鸡胚繁殖病毒技术
病毒的鸡胚培养
病毒的鸡胚培养一、目的掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理二、实验内容1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鲜种蛋。
15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。
每2小时翻番一次。
2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。
于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。
3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释（20倍）,尿囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。
每日照蛋一次，弃去72h内死亡鸡胚。
至120h全部取出于4℃冰箱过夜。
4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。
5、HA效价测定：原理。
1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。
血凝试验按下表操作。
病毒鸡胚培养病毒培养可用动物接种、鸡胚培养和组织培养法。
鸡胚接种培养是病毒学的重要方法之一，来自禽类的病毒，均可在鸡胚中繁殖，哺乳动物的病毒如蓝舌病病毒、流感病毒等也可在鸡胚中增殖。
目前鸡胚尤其是SPF、鸡胚被广泛利用于分离病毒、制造疫苗和抗原等，其来源丰富，操作简便。
除病毒外，衣原体、立克次氏体也可用鸡胚来培养，衣原体可在鸡胚卵黄囊繁殖，致死鸡胚；部分立克次氏体也可在卵黄囊中繁殖。
[目的要求](1)掌握鸡胚的孵化过程和不同日龄鸡胚的接种途径和接种方法。
(2)掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔增殖过程，掌握接毒和收毒的方法。
[实验材料]白壳鸡胚、孵化箱、1mL注射器、蛋架、新城疫工系和Ⅱ系弱毒苗等。
[实验准备]1．鸡胚的选择和孵化应选健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。
为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。
用孵卵箱孵化，要特别注意温度、湿度和翻蛋。
孵化条件一般选择相对湿度为60％，最低温度36℃，一般37．5℃。
实验六十四 鸡胚胎接种技术
微生物學實驗11-7實驗六十四 雞胚胎接種技術增殖病毒以供病毒學研究用。
很多病毒皆能在雞胚胎之某些部位增殖，例如各種痘病毒在絨毛尿囊膜上增殖良好，而禽流感病毒、新城病病毒都很容易在尿囊腔內增殖，藉由收取尿囊液可獲得大量增殖之病毒，可做為疫苗製造、診斷試劑以及其他病毒學研究之用。
(一) 材料1. 5-6日齡與9-11日齡之雞胚胎蛋2. 病毒接種液3. 1 ml 針筒附26號5/8吋針或23號1又1/3吋針4. 碘酒5. 打洞用鐵釘6. 融化之液態蠟(二) 設備1. 照蛋器2.37℃培養箱第十一章 病毒與血清學的相關技術11-8(一) 尿囊腔接種（allantoic cavity inoculation ）：1. 取9-11日齡之雞胚胎蛋。
2. 以照蛋器透視雞胚胎蛋，調整蛋之位置使氣室在上端，於氣室邊緣上方約 5 mm 以及雞胚之對角處作記號。
3. 以碘酒徹底擦拭消毒後於記號處打洞。
4. 用26號5/8吋針垂直插入洞內約1.2-1.3公分，注入0.1-0.2 ml 之接種液。
5. 以融化之蠟封住洞口。
(二) 卵黃囊接種法（yolk-sac inoculation ）1. 取5-6日齡之雞胚胎蛋。
2. 調整蛋之位置使氣室在上端。
3. 以碘酒徹底消毒後於氣室端做記號並打洞。
4. 以23號1又1/3吋針垂直插入洞內，注入0.5-1.0 ml 之接種液。
5. 以融化之蠟封住洞口。
(三) 絨毛尿囊膜接種法（chorio-allantoic membrane inoculation ；CAM ）1. 取9-11日齡之雞胚胎蛋。
2. 水平調整蛋之位置使氣室在右側。
3. 藉由照蛋器之透視，選擇胚胎之相對位置處，以碘酒徹底消毒後做記號並 打洞。
4. 另外在氣室端也以碘酒徹底消毒後做記號並打洞。
5. 以矽膠吸球吸附於氣室端洞口，原先胚胎相對位置處之絨毛尿。
微生物學實驗11-96. 囊膜集陷落而形成一人工氣室。
7. 以23號針將0.5-1.0 ml 之接種液注入人工氣室上之洞內。
《动物病毒学实验》课件：实验一 病毒在鸡胚中的培养
一、原理
鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易 于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的 组织和液体中含大量病毒。
二、实验目的
了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的鸡胚 接种方法。
三、鸡胚的结构与功能
➢卵壳 ➢壳膜 ➢气室 ➢绒毛尿囊膜
➢尿囊腔 ➢羊膜与羊膜腔 ➢卵黄 ➢卵白
五、受精卵的选择
➢最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 ➢受精卵的壳最好是白色的 ➢受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，
保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
六、孵育
➢温度：37.5-38.5℃ ➢相对湿度：50%-60% ➢新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后 ➢翻卵：从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。
十一、NDV接种鸡胚后对鸡胚的影响
NDV以尿囊腔接种于9-10日龄鸡胚，强毒株 在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的鸡胚 以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、 足趾、翅膀出血尤为明显。
十二、收毒
收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上，冻死 胚胎，防止出血。
根据接种途径的不同，收获相应的材料 1. 绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜 2. 尿囊腔接种 收获尿囊液（5-8ml） 3. 卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体 4. 羊膜腔接种 收获羊水（0.5-1ml）
• 实验结果观察：周四下午3:50 • 走之前签到，不能代签 • 实验报告选择思考题中3题作答
6.用1ml注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
7.用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中， 周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用 石蜡密封。
8.胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
（三） 尿囊腔接种 主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病
鸡胚接种实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡胚接种病毒的方法和步骤。
2. 了解病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
3. 学习病毒分离和培养的基本原理。
二、实验原理鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法。
病毒接种于鸡胚后，能够在鸡胚中繁殖，从而便于观察和分析病毒的生物学特性。
本实验主要采用尿囊腔接种法，将病毒接种于鸡胚尿囊腔内，观察病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
三、实验材料1. 实验动物：9-11日龄的鸡胚。
2. 实验试剂：新城疫病毒悬液、生理盐水、碘酒、酒精、消毒棉球等。
3. 实验仪器：照蛋器、无菌手术刀、镊子、注射器、剪刀、平皿等。
四、实验方法1. 鸡胚准备：取9-11日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒鸡胚蛋壳，用手术刀在鸡胚气室处划一小孔，用注射器吸取适量新城疫病毒悬液。
2. 尿囊腔接种：将鸡胚置于卵盘上，气室端向上，用注射器将病毒悬液注入鸡胚尿囊腔内，注入量约为0.1-0.2ml。
3. 孵育：将接种后的鸡胚放入37℃孵卵箱中孵育48-72小时。
4. 观察：定期观察鸡胚的生长发育情况，记录死亡、畸形等现象。
5. 病毒分离：取出死亡鸡胚，无菌操作下取出尿囊液，进行病毒分离和培养。
五、实验结果1. 接种后，部分鸡胚出现死亡现象，死亡时间集中在接种后24-48小时。
2. 死亡鸡胚的尿囊液中检测到新城疫病毒。
3. 成活鸡胚生长发育正常，未出现明显异常。
六、实验讨论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法，适用于多种病毒的研究。
2. 尿囊腔接种法是一种常用的鸡胚接种方法，适用于新城疫病毒、流感病毒等多种病毒。
3. 本实验结果表明，新城疫病毒能够在鸡胚中繁殖，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
七、实验结论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法。
2. 尿囊腔接种法适用于新城疫病毒等多种病毒的分离和培养。
3. 本实验成功分离和培养了新城疫病毒，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
八、实验心得1. 实验过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
病毒的鸡胚接种
病毒的鸡胚接种教学目标使学生掌握病毒的鸡胚接种方法和收获方法。
材料准备1.器材温箱、照蛋器、蛋架、超净工作台、1 mL注射器、20～27 号针头、镊子、酒精灯、灭菌吸管、灭菌滴管、灭菌青霉素瓶、铅笔、透明胶纸等。
2.种毒新城疫病毒悬液。
3.受精卵健康鸡群的受精卵，无母源抗体，产后10 d之内5 d最佳。
4.其他石蜡，质量分数为2.5%的碘酊及质量分数为75%的酒精棉球。
方法步骤（一）鸡卵的保存、孵育及检卵1.保存孵育前，保存在4.5～20 ℃的室温内，以10 ℃左右最佳，最多不能超过10 d。
2.孵育先将温箱调节温度为37.3～37.8 ℃，湿度45%～60%。
将鸡卵孵入后，每日翻卵2～3次。
3.检卵孵后第4~6 d，用照蛋器检查发育情况，检出未受精及死亡鸡胚。
鸡胚的生长情况分为以下几类：（1）未受精 4 ~6d后仅见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
（2）生活鸡胚 4~6 d后可见到清晰的血管小团，内有鸡胚暗影，较大的鸡胚可见胚动。
（3）濒死或死亡鸡胚鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落。
（4）作标记将待接种的鸡胚取出，在照蛋器上照视，划出气室范围，并在鸡胚黑影，或绒毛尿囊膜发育中心等处，按接种途径要求标出记号。
（二）各种途径的鸡胚接种方法1.尿囊腔接种（1）接种方法孵育9～11日龄的鸡胚（实图6-20），经照视后，划出气室及胚胎位置，标明胚龄及日期，气室朝上立于卵架上。
在气室中心或远离胚胎侧气室边缘先后用碘酊棉球及酒精棉球消毒。
以钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3 mL新城疫病毒悬液，拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化（实图6-21）。
孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。
弃去接种后24 h内死亡的鸡胚。
实图6-20鸡胚的结构实图6-21尿囊腔接种（2）收获方法收获时间须视病毒的种类而定。
新城疫病毒在接种后24～48 h 即可收获病毒。
病毒的鸡胚培养法
（四）收获病毒
鸡胚为活的有机体，因此要严格无菌操作， 同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种 后24小时内死亡应不计结果。
病 毒 的 鸡 胚 培 养 法
刘映乐
1911年 Rous首先将鸡胚应用于Rous肉瘤病 毒的培养 1938年 Cox应用卵黄囊培养立克次氏体
鸡胚培养法的优点：
1. 组织分化程度低
2. 有神经血管的分布及脏器的构造
3. 来源充足，操作简单 4. 胚体通常无菌
5. 对接种的病毒不产生抗体
鸡胚培养法的缺点：
（三）接种途径
尿囊腔接种
该途径一般用于病毒的（流感、新城鸡瘟病毒 和腮腺炎）适应和传代。
尿囊腔接种
卵黄囊接种
该途径主要用于抗病毒（流感）的药物实验。
羊膜腔接种
该途径主要用于临床材料（如患者的鼻洗液及咽 漱液）的病毒分离。
绒毛尿囊膜接种
该途径主要用于病毒滴定、中和试验和药物实验。
1. 病毒通常不能使鸡胚产生特异性的感染指征。 2. 常规饲养方式的不足
3. 培养病毒的种类有限
鸡胚的结构与生理
鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，中胚
层和内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官
鸡 胚 培 养 的 病 毒 接 种（一）活胚检查 Nhomakorabea1.血管
2.胎动 3.绒毛尿囊膜
（二）实验材料
鸡受精卵, 照蛋灯, 打孔器或剪刀, 蛋盘, 无菌注 射器和针头, 消毒酒精, 酒精灯, 石腊 病毒毒种用生理盐水稀释备用
鸡胚繁殖病毒技术
二、鸡胚的孵化
• 1、消毒 • 新入孵的种蛋都要进行表面消毒，一般采用消毒 液浸泡或福尔马林熏蒸。 • 0.1%～0.2%的新洁尔灭溶液浸泡。 • 福尔马林熏蒸：种蛋放入孵化器后，孵化器温度 达到37℃，相对湿度达到90%，每立方米用13ml 甲醛和6.5g高锰酸钾，放入烧杯中混合，迅速放 入孵化器中关闭箱门，20分钟后打开箱门，通风 排除甲醛蒸汽，继续孵化。
2、病毒含量测定：
• 可以根据情况多瓶混合后进行检验，根据 不同的病毒采用不同的方法测定病毒含量， 为配苗提供依据。
3、其他检验：
• 支原体检验、外源病毒检验、安全检验等， 一般半成品不做，只检验成品。
七、病毒液的保存
• 经过检验的病毒液应马上加入抗生素，防 止细菌污染，塞上胶塞，放-15℃冷库保存， 保存期限视不同病毒而定，一般不应超过6 个月。
2、孵化
• 种蛋的孵化一般温度设定为38℃，相对湿 度设定为65%，每天翻蛋1～4次。 • 孵化过程中要求有专人管理，记录种蛋的 入孵时间、数量、出蛋时间、数量，还要 每4小时记录孵化器内的温度、湿度等参数， 如果遇到故障应马上报告以便及时进行维 修，避免造成损失。
三、鸡胚接种
• 鸡胚接种前要先进行检蛋，选择发育良好、 血线清晰的鸡胚。发育不良或没有发育 （没有受精）的、变黑的、死亡的鸡胚应 弃去不用。
四、接种后鸡胚的检验
• 接种后24小时照蛋，挑出死亡的鸡胚弃去 不用。 • 以后每4～6小时照蛋一次，随时取出死亡 的鸡胚，放入2℃～8℃冷库中冷胚。
五、收获病毒液内，先 用5%的碘酊在鸡蛋的气室处涂抹 消毒，15分钟后用75%的酒精脱碘。
2、收获：根据不同的病毒收获不同的成 分，最常用的是鸡胚尿囊液。用大镊 子剪去气室部分的蛋壳，注意蛋壳的 碎屑不要掉到里面，用灭菌的医用眼 科镊子斜插入绒毛尿囊膜内，压向胚 胎一侧，用玻璃吸管把尿囊液吸入无 菌的500ml瓶中，尽量把胚液吸净。 3、编号：把收获的病毒液每瓶贴上标签， 注明名称、批号、编号、生产日期等 信息，避免混淆。
病毒的鸡胚培养法
卵黄囊接种
鸡胚的各种接种途径
1.绒毛尿囊膜接种 2.尿囊腔接种 3.羊水腔接种 4.卵黄囊接种
3.收毒：病毒的收毒根据接种的途径而定。
绒毛尿囊腔内接种 ★★
尿囊液
绒毛尿囊膜接种
绒毛尿囊膜
羊膜腔接种 卵黄囊内接种
羊水 卵黄液和卵黄膜
4.废料处理
• 操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦净 后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚胎等 残物煮沸消毒后弃去。
• b.病毒材料的准备：要分离培养的病毒材料应
是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按 照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每 1000羽份配成250ml,为达到无菌的目的，可在 每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各1005000IU，置室温中1h处理。
法氏囊病毒的分离
• 取疑似感染病毒的法氏囊，称重，按1:5 （w/v）加入生理盐水，研磨，-20℃，反复 冻融2次；每次冷冻时间以研磨物结冰为准；
绒毛尿囊膜接种
1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜
羊膜腔接种
取10-12日龄的鸡胚，消
毒气室顶上的蛋壳，并
将气室顶端的蛋壳锉一
三角形的裂痕，用灭菌
镊子揭去裂痕部位的蛋
壳和壳膜，用灭菌平头
镊子刺破尿囊膜，并轻
轻夹去羊膜，用小号针
头刺进羊膜腔内，注入
0.05-0.1ml的病毒接种
液，以氧化锌胶布封口，
滴上溶化的固体石蜡。
（三）实验器材
• 1.鸡胚：要选择SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。
从实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所以 要用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽流感 病毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖致死鸡 胚。
• 孵化前的鸡胚应注意消毒，置37-38℃、相对湿
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2、孵化
• 种蛋的孵化一般温度设定为38℃，相对湿 度设定为65%，每天翻蛋1～4次。 • 孵化过程中要求有专人管理，记录种蛋的 入孵时间、数量、出蛋时间、数量，还要 每4小时记录孵化器内的温度、湿度等参数， 如果遇到故障应马上报告以便及时进行维 修，避免造成损失。
三、鸡胚接种
• 鸡胚接种前要先进行检蛋，选择发育良好、 血线清晰的鸡胚。发育不良或没有发育 （没有受精）的、变黑的、死亡的鸡胚应 弃去不用。
2、病毒含量测定：
• 可以根据情况多瓶混合后进行检验，根据 不同的病毒采用不同的方法测定病毒含量， 为配苗提供依据。
3、其他检验：
• 支原体检验、外源病毒检验、安全检验等， 一般半成品不做，只检验成品。
七、病毒液的保存
• 经过检验的病毒液应马上加入抗生素，防 止细菌污染，塞上胶塞，放-15℃冷库保存， 保存期限视不同病毒而定，一般不应超过6 个月。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1、接种方法：
• 根据不同的病毒（或其他微生物）选择不 同的接种方法。包括尿囊腔接种、绒毛尿 囊膜接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、静 脉接种、脑内接种等。
• 其中最常用的方法是尿囊腔接种，方法是 取9～10日龄鸡胚，画出气室范围，离气室 边缘0.3～0.5mm无大血管处做一个记号， 作为接种孔的位置。先用5%的碘酊消毒， 15分钟后用75%的酒精脱碘，然后用消毒 的锥子在记号处打一个小孔，用1ml注射器 的针头刺入0.5～1cm，注入种毒，用白蜡 封口。接种后继续孵化，一般温度设定为 37℃左右，相对湿度设定为70%～90%， 继续孵化2～7天，不必翻蛋。
四、接种后鸡胚的检验
• 接种后24小时照蛋，挑出死亡的鸡胚弃去 不用。 • 以后每4～6小时照蛋一次，随时取出死亡 的鸡胚，放入2℃～8℃冷库中冷胚。
五、收获病毒液
1、 消毒：
• 把冷却好的鸡胚放入无菌室内，先 用5%的碘酊在鸡蛋的气室处涂抹 消毒，15分钟后用75%的酒精脱碘。
2、收获：根据不同的病毒收获不同的成 分，最常用的是鸡胚尿囊液。用大镊 子剪去气室部分的蛋壳，注意蛋壳的 碎屑不要掉到里面，用灭菌的医用眼 科镊子斜插入绒毛尿囊膜内，压向胚 胎一侧，用玻璃吸管把尿囊液吸入无 菌的500ml瓶中，尽量把胚液吸净。 3、编号：把收获的病毒液每瓶贴上标签， 注明名称、批号、编号、生产日期等 信息，避免混淆。
六、病毒液的检验
• 1、无菌检验： • 收获的病毒液如果用于冻干苗的生产要逐瓶进行 无菌检验。 • 检验方法：先准备好检验培养基每套2支酪胨琼脂 和2支硫乙醇酸盐，将培养基与收获的病毒液对应 编号，每瓶病毒液用灭菌的注射器抽取2ml左右， 每支加入0.5ml左右，盖好塞后分别放入37℃和 25℃培养箱中培养，5天后观察结果，固体培养 基斜面上有菌生长、液体培养基变浑浊的判为污 染，应弃去不用。
二、鸡胚的孵化
• 1、消毒 • 新入孵的种蛋都要进行表面消毒，一般采用消毒 液浸泡或福尔马林熏蒸。 • 0.1%～0.2%的新洁尔灭溶液浸泡。 • 福尔马林熏蒸：种蛋放入孵化器后，孵化器温度 达到37℃，相对湿度达到90%，每立方米用13ml 甲醛和6.5g高锰酸钾，放入烧杯中混合，迅速放 入孵化器中关闭箱门，20分钟后打开箱门，通风 排除甲醛蒸汽，继续孵化。
鸡胚繁殖病毒技术
2012年10月
• 许多病毒尤其是禽源病毒都能 在鸡胚中生长繁殖，利用鸡胚 可以进行病毒的分离、鉴定、 抗原制备和疫苗生产。除了鸡 胚外，鹅胚和鸭胚也可以用于 某些病毒的增殖。
一、鸡胚的选择
• 1、冻干苗应选择受精率比较高的（90%以 上）SPF种鸡蛋，鸡蛋必须新鲜、洁净。原 因是SPF种鸡蛋不携带致病微生物，生产出 来的疫苗更安全。SPF种鸡蛋没有干扰病毒 增殖的母源抗体，与普通种蛋相比能明显 提高病毒含量。 • 2、灭活苗可以选择受精率比较高的（90% 以上）普通低免疫蛋，好处就是成本比较 低。