第五章 细胞融合
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细胞融合
聚乙二醇 诱导
是化学试剂， 是化学试剂，使 用起来很方便， 用起来很方便， 诱导细胞融合的 频率比较高
电诱导
优 点 缺 点
有一定毒性， 有一定毒性， 对有些细胞 (如卵细胞)不 如卵细胞) 适用
影响因素较多， 影响因素较多， 例如培养液的 选择，温度、 选择，温度、 渗透压等都是 影响电融合的 因素。 因素。
请思考： 请思考：
植物体细胞杂交技术
1、过程
植物细胞A 植物细胞
去壁
植物细胞的融合
方法？ 方法？
融合 完成 的 标志
植物组织培养
原生质体A 原生质体A 原生质体B 原生质体
去壁
人 工 诱 导
融合的 原生质 体AB
杂种 细胞 脱 再 AB 分
生 出 细 胞 壁 化
愈 伤 组 织
再 分 化
杂 种 植 株
一、 动物 细胞 融合 过程
1.动物细胞融合的过程 动物细胞融合的过程
细胞A 细胞
物理法
细胞B 细胞
灭活的病毒 化学法
杂交细胞
2.动物细胞融合的诱导手段 2.动物细胞融合的诱导手段
①化学法： 聚乙二醇（PEG)等试剂 ②灭活 灭活病毒 灭活
• 仙台病毒 • 疱疹病毒 • 新城鸡瘟病毒
③物理法： 离心、 融合技术、振动、显微操作等 离心、电融合技术、振动、显微操作等
练习
C
思考下列问题： 思考下列问题：
• 1、什么叫动物细胞融合？植物体杂交技术与动物细胞 、什么叫动物细胞融合？ 融合有什么不同呢？ 融合有什么不同呢？ • 2、动物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合 、动物细胞在结构上有何区别？ 过程有什么影响？ 过程有什么影响？ • 3、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否 、 相同？两者的融合过程是否也一样？ 相同？两者的融合过程是否也一样？
实验五：细胞融合与凝集
➢ 对照:用1滴磷酸缓冲液和1滴2%兔血细胞液混合作为对照观察。
细胞生物学实验
实验结果
土豆凝集素对兔血红细胞的凝集作用
PBS对照
PEG诱导, 鸡血细胞融合情况
实验报告
细胞生物学实验
绘图或照片表示观察到的细胞融合现象,哪些因素 会影响其融合?（进行多个视野的测定，统计平均 融合率.若进行多个时间的融合实验，请比较融合 时间对融合率的影响，分析可能的原因）
➢ 细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个具有双核 或多核细胞的过程。在自然情况下，体内和体外培养的细胞 均能发生自发融合现象;
➢ 细胞融合可在自然条件下或利用人工条件 (生物的、物理的、 化学的)下进行;
➢ 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处 质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子 层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发 生融合,形成双核或多核细胞 ;
细胞生物学实验
实验五
细胞融合（聚乙二醇法） 凝集素对细胞的凝集反应
实验目的
细胞生物学实验
通过细胞融合的观察
了解细胞融合的原理 掌握用PEG诱导细胞融合的方法
通过细胞的凝集反应的观察
➢ 了解细胞膜的表面结构 ➢ 了解细胞发生凝集反应的原因 ➢ 学习研究细胞凝集反应的方法
实验原理
细胞生物学实验
细胞融合
染色镜检
➢ 取1滴PEG诱导后血细胞悬液滴于载玻片上,再加入0.2% Janus Green B染液1滴，混匀，盖上盖玻片，染色5-15min 后,显微镜下观察观察细胞融合状况;
➢ 注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞
计算融合率(%) 融合率 = 融合细胞数/总细胞数 ×100%
细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与 该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百 分比表示, 而且要进行多个视野测定，进行统计分析。
细胞生物学实验
实验结果
土豆凝集素对兔血红细胞的凝集作用
PBS对照
PEG诱导, 鸡血细胞融合情况
实验报告
细胞生物学实验
绘图或照片表示观察到的细胞融合现象,哪些因素 会影响其融合?（进行多个视野的测定，统计平均 融合率.若进行多个时间的融合实验，请比较融合 时间对融合率的影响，分析可能的原因）
➢ 细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个具有双核 或多核细胞的过程。在自然情况下，体内和体外培养的细胞 均能发生自发融合现象;
➢ 细胞融合可在自然条件下或利用人工条件 (生物的、物理的、 化学的)下进行;
➢ 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处 质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子 层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发 生融合,形成双核或多核细胞 ;
细胞生物学实验
实验五
细胞融合（聚乙二醇法） 凝集素对细胞的凝集反应
实验目的
细胞生物学实验
通过细胞融合的观察
了解细胞融合的原理 掌握用PEG诱导细胞融合的方法
通过细胞的凝集反应的观察
➢ 了解细胞膜的表面结构 ➢ 了解细胞发生凝集反应的原因 ➢ 学习研究细胞凝集反应的方法
实验原理
细胞生物学实验
细胞融合
染色镜检
➢ 取1滴PEG诱导后血细胞悬液滴于载玻片上,再加入0.2% Janus Green B染液1滴，混匀，盖上盖玻片，染色5-15min 后,显微镜下观察观察细胞融合状况;
➢ 注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞
计算融合率(%) 融合率 = 融合细胞数/总细胞数 ×100%
细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与 该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百 分比表示, 而且要进行多个视野测定，进行统计分析。
细胞融合名词解释
细胞融合名词解释细胞融合是指两个或多个细胞合并成一个细胞的过程。
细胞融合在生物体内发生的频率很高，尤其在有性生殖中起着重要的作用，例如精子和卵子的融合形成受精卵。
此外，在一些特殊的情况下，细胞融合也可以通过实验室操作实现，例如体细胞核移植和细胞融合实验等。
细胞融合可以分为自然细胞融合和人工细胞融合。
自然细胞融合指的是在自然条件下发生的细胞融合，如有性生殖中的卵子和精子的融合。
人工细胞融合则是通过实验室技术将两个或多个细胞进行人工合并，以产生新的细胞。
人工细胞融合在生物学研究和实践中具有重要的应用价值。
细胞融合可以发生在同一物种的细胞之间，也可以发生在不同物种的细胞之间。
同一物种的细胞融合称为同体细胞融合，其目的是产生具有更强表现型的细胞。
例如，肌肉细胞融合可以形成更大、更有力的肌肉细胞。
不同物种的细胞融合称为异体细胞融合，可以用于研究种间基因转移、细胞功能研究和生物制药等领域。
细胞融合可分为全细胞融合和细胞质融合。
全细胞融合是指两个细胞的质量和形态全部或部分融合，形成一个新的细胞。
细胞质融合是指两个细胞的质量融合，但形态并未完全融合。
细胞质融合更常见于真菌和植物等生物中，可以通过质体或核糖体的融合实现。
细胞融合有许多重要的应用。
在疾病治疗上，细胞融合可以用于修复受损组织和器官，例如骨髓移植中的造血干细胞融合。
在肿瘤治疗上，细胞融合可以用于产生抗肿瘤细胞，增强免疫力，提高抗肿瘤效果。
在基因工程上，细胞融合可以用于基因转移和基因功能研究，例如将外源基因导入宿主细胞中，以研究基因在细胞中的功能。
此外，细胞融合还可以用于生物制药的生产，例如利用细胞融合技术产生单克隆抗体。
总的来说，细胞融合是一种重要的生物学现象和实验技术，对于理解细胞生理学、发育生物学、遗传学等学科起着重要的作用，同时也具有广泛的应用前景。
第5章 细胞融合-2012
1975年，英国Milstein和Kohler 在细胞融合技术的基 础上创立了单克隆抗体技术。
5.3 细胞融合的建立和发展
植物方面： 1937年，Michel用硝酸钠处理原生质体使之融合，但那时还 未用酶法大量分离原生质体，因此，植物细胞融合的起步比动 物细胞融合要迟10年左右。 1960年，Cocking 成功地用酶法制备了大量的原生质体，大 大促进了植物原生质体的融合研究。 1972年，Carlson等首次将粉兰烟草和郎氏烟草两个异种的体 细胞融合成功。 1974年，高国楠发现聚乙二醇能促进植物原生质体融合。 20世纪80年代发展了电诱导原生质体融合技术。
PEG溶液加入，并孵育一段时间（24℃或37℃， 10 － 20 分钟）；缓缓加入高钙高 pH 溶液 15 分钟； 洗涤，收集细胞计算融合率。 • 融合促进剂 : 伴刀豆球蛋白 A ，二甲基亚砜
和链胃蛋白酶等，提高细胞的融合频率。
PEG诱导融合原理
• PEG含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物 等一些正极化基团形成氢键。当PEG分子足够长时，可作 为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。
常用的杂种细胞筛选方法
• 遗传互补筛选法
利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另外一亲本的
缺陷，从而令杂种细胞表现正常功能的原理选择杂种细胞。
• 抗性互补筛选法
利用亲本原生质体对抗生素、除草剂及其他毒性物质抗性差异
来选择杂种细胞。
• 生长特性筛选法
利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。
程序：
紫外线将病毒灭活， 稀释到一定浓度，加入 到细胞悬液中，离心，
诱导细胞融合。
化学法
1. 离子诱导融合法：
•
常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、 钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚 （1970年，Power用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体进行
5.3 细胞融合的建立和发展
植物方面： 1937年，Michel用硝酸钠处理原生质体使之融合，但那时还 未用酶法大量分离原生质体，因此，植物细胞融合的起步比动 物细胞融合要迟10年左右。 1960年，Cocking 成功地用酶法制备了大量的原生质体，大 大促进了植物原生质体的融合研究。 1972年，Carlson等首次将粉兰烟草和郎氏烟草两个异种的体 细胞融合成功。 1974年，高国楠发现聚乙二醇能促进植物原生质体融合。 20世纪80年代发展了电诱导原生质体融合技术。
PEG溶液加入，并孵育一段时间（24℃或37℃， 10 － 20 分钟）；缓缓加入高钙高 pH 溶液 15 分钟； 洗涤，收集细胞计算融合率。 • 融合促进剂 : 伴刀豆球蛋白 A ，二甲基亚砜
和链胃蛋白酶等，提高细胞的融合频率。
PEG诱导融合原理
• PEG含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物 等一些正极化基团形成氢键。当PEG分子足够长时，可作 为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。
常用的杂种细胞筛选方法
• 遗传互补筛选法
利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另外一亲本的
缺陷，从而令杂种细胞表现正常功能的原理选择杂种细胞。
• 抗性互补筛选法
利用亲本原生质体对抗生素、除草剂及其他毒性物质抗性差异
来选择杂种细胞。
• 生长特性筛选法
利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。
程序：
紫外线将病毒灭活， 稀释到一定浓度，加入 到细胞悬液中，离心，
诱导细胞融合。
化学法
1. 离子诱导融合法：
•
常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、 钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚 （1970年，Power用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体进行
植物细胞工程课件第五章细胞融合
单细胞的制备
• 用胰蛋白酶、机械法或二者兼用来分离细 胞，对其进行单层或悬浮培养，获得单个分 散的细胞。
5.3 细胞融合的方法
•自发融合 NaNO3 高pH-高Ca离子
仙台病毒
•诱发融合
PEG
电场
……
5.3.1 生物融合法-----仙台病毒法
• 病毒类是研究得最早的促融剂 • 疱疹病毒、天花病毒、副流感型 病毒、副黏液病毒等致癌、致病 病毒，都能诱导细胞融合
不对称杂种：亲本双方原生质体发生部分融
合，或发生了融合，但融合体在分裂过程中一
方的部分核或质被排斥，因而其体细胞染色体
数目达不到双亲之和。其外部形态呈双亲的中
间型或偏一方形态，一般表现为雄性器官退化，
正常花粉粒极少，育性低。
胞质杂种：携带一个亲本的核和两个亲本的
细胞质。
细胞融合的意义
• 实现远缘遗传重组 植 物
P1
融合液
P2
混合静止1min. P1 P2 加入PEG
选 择
融 合 加入稀释液
稀 释 加入培养基
培 养
洗 涤
洋葱根尖原生质体 （40×）
烟草叶肉原生质体 （40×）
烟草叶肉细胞和洋葱根 尖细胞原生质体融合
烟草叶肉和洋葱根尖细 胞原生质体的异源融合
原生质体的 诱导频率；同时 群体密度 与pH 值相关。
德国生理学家 Johannes Müller 1801-1858
• 毒性大，应用受到限制
• 1958 年 ， 日 本 学 者 冈 田 善 雄 （Okada）发现了HVJ病毒可促
进细胞融合。
• 仙台病毒（HVJ）毒力低，对人
的危害小
日本学者Okada
• 易被紫外线或 β －丙炔内酯所灭 活
• 用胰蛋白酶、机械法或二者兼用来分离细 胞，对其进行单层或悬浮培养，获得单个分 散的细胞。
5.3 细胞融合的方法
•自发融合 NaNO3 高pH-高Ca离子
仙台病毒
•诱发融合
PEG
电场
……
5.3.1 生物融合法-----仙台病毒法
• 病毒类是研究得最早的促融剂 • 疱疹病毒、天花病毒、副流感型 病毒、副黏液病毒等致癌、致病 病毒，都能诱导细胞融合
不对称杂种：亲本双方原生质体发生部分融
合，或发生了融合，但融合体在分裂过程中一
方的部分核或质被排斥，因而其体细胞染色体
数目达不到双亲之和。其外部形态呈双亲的中
间型或偏一方形态，一般表现为雄性器官退化，
正常花粉粒极少，育性低。
胞质杂种：携带一个亲本的核和两个亲本的
细胞质。
细胞融合的意义
• 实现远缘遗传重组 植 物
P1
融合液
P2
混合静止1min. P1 P2 加入PEG
选 择
融 合 加入稀释液
稀 释 加入培养基
培 养
洗 涤
洋葱根尖原生质体 （40×）
烟草叶肉原生质体 （40×）
烟草叶肉细胞和洋葱根 尖细胞原生质体融合
烟草叶肉和洋葱根尖细 胞原生质体的异源融合
原生质体的 诱导频率；同时 群体密度 与pH 值相关。
德国生理学家 Johannes Müller 1801-1858
• 毒性大，应用受到限制
• 1958 年 ， 日 本 学 者 冈 田 善 雄 （Okada）发现了HVJ病毒可促
进细胞融合。
• 仙台病毒（HVJ）毒力低，对人
的危害小
日本学者Okada
• 易被紫外线或 β －丙炔内酯所灭 活
第五章-细胞融合与体细胞杂交
体细胞杂交是解决远源杂交不亲和性的有力
手段之一,更好地利用自然界基因资源，培育新 物种。
2021/3/24
6
问题:有没有可能培育出地下 结土豆,地上结番茄的超级植 物? 1978年德国科学家梅歇尔斯 将番茄与马铃薯进行体细胞 杂交育成薯番茄“泡马豆” （po(tato)-(to)mato）。马铃 薯与番茄两种原生质体的融 合率竟高达40％～50％。
➢1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水
瘤细胞融合成多核细胞的现象。
➢ 20世纪70年代初,华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促
使植物原生质体融合,开拓了植物细胞融合的研究。
➢20世纪80年代,齐默曼（Zimmerman）等建立电场
202诱1/3导/24细胞融合方法。
11
四 细胞融合原理
1、细胞膜的结构与功能
细胞膜磷脂分子 扰动出现通道 ——细胞桥
2021/3/24
12
2.主要环节
（1）亲本选择（单细胞或原生质体制备） （2）两原生质体或细胞互相靠近,粘附 （3）质膜融合形成细胞桥 （4）胞质渗透 （5）细胞核融合 （6）融合细胞筛选
2021/3/24
13
原生质体及其制备
1972年,卡尔森（Carlson）利用NaNO3诱导融合了粉兰烟草和郎氏 烟草原生质体,培育出世界第一株体细胞杂种植物。
NaNO3的钠离子可以中和原生质体表面负电荷，引起原生质体聚 集，促进细胞融合。NaNO3对原生质体无损害，但融合效率低， 一般小于4%。
2021/3/24
22
（2）高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合
植物细胞的细胞壁主要成分是纤维 素（纤维素微纤丝Cellulose microfibrils ）、果胶（pectin）、多 糖glycan）。 果胶酶、纤维素酶等处理植物组织, 可以破坏胞间层和去掉细胞的纤维 素外壁,得到游离的裸露原生质体。
手段之一,更好地利用自然界基因资源，培育新 物种。
2021/3/24
6
问题:有没有可能培育出地下 结土豆,地上结番茄的超级植 物? 1978年德国科学家梅歇尔斯 将番茄与马铃薯进行体细胞 杂交育成薯番茄“泡马豆” （po(tato)-(to)mato）。马铃 薯与番茄两种原生质体的融 合率竟高达40％～50％。
➢1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水
瘤细胞融合成多核细胞的现象。
➢ 20世纪70年代初,华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促
使植物原生质体融合,开拓了植物细胞融合的研究。
➢20世纪80年代,齐默曼（Zimmerman）等建立电场
202诱1/3导/24细胞融合方法。
11
四 细胞融合原理
1、细胞膜的结构与功能
细胞膜磷脂分子 扰动出现通道 ——细胞桥
2021/3/24
12
2.主要环节
（1）亲本选择（单细胞或原生质体制备） （2）两原生质体或细胞互相靠近,粘附 （3）质膜融合形成细胞桥 （4）胞质渗透 （5）细胞核融合 （6）融合细胞筛选
2021/3/24
13
原生质体及其制备
1972年,卡尔森（Carlson）利用NaNO3诱导融合了粉兰烟草和郎氏 烟草原生质体,培育出世界第一株体细胞杂种植物。
NaNO3的钠离子可以中和原生质体表面负电荷，引起原生质体聚 集，促进细胞融合。NaNO3对原生质体无损害，但融合效率低， 一般小于4%。
2021/3/24
22
（2）高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合
植物细胞的细胞壁主要成分是纤维 素（纤维素微纤丝Cellulose microfibrils ）、果胶（pectin）、多 糖glycan）。 果胶酶、纤维素酶等处理植物组织, 可以破坏胞间层和去掉细胞的纤维 素外壁,得到游离的裸露原生质体。
细胞融合
自发条件下或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融 合导致异核体(heterokaryon）的形成，异核体通过细胞有丝分裂导致核的融合，形成单核的杂种细胞。有性生 殖时发生正常的细胞融合，即由两个配子融合成一个合子。
实验操作
实验操作
（以人鼠细胞杂交为例）
定义
定义
有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的二倍体。而细胞融合为在自 然条件下或用人工方法（生物的、物理的、化学的）使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。其中人 工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间 细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。基因型相同的细胞融合成 的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。
研究进展
研究进展
Muller于1838年观察到脊椎动物肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 Cienkawski(1876）、Buck(1877）、Geddes(1880）在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交 瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。
实验操作
实验操作
（以人鼠细胞杂交为例）
定义
定义
有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的二倍体。而细胞融合为在自 然条件下或用人工方法（生物的、物理的、化学的）使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。其中人 工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间 细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。基因型相同的细胞融合成 的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。
研究进展
研究进展
Muller于1838年观察到脊椎动物肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 Cienkawski(1876）、Buck(1877）、Geddes(1880）在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交 瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。
细胞融合的方法过程和影响因素
Glycolipids Sterols ( is only found in animals)
An Overview of membrane functions
1. Define the boundaries of the cell and its organelles.
1 PEG融合的关键是作用时间 provide mechanisms for cell-to-cell contact, communication and adhesion
动物细胞融合的筛选方式：
1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对 药物敏感性差异筛选杂种细胞。
亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不 敏感
亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不 敏感
杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基 上生长
2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几 种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷 型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原 理可以筛选杂种细胞。
优点：
融合率高，达70％－80％，甚至100％ 融合率＝（融合组多核细胞的核数－对 照组多核细胞的核数/对照组的全部细 胞数）×100％ 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞
第二节 融合细胞的筛选
原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细 胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。
DNA合成途径有两种:
主要途径由氨基酸和其他小分子化 合物合成核苷酸，进而合成DNA， 叶酸是必不可少的媒介，参与嘌呤 和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制 FH2活性，阻断FH2到FH4合成。
需两种酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶: （催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸） 次黄嘌呤磷酸核苷转移酶HGPRT酶: （催化次黄嘌呤产生肌苷）
亲本A：色氨酸缺陷型
An Overview of membrane functions
1. Define the boundaries of the cell and its organelles.
1 PEG融合的关键是作用时间 provide mechanisms for cell-to-cell contact, communication and adhesion
动物细胞融合的筛选方式：
1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对 药物敏感性差异筛选杂种细胞。
亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不 敏感
亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不 敏感
杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基 上生长
2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几 种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷 型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原 理可以筛选杂种细胞。
优点：
融合率高，达70％－80％，甚至100％ 融合率＝（融合组多核细胞的核数－对 照组多核细胞的核数/对照组的全部细 胞数）×100％ 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞
第二节 融合细胞的筛选
原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细 胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。
DNA合成途径有两种:
主要途径由氨基酸和其他小分子化 合物合成核苷酸，进而合成DNA， 叶酸是必不可少的媒介，参与嘌呤 和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制 FH2活性，阻断FH2到FH4合成。
需两种酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶: （催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸） 次黄嘌呤磷酸核苷转移酶HGPRT酶: （催化次黄嘌呤产生肌苷）
亲本A：色氨酸缺陷型
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具体应用时要根据不同对象选择不同 的细胞融合方法和条件。 诱导动物细胞融合 仙台病毒HVJ诱导、 PEG法、电融合法都适用
植物细胞融合 微生物细胞融合 常用PEG法和电融合法； 只适用PEG法
5．5．1 生物法—— 仙台病毒法
我们知道很多病毒都具有凝集细胞的能力。 它一边黏接在一个细胞表面，另外一边黏接 在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒 的作用下靠近发生凝结。 仙台病毒也称日本血凝病毒HVJ,属黏液 病毒副流感类群，是RNA病毒，多型颗粒状， 易在小鼠中蔓延。
近年来，科学家利用以细胞融合为核心技 •
术的操作取得了很大的科研成果，杂交育种
已成为培育动物新品种的一个有效手段。
如已培育出绵山羊：具有绵羊的卷曲浓密的
长毛、山羊式的羊角，毛肉兼用。
单克隆抗体生产
抗原决定簇：存在于抗原分子表面，决定 该抗原特异性的特殊化学基团。
Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗 原决定簇的混合抗体 Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞克 隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体
进行体细胞融合就可以避开生殖细胞的受 精过程。避免上述种种麻烦，从而在亲缘更远 的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没 有的新物种。
例如，马铃薯和番茄通过细胞融合得 到了至今有性杂交未能获得的属间杂种 薯番茄和番茄薯。
许多研究人员成功地进行了不同 植物的细胞融合，并培养出了再生植 株后，许多人开始尝试培育不同种属 的超级杂交植物。１９７８年，德国 的梅罗帕斯博士用细胞融合的方法培 育出了马铃薯（土豆）和番茄的杂交 后代———薯番茄。他们先用酶液除 去马铃薯、番茄的细胞壁，然后将两 种去壁细胞（原生质体）等量混合， 在混合液中加进聚乙二醇溶液，使原 生质体紧密粘聚，再用高钙和高ｐＨ 溶液处理，结果，马铃薯与番茄两种 原生质体的融合率竟高达４０％～５ ０％。其中所育成的“番茄薯”新品 种地上部分能结番茄，地下部分能结 马铃薯
5．4．2 动物单个细胞的获得 （一）组织的获得 (二)组织的消化
5．5
细胞融合技术
细 胞 融 合 技 术
生物法
化学法
物理法 细胞融合的影响因素
物理法
主要包括显微操作、电场刺激等；
化学法 主要是用聚乙二醇PEG结合高PH、 高钙离子法； 生物法 有仙台病毒法等。
1、PEG诱导融合的关键是作用时间，尤其是高Ca2+和PH
溶液处理时间长短非常重要。
时间过长，原生质体损伤严重，融合效率低 过短则不融合。 2、 PEG规格和纯度与融合效率也有关系。
3、在电场诱导融合时，融合率与原生质体密度有关，
密度小于104个/ml融合效率较低，大于106个/ml，会融 合成团。
融合过程
细胞融合主要经过了以下4步：
两原生质体或细胞互相靠近
细胞桥形成
胞质渗透
细胞核融合 其中细胞桥的形成是细胞融合最关键的一 步
5．4
融合材料
5． 4．1
植物或微生物原生质体的制备
植物和许多微生的融合就必须先得到单个 细胞，除去细胞壁，才能获得植物原生质体或微 生物原生质球 。因此时于植物和微生物细胞的融 合一般又可称为原生质体融合。
5． 7
细胞融合技术的应用举例
植物原生质体融合的研究已有90 多年的历史。 但现代植物细胞融合技术研究是从20世纪60年代才开 始的，20世纪70年代，一些科学家探讨了植物细胞杂 交的内容、方法和意义，并提出具有吸引力的以番茄 和马铃薯为细胞杂交亲本的细胞杂交模型，推动了原 生质体融合技术研究的广泛开展。此后、逐步形成了 通过细胞杂交进行作物改良的新观念 。
病毒颗粒 细胞核
细胞核
5．5
细胞融合技术
细 胞 融 合 技 术
生物法
化学法
物理法 细胞融合的影响因素
PEG结合高Ca2+、PH诱导法
细胞融合中的化学法诱导主要包括： NaNO3诱导 NaNO3能中和原生质体表面负电荷，促进 原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合效率低。
单克隆抗体生产
单克隆抗体的特点 1）单克隆抗体是针对单一抗原决定簇的化学结 构完全相同的单一抗体，其特异性强，与其对应抗 原的亲和力高度均一； 2）杂种瘤细胞株可冷冻于液氮中长期保存，所 以单克隆抗体可以重复、稳定地制备，不会因批号 不同而产生差异； 3）产生单克隆抗体的杂交瘤株可在体外扩大培 养。
胞电融合和电穿孔仪，独 特的交流非正弦波 使细 胞双向电泳排列到一起， 然后在微秒级时间内转换
成直流方波使细胞融合，
融合后的交流脉冲稳定杂
合细胞的融合状态，大大
提高了细胞融合的效率。 电融合仪
二、 基本过程 细胞膜的接触：
当原生质体臵于电导率很低的溶液中时，电场 通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其 结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子， 从而使原生质体紧密接触排列成串
二、影响动物细胞融合的因素
在动物细胞的融合过程中，除促融剂外，细胞性 质、温度、PH、离子强度、离子种类均可影响细胞融 合率。 1、亲本细胞表面性质影响较大，表面覆盖绒毛而 不规则者容易融合，而表面光滑者较难融合。 2、细胞种类不同，融合效果也不同，如：腹水癌 较易融合，而淋巴细胞、血细胞几乎不融合。
高Ca2+和pH诱导法 PEG诱导 PEG结合高Ca2+和PH诱导法 上面几种方法中以PEG结合高Ca2+和PH诱导法最为常 用，下面做重点介绍：
：
5．5． 2．1
基本原理
聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，商品
名卡波蜡，实验室用的PEG ，平均相对分子质
量在200-2000之间，一般1000以下者为液体，
存在问题
（1）通过融合将双亲的染色体组相加，往往 会造成遗传上的不稳定，杂种细胞也不易分化 成株。
(2)从野生种带进过多的不良基因
5．3 基本原理及步骤
1、对于植物细胞而言，一般先得到原生质体 2、通过物理或化学方法诱导细胞融合形成杂种细胞 3、进行杂种细胞的分检和培养
4、促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直至形成 杂种植株，从而实现基因在远缘物种间的转移
由于被感染细胞表面发生某些改变，使 得这些细胞容易发生融合，甚至处死的HVJ 病毒也具有促进细胞融合的作用。 日本学者冈田利用仙台病毒使两种不同 的动物细胞之间发生凝集，进而融合成一体。
研究发现：促进细胞融合的有效部位在于 病毒的膜，被超声波打碎的病毒膜片仍具有 促进细胞融合的功能。
仙台病毒促使细胞融合的因素与病毒被膜 上的磷脂成分有关，而与病毒内核酸的活性 无关。 仙台病毒被膜糖蛋白与其促融合的能力有 关。在动物细胞融合中，仙台病毒(HVJ)已成 为产生细胞杂种的标准融合剂。
膜的击穿：
原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲 就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的 细胞融合在一起
5．5
细胞融合技术
细 胞 融 合 技 术
生物法
化学法
物理法 细胞融合的影响因素
细胞融合的影响因素
一、
影响植物细胞融合的因素
植物原生质体融合无种属特异性，与其自身种属无关， 故其融合效率仅与外界条件有关。
异源融合体往往因它们发育缓慢而受到优势生长 的亲本原生质体融合细胞的抑制，不易发育成杂种。 因此需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离 出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。
5.6
融合细胞的选择
对于如何筛选杂种细胞，尚无特定规律 可循，需对不同对象设计具体的筛选方案 和选择体系，优先选择杂种细胞，或只允 许杂种细胞生长，以淘汰亲本细胞。
(2)抗体互补筛选法；利用亲本原生质体 对抗生素、除草剂及其他毒性物质抗性差异来 选择杂种细胞。抗性突变体或抗药性有差异的 可采用这种方法。
(3)生长特性筛选法：利用原生质体 对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。 例如：亲本原生质体生长要求外源激素，而有 的杂种细胞由于双亲互补作用会产生内激素， 从而使杂种细胞能在无激素的培养基上生长。
黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，至 到闭和成完整的膜形成融合体。
与PEG法比较，电融合法三大优点： 1、融合率高、重复性强、对原生质体伤害小；
2、装臵精巧、方便简单、可在显微镜下观察或 录像融合过程；
3、免去PEG 诱导后的洗涤过程、诱导过程可控 制性强等等。
电融合仪
本产品是一台多功能的细
由于这个新细胞得到了来自两个细胞的染色体组和 细胞质，在适宜的条件下来培养，长成的生物个体就是 一个新的物种或品系。
5．3 基本原理
新 生 物
细胞可以发生融合的生物范围是很广的。到 目前为止、已经在种间、属间、科间以及动植 物两界之间都做过细胞融合的尝试，但只有体 细胞的无性杂交才是真正意义上的细胞融合技 术。
第五章
细胞融合
5．1 细胞融合的定义
又称体细胞杂交(Somatic hybridization) 是指将不同来源的原生质体（细胞）相融合并 使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。
5．2
细胞融合的意义
人们很早就发现在生物界中有自发的细胞融合现象。 我们知道，无论是远缘杂交还是利用多倍体技术都要 先实现有性杂交，而亲缘关系较远的物种间杂交往往 表现为杂交不亲合或不能受精或是胚胎早期败育。 克服远缘杂交中的不亲和障碍； 优良性状改良 组合起各种植物的优良遗传性状，从而培育出理想的 新品种。