血清检测丙氨 酸氨基转移酶（ 酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基 ） 转移酶（ 转移酶（AST）活性升高，并能反映肝损 ）活性升高， 伤的程度。一般于给CCl4 3h后，ALT和 伤的程度。一般于给 后 和 AST开始升高，12~13h后达高峰，常升至 开始升高， 后达高峰， 开始升高 后达高峰 正常的10倍以上 以后下降， 倍以上， 正常的 倍以上，以后下降，90h后可恢 后可恢 复到正常范围。 复到正常范围。
第四节 急性肝损伤动物模型
四氯化碳致急性肝损伤模型
造模机制
四氯化碳（ 是无色透明液体， 四氯化碳（CCl4）是无色透明液体，不 溶于水。CCl4进入动物体内后，可直接进入 溶于水。 进入动物体内后， 肝细胞，在肝细胞内质网中经细胞色素P 肝细胞，在肝细胞内质网中经细胞色素 450 依赖性混合功能氧化酶的代谢， 依赖性混合功能氧化酶的代谢，生成活泼的 三氯甲基自由基和氯自由基。 三氯甲基自由基和氯自由基。这些自由基能 与细胞内和细胞膜上大分子发生共价结合， 与细胞内和细胞膜上大分子发生共价结合， 使酶的功能丧失，细胞膜脂质过氧化， 使酶的功能丧失，细胞膜脂质过氧化，使线 粒体膜的脂质溶解，从而影响线粒体的结构 粒体膜的脂质溶解， 和功能，胞浆Ca 浓度升高， 和功能，胞浆 2+浓度升高，导致配成乳剂使用，如需配成 常配成乳剂使用，如需配成10%乳剂， 乳剂， 乳剂 可取5ml植物油和 阿拉伯胶，放在乳钵中研 植物油和5g阿拉伯胶 可取 植物油和 阿拉伯胶， 再加纯CCl410ml研匀，然后加蒸馏水 ～ 研匀， 匀，再加纯 研匀 然后加蒸馏水10～ 15ml调成乳状，最后加蒸馏水使体积至 调成乳状， 调成乳状 最后加蒸馏水使体积至100ml， ， 用前摇匀。 用前摇匀。
急性肝损伤模型的建立
四氯化碳性肝损伤的关键点
1.急性肝损伤是一个短期过程，一般在1248h内成模，因此，分组建模、取材、标本 固定的时间安排等很重要。 2.腹腔注射CCl4溶液，要注意进针部位、深 度。对给药浓度和剂量，因为鼠源不同或 相关文献数据的不一致性，可以分组进行 不同剂量、浓度的对比性实验。 3. 在制模过程中可以加入戊巴比妥或乙醇代 替饮水，以加速肝损伤进程。
实验目的
1.掌握四氯化碳对肝脏的毒性机理，成功建 立其急性肝损伤模型。 2.熟悉建模过程中的各个环节，并能解决相 关问题，真正感受造模的过程，为将来真 正进入实验做铺垫。
四氯化碳性肝损伤的机制
关于CCl4 肝毒的作用机制,存在多种假设,但都一致公认,其主要 机制是自由基的形成及引发的链式过氧化反应。CCl4在体内可经 肝微粒体细胞色素P450 代谢激活,生成两个活性自由基(CCl3O2 和Cl) 及一系列氧活性物,可与肝细胞质膜或亚细胞结构的膜脂质 发生过氧化反应,膜磷脂大量降解,从而破坏细胞膜结构完整性,引 起膜通透性增加,最终导致肝细胞死亡。另外,CCl4 的代谢产物能 迅速与细胞成分如胞内脂质、蛋白、核脂质、核蛋白和DNA 等 多种大分子发生不可逆的共价结合而导致细胞死亡,特别是当自 由基作用于DNA 时,损伤核糖和碱基,使核酸直接破坏引起DNA 链的断裂或DNA 链与蛋白间交联,影响其信息传递功能以及转录 和复制特性。在CCl4代谢产物引起的脂质过氧化物和共价结合的 双重作用下,导致膜脂质流动性降低、钙泵抑制、谷胱甘肽活性 抑制、肝微粒和线粒体功能丧失、肝细胞内钙稳态失调及代谢紊 乱,引起肝细胞损伤加剧 。
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四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型建立与考察
付双楠;高达;郭佳佳;苗明三;朱平生;宫嫚
【期刊名称】《肝脏》
【年(卷),期】2022(27)9
【摘要】目的考察四氯化碳(CCL 4)致小鼠急性肝损伤稳定的动物模型,便于临床新药的研究与应用。
方法将KM小鼠随机分为空白组、模型组和联苯双酯组(5.625 mg/kg),通过腹腔注射0.1%CCL 4溶液复制小鼠急性肝损伤,检测造模后3 h、6 h、12 h和24 h的转氨酶水平、肝脏指数、肝组织病理变化进行模型稳定性研究。
结果模型组染毒后,ALT在3 h(45.21±13.17 IU/L)轻度升高(P<0.01)、12
h(112.30±30.54 IU/L)和24 h(121.98±21.66 IU/L)升高明显(P<0.01);AST在3
h(162.51±28.57 IU/L)、6 h(192.07±31.05 IU/L)、12 h(250.75±90.82 IU/L)、24 h(274.27±44.02 IU/L)均升高(均P<0.01),但在12 h和24 h升高显著;肝脏指
数在3 h(6.72±1.90 g/100 g)、6 h(7.27±1.38 g/100 g)轻度升高(P<0.01),12
h(12.41±1.18 g/100 g)及24 h(14.90±2.56 g/100 g)升高明显(P<0.01);肝脏病
理变化在12 h及24 h可见明显的肝细胞肿胀、炎性细胞浸润,24 h损伤程度更显著。
结论腹腔注射0.1%CCL 4溶液制备小鼠急性肝损伤模型时,在12~24 h小时
之间建模更适宜。
【总页数】5页(P1036-1040)
【作者】付双楠;高达;郭佳佳;苗明三;朱平生;宫嫚
【作者单位】解放军总医院第五医学中心中医肝病科;河南中医药大学
【正文语种】中文
【中图分类】R28
【相关文献】
1.四氯化碳致小鼠急性肝损伤动物模型建立方法的研究
2.四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤模型的建立和优化
3.高活性小牛血去蛋白提取物对四氯化碳致急性肝损伤模型小鼠的保护作用
4.四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型的研究
5.四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型造模要素及中医药防治的数据挖掘研究
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