组蛋白的WESTERN注意事项
Western blot 实验步骤及其注意事项
Western blot 实验步骤及其注意事项注意事项：western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。
这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。
实验中取胶和膜需带手套。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP 细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE 的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
Western_blot的原理、操作及注意事项
Western_blot的原理、操作及注意事项Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移⾄固相⽀持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进⾏检测，蛋⽩质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的⾼分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低⾄1～5ng（最低可到10－100pg）中等⼤⼩的靶蛋⽩。
⼀、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理⽅法：组织洗涤后加⼊3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加⼊5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离⼼，取上清。
加⼊β-ME(9.5ml加⼊0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加⼊0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，⽤时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理⽅法：离⼼收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加⼊5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离⼼，取上清。
加⼊β-ME(9.5ml加⼊0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加⼊0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，⽤时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋⽩的提取（特例）：直接收集分泌液，加⼊β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋⽩的定量⽅法及影响蛋⽩定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第⼀个⽤⽐⾊法测定蛋⽩质浓度的⽅法。
在需要快速，但不很准确的测定中，常⽤此法。
硫铵不⼲扰显⾊，这对蛋⽩质提纯的早期阶段是⾮常有利的。
双缩脲法的原理是Cu2+与蛋⽩质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝⾊络合物，此物在540nm波长处有最⼤吸收。
双缩脲法常⽤于0.5g/L～10g/L含量的蛋⽩质溶液测定。
⼲扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。
可⽤沉淀法除去⼲扰物，即⽤等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋⽩质，然后弃去上清液，再⽤已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋⽩质进⾏定量测定。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
Western blot检测蛋白质的表达实验的结论通常包括以下几个方面：
1. 蛋白质的表达水平：通过比较目标蛋白质与内参蛋白质的信号强度，可以得出目标蛋白质在样本中的表达水平。
2. 蛋白质的分子量：通过比较标准蛋白的分子量和目标蛋白质的分子量，可以确定目标蛋白质的分子量。
3. 蛋白质的特异性：通过比较阳性对照和阴性对照的信号强度，可以确定目标蛋白质的特异性。
在Western blot检测蛋白质的表达实验中，需要注意以下事项：
1. 样本制备：确保样本的质量和数量，避免样本降解或污染。
2. 抗体选择：选择特异性好、灵敏度高的抗体，避免出现非特异性反应。
3. 实验条件：保持实验条件的稳定和一致性，避免影响实验结果的可重复性。
4. 数据分析：对实验数据进行准确的分析和解释，避免误导实验结果。
总之，Western blot检测蛋白质的表达实验是一种常用的生物化学技术，可以用于研究蛋白质的表达、功能和相互作用等方面。
在实
验中需要注意细节和规范操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
Western Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧
常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可 自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长，封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择 抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制：TBS粉末，溶于2L蒸馏水中，再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小（30~50 mg ）组织，加入预冷的RIPA裂解液，按照质量 体积比1：10 比例加入RIPA 裂解液（PMSF和PIC 1:100 v/v ）。然后予以组织匀 浆机处理，全程在冰上操作。匀浆结束后，将所有样本静置于冰上30 min，
上述裂解液离心，4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清（即蛋白原液），避 免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量，剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分 混匀（5 loading buffer和蛋白组织液比1:4），在98 ℃条件下加热10 min，然后进 行分装后保存于-20 ℃冰箱中。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。
同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。
同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。
Western Blot(WB)操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查
Western Blot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查第一部分 WB操作中需要注意事项一、蛋白样品的准备1、样品质量所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。
这会直接影响到样品浓缩的效果。
此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。
2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB一般5×106就足够3、小分子量蛋白10KD需要的注意点1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可4、大分子量蛋白200KD需要的注意点1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高二、制胶1、凝胶质量不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。
因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。
2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下三、加样1、点样样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。
因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。
蛋白Western_blot技术
蛋白Western blot技术1.transfer：先用甲醇浸PVDF膜1min（可用铅笔在一角标记，分别正反面），沥干放入transfer buffer（应该要重新配置了，上次配置的液体使用太久），海绵、滤纸也放入transfer buffer浸湿；按以下顺序从下往上放置：黑色塑料板、海绵、滤纸、胶、PVDF膜, 滤纸、海绵、白色塑料板，可用垫片（我个人觉得玻璃棒或者移液管比较好用）刮尽胶与滤纸之间的气泡（一定要刮干净气泡，不然会导致蛋白不能在有气泡处转移），最后可用橡皮筋加固（顺序不能颠倒，橡皮筋固定可以省略）；2.放入仪器时，相同颜色的在同一侧（黑色对黑色，白色对红的）；设置运行参数：200mA，3hr或100 mA过夜；3.Blocking：PBS + 4-10%脱脂奶粉，室温，2hr或4︒C过夜（我们一般是从早上8：00－9：00将摇床与膜置于4︒C冰柜中blocking到下午4：30左右）；4.倒掉封闭液（应将膜的一角用镊子夹起，倒掉奶粉，并用自来水洗涤干净盒子，最好用PBST缓冲液润洗一次，注意膜的正反面千万不能弄错，否则蛋白会从膜上磨下来），PBS--0.05%Tween 20洗三次，各5min，每次加的洗涤液体宜超过100ml；5.Primary Antibody（血清）与PBS--0.05%Tween 20按1∶5000—1∶20000的比例混合浸泡膜1hr；（我们的亚历山大藻用1：5000，东海原甲藻1：2500基本上就应该可以做出不错的结果，具体的滴度可以根据你做实验的情况调节，若背景太高，调低滴度，显示的点太少，调高滴度）6.PBS--0.05%Tween 20洗五次，各5min；（可以不用每次都夹起膜，第一次夹起就好啦）7.Secondary Antibody与PBS--0.05%Tween 20按1∶5000—1∶20000的比例混合浸泡膜1hr；(我们的二抗滴度都是使用1：5000就好)8.PBS--0.05%Tween 20洗七次（如背景太黑，需更多次），各5min；9.Develop color：染色（ECL）、操作注意事项：超作到第7次时，准备ECL的试剂，两个瓶子中的液体千万不能混淆，枪头一定要换！！！否则ECL试剂盒会完全作废。
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以下为组蛋白电泳与转膜的一些注意事项，其它步聚同一般的western操作。
上样量：0.75mm 厚的 10孔梳所制胶孔的最多上样量为20ul。
0.5-1ug 总组蛋白/孔。
如果用1mm厚的10孔梳，上样量可能多一些，25ul。
【BioRad】
电泳【BioRad电泳设备】：SDS-PAGE时，分离胶浓度为 14-16%。
选恒压：150V, 约电泳50min-70min.。
蛋白分子量标准：低分子量
转膜：
用NC膜，转膜缓冲液含20% 甲醇, 0.04% SDS。
湿法转膜，75V, 4h-6h, 为了防止发热，我们当时转膜时把转膜电泳槽放在冰盒中进行。
如果用PVDF膜，则省去上述转膜缓冲液中的SDS。
恒压100V、2小时能够转移一半蛋白到膜上。
更长的转膜时间可能能够提高转移的量。
转膜后，将膜取下用Pouseau S染色，检查是否转膜成功、样品间蛋白量是否一致。
同时用考玛氏亮蓝对胶进行染色，检查胶上的蛋白殘留量。
如果转移充分，应看不到明显的蛋白带。
Bulk Histones 通过 SDS-PAGE分离，会由上至下显示出以下蛋白带: H1, H3,
H2A/H2B, H4。
但这些带靠得非常近。