叶盘法转化烟草的原理
转基因烟草方法
2．材料与方法2.1实验材料植物材料：K326烟草种子药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等；MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。
高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10gMS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基2.3实验方法2.3.1浸染菌液制备将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。
挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。
活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。
取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。
加入100ml的MS0培养基，混匀。
2.3.2烟草转化按叶圆盘法转化烟草。
将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。
然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。
农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究
转化技术体系, 为分子生物学和植物基因工程的研 究提供较好的技术基础。
1 材料与方法 1. 1 实验材料 1. 1. 1 植物 材料 四 倍 体烟 草 ( Nicotiana tabacum ) 品系 NT12 的无 菌 试 管 苗, 以 MS 为 基 本 培 养 基[ 3] , 附加 3% 蔗糖, pH 5. 8, 于 24 e 、自然光下培
平均阳性 植株数 ( 株/ 块)
阳性植株 频率 ( %)
1. 5 cm @ 1. 5 cm
23
7
30. 4
1. 0 cm @ 1. 0 cm
20
11
55. 0
0. 5 cm @ 0. 5 cm
4
2
50. 0
2. 2 预培养对转化率的影响 实验结果表明, 无论是经过 3 d 预培养的烟草
叶盘, 还是 未经预培养而直接 侵染的叶盘, 都约在 1421 d 后从表面创伤处及边缘出现芽点, 并逐渐长 大成为有几片幼叶的小芽。二者的分化时间、再生 芽的频率没有明显差异。所以, 为了缩短转化时间, 烟草叶盘转化可省去预培养。 2. 3 侵染时间对转化率的影响
图 2 部分转基因植株 PCR 检测结果 M: DNAmarker,K- EcoT 14I digest( TakaRa) ;
20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)
1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。
转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。
1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。
◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。
◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。
◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。
1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。
植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。
原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。
多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。
植物分解二手烟原理
植物分解二手烟原理
植物分解二手烟的原理主要是通过吸收和转化空气中的有害物质来实现的。
一些植物具有特殊的生理结构和功能，可以帮助净化空气。
以下是一些植物可能用于分解二手烟的原理：
1. 气孔吸收：植物的叶片表面有气孔，这些气孔可以吸收空气中的有害气体和颗粒物。
二手烟中的一些化学物质，如尼古丁、焦油等，可以被植物的气孔吸收并在植物体内进行代谢和转化。
2. 光合作用：植物通过光合作用将二氧化碳和水转化为氧气和有机物质。
在这个过程中，植物可能会将二手烟中的一些有害物质作为代谢底物，将其转化为无害的物质。
3. 吸附作用：一些植物的表面或根系可以吸附空气中的有害物质，如灰尘、颗粒物和化学污染物。
这有助于减少二手烟中的有害成分在空气中的传播。
4. 空气过滤：植物的叶片和枝干可以起到一定的空气过滤作用，阻挡和捕获空气中的微小颗粒物，从而减少二手烟对周围环境的影响。
需要注意的是，植物对二手烟的分解和净化作用是有限的，不能完全依赖植物来解决二手烟问题。
此外，不同的植物对二手烟的分解能力也有所不同。
一些常见的被认为对空气净化有帮助的植物包括绿萝、常春藤、吊兰、芦荟等。
为了最大程度减少二手烟对健康的影响，最有效的方法是避免在室内吸烟，并保持良好的通风。
如果可能的话，最好选择没有人吸烟的环境，或者使用空气净化器等专业设备来净化空气。
同时，倡导健康的生活方式，包括戒烟和减少吸烟，对保护自己和他人的健康非常重要。
叶盘法转基因烟草技术
叶盘法转基因烟草技术实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。
二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。
农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。
土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。
这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。
三. 试剂及设备1.试剂：MS培养基：配方见“植物的组织培养技术”实验指导Kan：卡那霉素Cb：羧苄青霉素NAA：萘乙酸6-BA：细胞分裂素T1培养基：MS培养基T2培养基：MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+Kan100 mg/L+Cb500 mg/LT3培养基：MS培养基+ Kan100 mg/L+Cb500 mg/L（T2：生长培养基；T3：生根培养基）2.仪器：光照培养箱，恒温摇床，超净工作台，接种器械等四.实验步骤：1 农杆菌培养1）从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3 ml YEB 液体培养基中（Str 25 μg/ml、Rif 50 μg/ml、Kan 80 μg/ml）于恒温摇床上27℃，180 rpm 摇培过夜至OD 600 为0.6-0.8。
2）摇培过夜的菌液按1%-2%的比例，转入新配置的无抗生素的YEB 培养基中，在与上述相同的条件下培养6 h左右，OD600 为0.2-0.5 时即可用于转化。
或：将按上述方法培养的OD 600 为0.6-0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，5000 rpm 离心10 min，去掉上清液，菌体用1/2 MS液体（pH 5.4-5.8）培养基重悬，稀释至OD600 为0.2 左右，用于转化。
叶盘转化法
叶盘转化法叶盘转化法是一种常用的植物组织培养技术，通过将植物的叶片切割成小块，再在适宜的培养基上进行培养和生长，最终实现新植株的繁殖和繁衍。
这种技术不仅可以用于繁殖新品种的植物，还可以用于检测植物的遗传稳定性和抗逆性等特性。
下面将详细介绍叶盘转化法的原理、操作步骤和应用。
一、原理叶盘转化法的原理是利用植物的细胞再分化和再生能力，通过切割叶片并在培养基上提供适宜的营养物质和激素，使叶片细胞再分化为新的植物组织。
培养基中的激素可以促进细胞的分裂和分化，从而形成新的芽或根系。
经过适当的培养和生长，这些新的组织最终能够发育成完整的植株。
二、操作步骤1. 材料准备：选择健康、无病虫害的植物叶片作为材料，将叶片洗净并消毒。
2. 培养基制备：根据需要培养的植物种类选择合适的培养基配方，并按照比例将各种营养物质和激素溶解在适量的水中，调节pH值后加入琼脂。
3. 叶片处理：将洗净的叶片切割成小块，每块大小保持一致，避免过大或过小影响培养结果。
4. 培养基接种：将处理好的叶片块放置在培养基上，注意均匀分布，避免叶片重叠。
5. 培养条件控制：将培养基培养瓶密封并置于适宜的光照和温度条件下，定期观察培养基的湿润程度，并根据需要添加适量的水分。
6. 生长观察和移栽：经过一段时间的培养和生长，观察叶片上是否出现新的芽或根系。
若有，则可将其移栽到新的培养基或土壤中进行进一步培养和生长。
三、应用叶盘转化法在植物繁殖和繁衍中具有重要的应用价值。
首先，它可以用于繁殖新品种的植物。
通过选择具有优良特性的母本植株，利用叶盘转化法可以快速繁殖出大量具有相同特性的新植株。
其次，叶盘转化法也可以用于检测植物的遗传稳定性和抗逆性等特性。
例如，可以通过将转基因植物的叶片进行转化培养，观察新植株是否仍然保持了转基因特性，从而评估转基因植物的遗传稳定性。
此外，叶盘转化法还可以应用于植物的细胞工程和基因工程研究中，例如通过转化叶片细胞来引入特定的基因，实现植物的基因改良和功能性研究。
农杆菌介导的烟草转化
准备菌液LB 300ml(加抗生素Kan,Rif)
1L MS, 分装300ml (SIM,无抗生素20个平板)，500ml(SIM,有抗生素，倒培养瓶)，200ml（液体，做悬浮液）
Kan,Rif / Basta,Rif
1.根癌农杆菌的活化
挑取单菌落，接种于含抗生素的LB 液体培养基（Rif 50μ g/ml和Kan 50-100μg/ml）中，28℃-30℃200rpm 振荡培养过夜。
2.农杆菌介导叶盘法转化植物
①农杆菌菌体处理
挑取农杆菌菌株接种于LB培养基中（含rif 50μg/ml和kan50μg/ml），200rpm，28℃培养24h，菌液OD600至1.0 左右，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。
再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，稀释菌体的OD600值为0.3-0.5。
②叶盘法转化转化植物程序
选取理想状态的外植体，在超净台上剪成小方块或者打成叶圆片（大小不限），在制备好的农杆菌菌液中浸染3-5min，置于无菌吸水纸吸干，平铺于SIM （MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA）培养基（无抗生素）上黑暗共培养2 天，2天后将外植体转移至含筛选因子的芽诱导培养基如SIM（MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+Basta 5mg/L+500μg/ml的carb素或500Cef）上进行筛选。
待有芽生成（3~4周）后，继续培养到苗高2~3厘米时，转入生根培养基RIM（MS+ kan50μg/ml+500μg/ml的羧卞青霉素或500Cef）上，进行根诱导生长。
Cb: 羧卞青霉素; Cef:头孢霉素。
第九章 烟叶发酵的化学原理
第九章烟叶发酵的化学原理一名词解释1.烟草发酵：烟叶通过烘烤（或晾晒）和复烤后，在人工强化条件或自然条件下陈化一个过程，使烟叶内含物发生一系列化学或生物化学变化，减少原烟某些品质缺陷，使烟草香更加显露，吸食品质明显增强的一个卷烟加工极为重要的工艺环节。
2.人工发酵：在特定的人工强化温度和空气湿度的发酵室内，加速陈化烟叶，使其更符合吸食要求的烟叶发酵方式。
二填空题1.根据发酵条件和方法的不同，烟草发酵被分为自然发酵和人工发酵。
2.影响烟叶陈化的主要环境条件有温度、烟叶含水量和空气湿度、打包方式及光线。
3.发酵过程中干物质损耗主要表现为氧气的吸收和二氧化碳、水、氨、挥发性小分子物质的排出，最终导致干物质的减少。
4.影响干物质损耗的因素有烟叶等级、水分、烟包容量等。
5.烟草中发生的棕色化反应可分为有酶参与的棕色化反应和非酶棕色化反应。
6.棕色化反应机理复杂，影响因素较多，其中主要的影响因素有反应物的种类、反应温度、反应系含水量、反应时间、pH和压力等。
四问答题1.简述自然发酵和人工发酵的区别。
答：自然发酵是在库房室温条件下将烟叶贮存一段时间，在自然条件下陈化烟叶，使烟叶更符合吸食要求。
这种发酵方法被欧美和中国的云南普遍采用。
人工发酵是在特定的人工强化温度和空气湿度的发酵室内，加速陈化烟叶，使其更符合吸食要求的烟叶发酵方式。
2.为什么晒烟发酵过程中干物质损耗比烤烟大？答：晒烟烟叶在发酵过程中干物质的损耗比烤烟多，其原因主要是：一方面晒烟烟叶具有较高的原始水分；另一方面是在调制过程中，晒烟中的胶体物质未受到充分破坏，干制后烟叶仍具有较强的持水力。
此外，成熟度越差的烟叶，发酵时干物质损失越大。
3. 简述发酵后烟叶中水溶性有机酸增加的原因。
答：发酵后烟叶中水溶性有机酸增加的原因可以概括为以下四个方面：第一，部分氨基酸在酶促反应分解析出氨，使原来与氨结合的酸基以自由状态的酸存在。
第二，在烟叶发酵过程中，一部分有机酸矿物盐会发生组成形式上的变化。
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叶盘法转化烟草的原理
叶盘法是一种生物工程技术，用于转化或改造植物基因组以生产特定物质。
在烟草中应用叶盘法可以用于合成表达外源蛋白、开发抗病毒烟草品种以及烟草遗传改良等领域。
叶盘法的基本原理是利用植物的组织再生能力，通过培养植物的叶片组织培养而成的小体，在适当的培养基组合下，通过添加适当的物质和条件，将目标基因组转化至植物细胞中。
叶盘法的实验流程一般可以分为以下几个步骤：
1.植物材料的准备：从健康的烟草植株中采集叶片，并将其洗净，并进行无菌处理以确保实验的纯度。
2.建立愈伤组织：将洗净的叶片剪成小碎片，并将其转移到含有激素和培养基中，利用试管内的适宜条件培养愈伤组织。
这一步是为了为后续基因转化做好基础，并培养植物细胞的再生能力。
3.转化基因：将目标基因或转入质粒经过适当的处理和筛选，将其引入培养的烟草细胞中。
目标基因可以是外源蛋白的编码序列，用于生产特定蛋白质。
转入基因的方法包括生物颗粒轰击、体外基因传递和通过细菌介导的转化等多种方法。
4.培养变性细胞：转入基因的组织在适宜的培养条件下进行培养和筛选，以确保它们能够在细胞内稳定表达目标基因。
同时，还可以使用适当的抗生素来抑制未转化细胞的生长。
5.稳定转化的筛选：利用特定的筛选方法，筛选出稳定表达目标基因的转化细胞。
常用的筛选方法是利用抗生素抗性基因或镰刀形细菌素酶基因，通过添加抗生素或镰刀形细菌素酶底物来诱导或检测转过的细胞。
6.进一步培育和鉴定：将经过筛选的转化细胞进行进一步培养，培育出大量具有目标基因的烟草植株。
同时，对植株进行鉴定和检测，确认目标基因的稳定性和表达水平。
通过以上步骤，叶盘法能够有效地将外源基因导入到烟草植株的基因组中，并使其稳定表达。
通过优化培养条件和基因的筛选方法，可以进一步提高转化效率和稳定性。
叶盘法的优点在于操作简单、转化效率高、转基因植株易于培养和大规模扩繁等。
然而，叶盘法也存在一些局限性，如转化效率和稳定性的波动性、可能引发的遗传不稳定性等问题，需要进一步的优化和改进。