血管内皮细胞培养
杰特细胞培养标准
杰特细胞培养标准
杰特细胞是一种血管内皮细胞，主要用于研究血管生成和血管疾病的发生机理。
以下是杰特细胞培养的标准：
1. 培养基选择：常用杰特细胞培养基为DMEM/F12，其中含10%胎牛血清、1% L-谷氨酸、10 ng/mL VEGF、50 U/mL 青霉素和50 μg/mL链霉素。
2.杰特细胞分离：杰特细胞来源于人类肾小管上皮细胞系，通常用酶法、细胞贴壁法或洗涤法等方法将细胞从组织中分离。
3.细胞培养条件：细胞在37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。
根据杰特细胞的特性，在细胞达到60%～80%的密度时，应及时处理。
4.细胞传代：当细胞密度到达85%～90%时，需要进行细胞传代，通常采用胰酶或三胺基乙烷酸法进行分离，每次分离后对细胞株进行鉴定。
5.细胞检测：杰特细胞常用的检测方法有细胞形态观察、免疫荧光染色、流式细胞术等，以确保细胞的鉴定和纯化。
6.冻存条件：培养的细胞必须进行冻存备份，通常使用10%DMSO作为冷冻液，保存在液氮中。
7.细胞应用：杰特细胞可以应用于各种相关研究和实验中，如血管生成、心血管疾病等。
血管内皮细胞—平滑肌细胞共培养体系研究进展
血管内皮细胞—平滑肌细胞共培养体系研究进展血管内皮细胞（endothelial cells，EC）和血管平滑肌细胞（smooth musclecells，VSMC）的相互作用、相互影响维持血管生理功能和多种疾病的发生发展，EC-SMC联合培养模型是目前研究这2种细胞间相互影响的最佳方式。
作者对现有的EC-SMC共培养模型及共培养对这2种细胞结构和功能的影响进行综述，为在微观上深入研究二者的相互关系提供依据，也为建立更接近机体生理/病理状态的EC-SMC体外共培养体系提供参考。
标签：内皮细胞；平滑肌细胞；共培养；相互作用血管内皮细胞（endothelial cells，EC）和血管平滑肌细胞（smooth muscle cells，VSMC）是构成血管壁的主要细胞成分，2种细胞间的相互作用、相互影响是维持血管生理功能和血管壁自身结构稳定的关键，在病理条件下EC和SMC的相互作用同样可影响多种疾病的发生发展。
EC-SMC联合培养模型是目前研究这2种细胞间相互影响的最佳方式，对研究动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）发病机制、血管壁生理及炎症反应等有重要意义。
本文就目前EC-SMC共培养模型和共培养模式下2种细胞的互相影响做一综述，为在微观上深入研究二者的相互关系提供依据。
1 EC-SMC共培养模型1.1 直接接触的共培养模式早在20世纪80年代，国外学者就开始尝试建立EC-SMC共培养的方法。
早期研究简单地将EC和SMC按一定的比例混合，种植在同一体系中，2种细胞能够混合生长，且相邻的EC和SMC之间形成连接[1]。
此模型较为原始，细胞混杂，EC和SMC没有形成生理状态下的结构层次，且2种细胞之间干扰较大。
在此基础之上，Davies等[2]引进了微载体技术，即将2种细胞分别种植于微载体上，然后将微载体混合于同一体系，实验中相邻的微载体上同型或异型细胞间都形成接触连接。
这种方法很好地将2种细胞分离培养，使其能独立存在，从而为单独研究联合培养体系中某一种细胞提供了方便，但仍然不能反映生理状态下细胞的生长结构层次关系。
人视网膜血管内皮细胞的分离与培养
人视网膜血管内皮细胞的分离与培养作者：李琼徐国兴来源：《海峡科学》2007年第12期[摘要] 目的：探讨人视网膜血管内皮细胞的体外分离和选择性培养方法。
方法：将人视网膜通过剪碎、匀浆、过筛、胶原酶消化处理后，结合密度梯度离心和物理刮除等分离方法获得较纯的视网膜血管内皮细胞，接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并采用含内皮细胞生长因子和肝素的培养基促进内皮细胞贴壁生长，观察细胞生长状况，并应用免疫组化方法进行鉴定。
结果：培养的细胞成典型的铺路石样生长，Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色为阳性，细胞纯度达98%以上。
结论：本实验方法简单易行，培养出的人视网膜血管内皮细胞纯度高、生长状态良好，并可稳定传代，为视网膜血管疾病的基础研究提供有效的模型建立方法。
[关键词] 视网膜微血管内皮细胞细胞培养许多视网膜疾病如糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等均与视网膜血管病理性改变密切相关。
随着对视网膜血管性疾病的研究深入发现视网膜血管内皮细胞是血管病变过程中的关键细胞。
通过体外分离培养视网膜血管内皮细胞获得大量完整、纯度高的内皮细胞，从而对其进行形态、结构、生理功能和病理变化等方面的观察，为视网膜血管性疾病研究提供体外模型。
本实验综合国内外几种方法，以人视网膜为材料，探索简便、有效的人视网膜微血管内皮细胞的培养方法。
现报告如下：1 材料与方法1.1 材料0.1%Ⅱ型胶原酶（Sigma公司，美国）、胎牛血清(Gibco公司，美国) 、DMEM培养液(Gibco公司，美国)、含0.02%EDTA的0.25%胰酶(Gibco公司，美国)、纤维连接蛋白（Sigma 公司，美国）、内皮细胞生长因子ECGF(Sigma公司，美国) 、Percoll分离液（Gibco公司，美国）、肝素（Sigma公司，美国）、PBS（Sigma公司，美国）、培养瓶、培养皿、眼科器械、匀浆器、吸管、离心管、细胞筛、第Ⅷ因子相关抗原抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，完全培养液：DMEM培养液+15%FBS+90ug/ml肝素+0.1ug/L的ECGF，培养瓶：培养前1天用10ug/cm2纤维连接蛋白包被。
人脐静脉血管内皮细胞HUVEC
第三：铺板加样方法错误。
• 6孔、12孔、24孔、48孔与96孔的细胞接种铺板过程中，你的 加样方式是哪种？你觉得加样方式对后期的接种均匀度影响大 吗？例如你是否有过垂直加入96孔板的经历？是不是有的孔就 比较均匀，而有的孔就聚集在了一起？六孔板怎么摇晃也不均 匀？其实也许你离铺好板就差一种适合你的方法。
• 2、不是所有细胞消化后都会变成圆形
• 有些细胞(比如U87，U251)消化好了也不会变成圆形， 只是呈半沙状。
• 3、有些细胞即使变圆，也有脱落的细胞，但还是没消化好 • 比如7860，要等到大部分细胞脱落培养皿底部才可以停
止消化，否则很难吹打下来，这种情况一般发生于难以消化 的细胞。
• 4、对于一些特殊的细胞需要消化过一点 • 有些细胞吹成单个细胞反而对细胞的状态会好一点，一
6孔板、12孔板或24孔板
• 为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象。通常 每孔首先滴加少量培基，轻轻晃动浸润整个孔底以保证板子 的孔底都是湿润的，这样加液后细胞悬液会平铺在整个孔底， 可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多 的现象，细胞分散会较均匀。注意加完细胞悬液后要放工作 台静置一下（5-10分钟）。镜下观察细胞均匀度，如不均匀 可采用以下8字法、十字法及震荡法等方法进行细胞均匀度 处理
• HUVEC细胞培养难度较高，建议使用内皮细胞专用培养基， 选用优质胎牛血清。细胞推荐传代比例为1:2-1:3，胰酶消化室 温1-2分钟，传代周期通常为3-4天。需要注意的是，如 HUVEC出现聚团生长，可能由于培养板亲水性差或者血清中 促贴壁因子不足，可考虑用人纤维粘连蛋白包被培养板，能有 效预防细胞聚团。
第二：细胞吹打次数不够，细胞悬
液密度不均匀。
内皮细胞的培养
内皮细胞的培养内皮细胞，用高倍镜观察肠系膜上的毛细血管，可见到内皮细胞，内皮细胞较间皮细胞小，排列紧密。
内皮细胞或血管内皮是一薄层的专门上皮细胞，由一层扁平细胞所组成，呈多边形，细胞的边缘呈锯齿状，相互嵌合。
血管内皮细胞（EC）位于血液与血管组织之间，它不仅能完成血液和组织液的代谢交换，并且能合成和分泌多种生物活性物质，以保证血管正常的收缩和舒张，起到维持血管张力，调节血压以及凝血与抗凝平衡等特殊功能，进而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。
抗凝血材料表面内皮细胞化，可以减少血栓的形成和血小板激活。
下面以脐带静脉为例介绍内皮细胞的培养：一、试剂准备：（1）脐带保存液：生理盐水、葡萄糖100 mmoL/L、100 U/ml青霉素一100 U/m1链霉素。
（2）组织消化液：0．1％I型胶原酶和0．05％胰酶-0．02％乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液。
（3）内皮细胞培养液：含20％胎牛血清、ECGS、肝素，100 U／m1青霉素-100 U／m1链霉素的M199培养基。
（4）器皿：0．2％明胶包被：用PBS配制。
二、原代提取（1）脐带处理：在无菌条件下取新生胎儿脐带，长度>20 cm。
剪去脐带两端和脐带上有夹痕及血肿部分，尽量挤干净脐带内血液。
用生理盐水冲洗脐带表面至无血色。
（2）脐静脉处理：用输血器内接有穿刺器的软管，找到脐静脉，将软管针头一端插入脐静脉，用止水夹固定，另一端接20 m1注射器，吸取PBS反复冲洗脐静脉直至无血色液体流出为止。
（3）组织消化：将脐带另一端用止血钳夹闭，向脐静脉中灌入0．1％I型胶原酶溶液，使之充盈，夹闭软管，37℃水浴中孵育20 min，其间轻轻挤压并旋转脐带，以使酶溶液充分接触血管内壁，然后将细胞一酶溶液收集于预先装有温培养液小三角瓶中。
（4）收集细胞：用2倍于消化液的温PBS冲洗脐静脉，一并收集于小三角瓶中，将细胞悬液装入10 ml离心管，（5）离心培养：1 000 r／min离心10 min，弃上清，吹打悬浮，再次离心10 min，重悬细胞并接种于铺有明胶的25 cm2培养瓶中，置于37℃5％C02饱和湿度培养箱中培养，24 h 后更换培养液，以后每隔2 d换液1次。
大鼠血管内皮祖细胞培养及鉴定
中西 医 结 合 心 脑 血 管 病 杂 志 ２ １ ０ ０年 ５月 第 ８ 第 ５期 卷
・５ ３ ６ ・
大 鼠血 管 内皮 祖 细 胞 培 养 及 鉴 定 Ｄ
朱
摘要 ： 的 目
江 ， 煜 敏 ， 朝红 ， 文 欣 刘 孔 道
探 索 骨 髓 来 源 的 血 管 内 皮祖 细 胞 的 分 离培 养 方 法 ， 缺 血 性 疾病 治 疗 找 到 新 的 移 植 细 胞 来 源 。 方 法 采 集 Ｓ 雄 为 Ｄ
组 经过 ＣＤ３ ４免 疫 荧 光 、 ＣＤ１ ３、 ３ ＦＬＫ一１免 疫 组 化 鉴 定 呈 阳 性 ， 能特 异 性 吸ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ附 Ｆ ＴＣ—ＵＥ 一 内吞 ＤＩ 并 Ｉ Ａ 和 Ｉ 一Ａｃ —ＬＤＬ。 结 论 自体
骨髓 细胞 通 过 贴壁 换 液后 可 以分 离培 养 出 内皮祖 细 胞 ， 贴 壁 细 胞 经 过 体 外 诱 导后 大 量 扩 增 ， 通 过 表 面 标 记 物 鉴 定 可 以确 认 为 内 取 并 皮 祖 细 胞 ， 非 贴 壁 细 胞 不 能 大 量增 殖 ， 将 贴 壁 分 离方 法 来 筛选 内皮 祖 细胞 ， 方 法 简 易 ， 能 满 足 细 胞 移 植 的 需要 ， 而 故 此 并 因而 ， 移 植 在 治 疗 脑 缺 血 引起 的 内皮损 伤 应 该 有 较 好 的 临床 应 用 前 景 。
血管内皮细胞培养方法
血管内皮细胞培养方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）是血管内膜上的一种细胞，它们起着维持血管结构和功能的重要作用。
近年来，血管内皮细胞的培养方法逐渐成为生物医学领域的研究热点之一。
良好的血管内皮细胞培养方法不仅有助于研究心血管疾病的发生机制，还可以为新药的研发提供重要参考依据。
本文将详细介绍血管内皮细胞培养的方法和技巧，希望对相关研究人员和医学工作者有所帮助。
一、血管内皮细胞来源血管内皮细胞可以从多种来源获得，包括人类或动物的血管组织。
通常情况下，从人体的脐带血、外周血或组织中分离得到的血管内皮细胞具有较高的纯度和活性，适合于体外培养。
一些商业生物技术公司也提供血管内皮细胞的原代细胞培养服务，可以方便地购买到高质量的细胞用于研究。
二、血管内皮细胞培养基的选择血管内皮细胞培养基是培养血管内皮细胞的基本营养液，不同类型的细胞需要不同种类的培养基。
一般来说，常用的血管内皮细胞培养基包括Eagle's minimum essential medium（EMEM）、Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）和Medium 199等。
这些培养基通常含有必需氨基酸、维生素、矿物质、生长因子、胎牛血清等营养成分，可以提供适宜的环境促进细胞生长。
1、原代细胞的分离和培养将采集到的组织样本进行酶消化处理，分离出血管内皮细胞，并通过贴壁法或悬浮培养法将其传代培养。
在传代培养的过程中，需要定期更换培养基、观察细胞的形态和数量变化，以确保细胞的健康生长。
2、细胞的传代和冻存随着细胞的传代次数增加，细胞的增殖能力和活性逐渐下降，需要进行细胞的传代和冻存。
传代前需要对细胞进行细胞数计数和活力检测，传代后要及时观察细胞的形态和生长情况，确保细胞的健康状态。
3、细胞的实验处理在进行实验前，需要对培养的细胞进行处理，如细胞分裂抑制（如丙酮酸、羟基脲等）、细胞增殖刺激（如VEGF、EGF等）等。
脑微血管内皮细胞的培养及鉴定
试验步骤
10.混匀后放入37℃摇床中消化，30分钟左右取出一 滴至镜下观察，如见到大量细短串状的微血管（3、 4个细胞一串），则表示消化适度，3000－ 4000rpm 5分钟离心；如为大团状或已成单个细胞， 则消化不足或消化过度。
beforeafter Nhomakorabea试验步骤
11.离心后弃上清，以PBS 3000－4000rpm 5分钟 离 心，得到的沉淀以2－3ml细胞培养液冲散、混匀， 放入37℃、5％CO2孵箱培养，5个小时左右后再加 入1－2ml培养液。此为原代细胞P1（[=parental generation]亲代） 之后每日观察细胞状况，贴壁前2－3日半换液，全 部细胞贴壁后视培养液情况每1－2日全换液一次。 细胞铺满瓶底80％左右即可考虑传代及冻存。
6.培养基（以下各浓度均为终浓度）：RMPI 1640，10％FBS， 10％NuSerum，ECGS 30μg/ml，1％双抗，肝素5 U/ml，L谷氨酰胺2mmol/L，1mmol/L丙酮酸钠，MEM non-essential amino acids，MEM vitamins各1％。各组分过滤后混合。 4°c保存。
试验步骤
7.吸出上层液体及白色脂质， 以1－2ml PBS小心冲散红 色目标沉淀物（即含有微血 管的组织），尽量将目标物 冲洗尽，然后将PBS－组织 悬液吸入干净的离心管。
试验步骤
8.取40-45mlPBS加入离 心管中， 3000rpm,4°c离心 5min。重复2次。其 目的是将葡聚糖洗脱。
4. 组织洗涤液：2％FBS，10％双抗（如为无菌手术标 本则为2％），DMEM。4℃保存。 FBS需先56℃灭活过滤、分装。－20℃保存。
试剂配制
5.100ml 10×PBS(其中不能含有钙以及镁离子)： 80ml蒸馏水中溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，用NaOH调节pH至 7.4加水定容到100mL，取20ml 10×PBS，加入 180ml去离子水，配成200ml PBS，高压灭菌，室 温或4°c保存。
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血管内皮细胞（endothelial cell, EC）体外培养1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。
EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。
其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。
EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。
EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。
体外培养中的EC形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。
2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。
人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。
2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。
2.2 介绍几种主要EC的分离2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管）a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。
b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。
c．注入0.1%胶原酶（1型）溶液，待血管内残留的D-Hanks液流尽后，用注射器封注另一端针头，继续注入胶原酶溶液，致血管充盈，放入37℃无菌的D-Hanks液中，消化15min后取出。
d．收集血管内酶溶液，并且注入含20%小牛血清的M199培养液（pH 7.2）冲洗血管收集合并于同一容器内，以1000r/min离心7～10min。
e．去上清液，加入20%小牛血清的M199培养液重新悬浮细胞备用。
f．其它大血管如牛主动脉，猪主动脉等，可在无菌下分离，然后用线结扎血管各分支，再依上述步骤分离EC。
2.2.2 酶消化法小血管内皮细胞的分离2.2.2.1 兔主动脉，大鼠主动脉因血管较小，分支极细，不能采用上述方法消化。
a．将动物主动脉取出后放D-Hanks中，将血管外的脂肪细组织分离干净，用丝线结扎血管一端，然后用探针顶住该端，将整条血管翻转，使内膜翻在外面。
将另一端折入腔内0.5cm，并用丝线结扎紧，以防外膜外露及避免酶液进入外膜腔内。
b．用D-Hanks液清洗干净外翻的内膜面，然后血管浸泡在含0.1%胶原酶溶液的小瓶内，盖上瓶盖在37℃水浴中轻轻摇荡消化，使EC离散下来，消化15～20min后，见酶液稍有混浊，即加入等量的含20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。
c．收集消化后的酶溶液以1500r/min离心5min，弃上清，用20%小牛血清M199培养液重新悬浮细胞。
2.2.3 酶消化——机械刮脱法猪主动脉EC的分离a．麻醉状态下，在颈部切口，分离并剪断颈动脉，放血处死。
在无菌条件下，作胸腹联合切口，迅速打开胸腔，分离并取出胸主动脉和腹主动脉，置含D-Hanks液的培养皿中，尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织，然后用D-Hanks 液多次冲洗血管外表及血管管腔内的凝血，再放入新装有D-Hanks的溶液中。
b．纵何剪开血管，反复冲洗干净血管内壁后，在另一无菌大培皿中，滴加薄薄一层0.125%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合消化液，将主动脉内膜面朝下铺在酶混合液之上。
在37℃条件下，让内膜与酶溶液充分接触并消化10～20min，再加入含少量20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。
c．把上述主动脉移至另一无菌培养皿，用小手术刀轻轻将内皮刮下。
先顺向有次序地刮内膜1～2次，然后再横向刮1～2次，用M199液将内皮细胞收集到离心管中，以1000r/min离心7～10min，去上清，用20%小牛血清M199培养液重新悬浮细胞备用。
2.2.4 机械刮脱法血管内皮细胞的分离取长度为20cm的大血管，用D-Hanks液将血管内、外冲洗干净后，无菌条件下沿纵轴剪开，使血管内皮朝上向外暴露，再用D-Hanks液冲洗2次，然后用刮刀轻轻刮取内膜表面的内皮细胞，刮取时，动作应轻柔均匀，刮刀与表面的角度约为60℃，每处只能刮1次，不可刮血管的边缘，刮下的细胞悬浮于M199液中，以1000r/min离心7～10min，去上清，再重复洗涤1次，重新悬浮于20%小牛血清M199培养液中备用。
2.2.5 还有微血管内皮细胞的分离及干贴法分离EC等，但较少用。
2.3 EC原代培养及传代培养2.3.1 原代培养将分离好备用的EC用含100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素以及20%小牛血清的M199培养液（M199完全培养液）调整细胞浓度为1.5～2.0×105/ml，接种到以0.1%纤连蛋白或1%明胶包被已干燥的平皿或培养瓶中。
放37℃、5% CO2和饱和湿度的孵育箱中培养。
24h后弃去培养液，用D-Hanks 液淋洗1次，以去除未贴壁或死亡的细胞，换入等量的M199完全培养液，继续孵育箱中培养。
每2～3d换M199完全培养液1次，换液时将原培养液弃掉1/2～2/3，然后加入新鲜的M199完全培养液至原来的量，6～7d后细胞可融合成单层内皮细胞，即可传代。
2.3.2 传代培养2.3.2.1 待原代培养细胞长至融合状态后，弃培养液，用预温的D-Hanks液淋洗2次，加入终浓度0.125%胰蛋白酶、0.01% EDTA混合消化液，正好形成一浅层液面将细胞复盖，室温下（20～25℃）消化1～2min。
2.3.2.2 镜下见细胞稍收缩变圆，细胞间隙增宽后，立即翻转培养瓶，弃酶液。
可再用D-Hanks液轻洗1次或直接加入新鲜M199完全培养液后，用吸水管（滴管）将细胞轻轻吹打下来，按1∶2或1∶3的比例传代。
2.3.2.3 每隔2～3d换液1次，每次换掉2/3量，待细胞长至融合状态后，再次传代。
2.4 观察结果用酶消化进行的原代培养，从动脉内膜上消化收集下来的内皮细胞，30min 后即开始贴壁，呈扁平短梭形或多角形分散生长；4～6h后大部分细胞已贴壁，并开始生长，分裂，24h后形成数量不等的细胞群，约6～7d融合成片。
传代培养的EC，10min后贴壁，5～7d融合成单层。
2.5 内皮细胞的鉴定2.5.1 光镜检查在倒置相差显微镜下可观察到活细胞呈扁平的短梭形或多角形，大小均匀，胞核清晰，呈卵圆形。
有核的区域较无核的区域突出，细胞呈单层“鹅卵石样”或“铺路石样”镶嵌排列。
2.5.2 透射电镜检查经切片技术处理后可观察到具有特征性的细胞器（webel-palade，W-P小体），但兔及猪的EC无W-P小体。
2.5.3 第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测EC用PBS冲洗干净，放入乙醇和丙酮（1∶1）溶液中固定10min，空气晾干，加入第Ⅷ因子相关抗原抗血清（兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗血清），37℃孵育60min。
用PBS冲洗干净，晾干后加第一动物IgG荧光抗体（羊抗兔IgG荧光抗体），37℃孵育30min。
PBS冲洗干净，晾干，最后用缓冲甘油封片，在荧光显微镜下观察到EC的胞浆内呈显较强的黄绿色荧光，是鉴定体外培养EC最可靠的标志。
因第Ⅷ因子只存在于内皮细胞、巨核细胞和血小板中，其它细胞无第Ⅷ因子，但培养的猪主动脉内皮细胞也无此因子。
2.6 注意事项2.6.1 接种材料的制备血管取材的离体时间不宜过长，一般不超过6h，万一不能当时培养，则应放置4℃下保存（但不应超过24h），血管内、外表面的血迹必须充分洗净，以免残留的RBC及血液中某些因子影响EC的贴壁或生长。
2.6.2 酶消化液浓度的选择0.1%（Ⅰ型）胶原酶溶液，0.25%胰蛋白酶溶液，0.25%胰蛋白酶0.02% EDTA混合消化液，0.125%胰蛋白酶0.01% EDTA混合消化液（常用于传代），根据实验情况选定。
掌握好酶液的消化时间是内皮细胞存活的关键（原代培养）。
2.6.3 杂细胞的排除细胞传代时，加入酶消化液之后，置显微镜下观察，1～2min即可见大部分EC收缩变圆，而杂细胞（主要是成纤维细胞）仍然贴壁。
此时，立即加入M199完全培养液以终止酶的活性，然后弃去其液体，加新鲜M199完全培养液，轻轻将细胞吹打下来，传到另一培养瓶，如此经过2～3次，可得到较纯的EC。
其次有人使用含肝素的完全培养液（在液体中加入90U/ml的肝素）可使EC纯度提高。
2.6.4 EC的培养条件EC培养条件要求比较严格，培养液的pH温度，抗生素的种类和含量，血清质量和活性，ECGF的质量和含量，EC分离时所受到的创伤，孵育箱的培养条件，都对EC的生长有重要影响。
2.6.4.1 小牛或胎牛血清的质量对EC的生长影响很大，胎牛血清较小牛血清更好。
一般原代培养用20%，传代培养用10%血清，常用培养基为M199，pH 7.2为宜。
2.6.4.2 塑料培养瓶或皿较玻璃或皿更利于EC生长，培养瓶或皿铺上纤连蛋白，明胶或胶原，以利EC的贴壁生长，但应首选纤连蛋白，因它对蛋白和DNA 的测定无显著影响。
2.6.4.3 EC的传代培养一般EC的传代比例是1∶2或1∶3。
如需要单次传代，扩大体外培养规模时，可以1∶20以上的比例进行传代，这样可在短期内获得大量的EC，进行冻存或实验工作，但单次传代，扩大体外培养规模，须在培养液中加入内皮细胞生长因子（endothelial cell growth factor，ECGF），只是该因子价格较昂贵。
EC经多次传代后其形态和生物学特性会有所改变，并且其生长期有限，不断衰退，故不宜作长期传代培养，一般生长期在20～30d左右，如实验需要可重复从原代建立培养。
体外培养EC用于评价抗动脉粥样硬化的药效学实验现介绍几种常用的实验方法1．保护血管内皮细胞（endothelial cells，EC）药的实验损伤学说认为，机械、化学、免疫、感染等引起EC损伤是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的起始因素，反复的EC损伤引起单核巨噬细胞、血小板粘附，可致AS斑块形成。