ITS菌种鉴定方-法
its引物pcr体系学则
its引物pcr体系学则
PCR（聚合酶链反应）是一种在体外复制DNA片段的技术。
ITS （内转录间隔区）是真菌分类和鉴定的一种标记。
ITS引物PCR是一种基于PCR技术使用ITS序列进行菌种分类和鉴定的方法。
ITS引物PCR体系是包含DNA模板，引物，酶和缺失DNA，反应缓冲液和其他诸如浓度和pH值等条件的反应混合物。
常见的ITS引物包括ITS1和ITS4，是从内转录间隔区序列中选择的特定引物。
PCR反应分为三步，即变性、回退和延伸。
引物与DNA模板杂交，引物延伸成DNA链，扩增目标DNA序列，不断重复该过程可得到数百万个复制的DNA片段。
ITS引物PCR技术可以在短时间内快速确定真菌的系统分类位置和物种鉴定。
它简单易行，并可用于复杂菌群的鉴定。
因此，在微生物学、生态学、农业、食品科学等领域中得到了广泛的应用。
菌种鉴定方法大全
菌种鉴定方法大全一、金开瑞菌种鉴定服务简介在细菌/真菌的16/18SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌/真菌通用引物，扩增出细菌/真菌的16/18SrDNA片。
因此，16/18SrDNA可以作为细菌/真菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
该鉴定手段试用于单种鉴定或者少量混杂菌种鉴定。
金开瑞拥有多种配套的通用菌种鉴定引物，实验周期短，可以帮您快速实现菌种鉴定。
服务流程引物设计合成—PCR扩增16/18S rDNA/ITS—PCR产物纯化—测序，序列比对分析客户提供基因组DNA：要求基因组DNA的浓度≥100 ng/μl，总体积≥20 μl，且无明显降解；平板或斜面：经菌种分离后带有单菌落的新鲜平板或斜面。
最终交付测序结果，BLAST比对得到细菌种属名称服务内容及说明服务名称服务周期（工作日）原核生物/16SrDNA5-7真核生物/18SrDNA5-7真菌ITS序列分析5-7二、菌种鉴定方法介绍（1）常规鉴定常规鉴定内容有形态特征和生理生化特征。
形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应等。
（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。
通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。
该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。
BIOLOG是一种微生物菌种快速鉴定系统，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。
（3）分子生物学鉴定应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。
CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。
一种用ITS1区测序方法鉴定独活药材
一种用ITS1区测序鉴定独活药材的方法最近省食品药品检验研究院的一位老师想知道一些栽培的独活药材经过长期的人工种植是否产生了变种（药材成品的外观上差异确实挺大的），于是请我们的实验室尝试了一次从分子生物学角度来探索这些药材是否已经产生了变化。
一、实验目的鉴定6种独活药材的亲缘关系。
二、实验材料1.对照独活DH-0、待测样本DH-1、DH-7、DH-10、DH-14、DH-18药材图片如下：2.研钵、1.5ml离心管、2ml离心管若干。
3.植物/真菌DNA试剂盒（Simgen Cat.No.3200050）4.2×PCR Mix（Simgen Cat.No.7003100）5.ITS1区引物（F:CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA/R:GCTACGTTCTTCATCGAT）6.超微量电子天平（DENVER INSTRUMENT,TP-213）、电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）、旋涡振荡器（越新仪器，XH-C）、台式离心机（eppendorf centrifuge5415D）、超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）、电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型）、PCR仪（Techne FPROG5Y Progene Thermal）三、实验方法（一）DNA提取1.称取50mg样本于研钵中，加入200μl65℃预热的Buffer PD和2μlβ-巯基乙醇，用力研磨至匀浆状。
2.研磨充分后加入800μl65℃预热的Buffer PD，继续研磨1分钟，使组织完全裂解。
3.转移800μl裂解产物至2ml离心管中，将离心管置65℃水浴30分钟。
水浴期间每隔5~10分钟翻转离心管数次以帮助DNA的释放。
4.加入800μl Buffer EX，用力混合均匀，12000rpm离心5分钟。
5.小心吸取上清，转入一个新的1.5ml管中。
6.在上清中加入等体积的Buffer GP，混合均匀。
ITS序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用
2 ITS 在真菌分子检测中的应用
目前 ， 关于真菌分子检测的研究主要是针对致病真菌进 行的。 传统病原真菌的检测主要基于形态学特征 、致病性测定 等。 但是这种方法耗时长、程序繁琐，不宜从发病初期的植株中 分离鉴定病原菌，难以做到对病害的早期检测 。 随着生物学的 发展，很多生物技术应用于检测领域 ，如酶联免疫荧光技术。 但 是该方法利用多克隆抗体进行检测 ，特异性不强 ，实际应用中 存在漏检现象［22］。 近年来 ，利用 PCR 扩增病原真菌核糖体 ITS 基因片段进行病原菌检测得到了很大发展 。 由于核糖体基因
第1期
白树猛等 ：ITS 序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用
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面的研究起步较早，发展迅速，而且研究的范围比较广泛 ，主要 集中在黑粉菌 、疫霉菌 、轮枝菌 等植物病原菌的分类和系
［12］ ［13］ ［14］
利用 ITS 分子标记技术进行分子检测已经广泛应用于炭疽病 菌、大丽轮枝菌、黑斑病菌［27］、大豆疫霉菌等真菌分子检测中 。
ITS 序列系统发育树。 结菌株序列相似性较低 。 陈永青［8］等采用随机扩增多 态性 DNA 技术和核糖体 ITS 序列分析，对 22 种拟茎点霉共 34 个菌株进行了系统发育研究 ，结果表明 ，两种技术用于拟茎点 霉的亲缘关系分析和种类鉴定是可行的。 杨雅云［9］等对马铃薯 及番茄晚疫病菌的核糖体 DNA 的 ITS 区段序列分析表明 ，相 似的序列使得生物学特性也很相似 ，从而确定它们的亲缘关系 也就近。Karen 等［10］对 l7 属 44 种外生菌根菌 rDNA 上的 ITS 多 样性进行了研究 ，证实了 ITS 区域种间多样性较高 ，而种内多 样性较低。 Pritsch 等［11］系统研究了赤杨根系 16 种不同形态类 型的外生菌根 ITS 的多态性 ， 并与采集于 3 个赤杨林地的 28 种外生菌根菌的子实体 ITS 多态性进行了比较研究 。 国外这方
白僵菌菌株的ITS序列鉴定
Science &Technology Vision 科技视界白僵菌属Beauveria Vuill.是全球分布的最常见的土壤虫生真菌[1],包含有球孢白僵菌B.bassiana (Bals.-Criv.)Vuill.和布氏白僵菌B.brongniartii (Sacc.)Petch 这两种具有重要经济价值的种类。
前者是森林生态系统中最为常见的一种昆虫病原真菌,属世界性分布物种,是害虫虫口自然调节的重要因子和以菌治虫的重要生物防治材料[2]。
因其具有致病性强、寄主范围广、对动物植物无害、不污染环境及易培养的优点,被认为是最具开发潜力和应用价值的虫生真菌之一[3]。
随着分子生物学技术的发展,相关技术也开始广泛被应用于昆虫病原真菌的分类和鉴定中。
ITS (内转录间隔区Internal Transcribed Spacer)ITS 区域序列的测定是目前真菌分类研究的一项重要技术手段,对于鉴定白僵菌及研究真菌属内和属间遗传关系具有重要作用[4-8]。
ITS 区指的是5.8S rDNA、18S rDNA 和28S rDNA 之间的转录间隔区,因其进化相对迅速而具多态性与保守性,对此序列的检测有助于分析菌株的遗传关系适合较低水平的系统学研究,真菌的ITS 序列长度一般在550-750bp(碱基对)。
ITS 序列主要被用于对不同生物型、菌株、种、属的分类鉴定,也可用于研究近或低级分类阶元的系统发育。
本文以研究室保存的8株白僵菌菌株为研究材料,通过对其ITS 序列的鉴定,明确菌株的遗传背景,找出不同菌株间的遗传差异,为进一步的研究提供准确可靠的研究材料。
1材料与方法1.1供试菌株随机选取8株于本实验室保存的球孢白僵菌菌株进行实验。
其编号分别为Bb01-Bb08。
1.2培养基液体SDY 培养基:蛋白胨1.0%,酵母粉1.0%,葡萄糖4.0%,pH 值7.0;PDA 培养基:200g 土豆去皮沸水煮20min,取汁,葡萄糖2.0%,琼脂粉2.0%。
基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品
基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品张嘉丽;黄宇航;宋明;任阳阳;张梦婷;刘霞;孙伟;陈士林【摘要】目的:运用ITS序列鉴别真菌类药材马勃Lasiosphaera calvatia及其混伪品.方法:收集来自重庆、北京等9个地方的21份脱皮马勃、大马勃、紫色马勃样品,提取基因组DNA,经PCR扩增后双向测序.同时从GenBank上下载常见马勃药材混伪品的序列.将所有序列进行剪切校准拼接后分析,基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型计算马勃及其混伪品的种内和种间遗传距离,并构建Neighbor-Joining(NJ)系统聚类树.结果:大马勃的ITS序列种内最大K2P遗传距离为0;脱皮马勃的ITS序列种内最大K2P遗传距离为0.003;紫色马勃的ITS序列种内最大遗传距离为0.003.大马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.019,脱皮马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.031,紫色马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.634.大马勃、脱皮马勃、紫色马勃的种内最大遗传距离均小于它们与混伪品的种间最小遗传距离.NJ树结果显示大马勃、紫色马勃、脱皮马勃各自聚为一支,表现出良好的单系性,能够与混伪品明显的区别开来.结论:基于ITS序列的条形码技术可以将马勃药材及其混伪品有效进行鉴别.【期刊名称】《世界中医药》【年(卷),期】2016(011)005【总页数】5页(P777-780,785)【关键词】马勃;混伪品;ITS;条形码【作者】张嘉丽;黄宇航;宋明;任阳阳;张梦婷;刘霞;孙伟;陈士林【作者单位】武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;中国中医科学院中药研究所,北京,100700;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;安利(中国)植物研发中心,无锡,214145;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;中国中医科学院中药研究所,北京,100700;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;中国中医科学院中药研究所,北京,100700【正文语种】中文【中图分类】R282马勃Lasiosphaera calvatia为灰包科真菌脱皮马勃Lasiosphaera fenzlii Reich.、大马勃Calvatia gigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd、紫色马勃Calvatialilacina(Mont.et Berk.)Lloyd的干燥子实体，能够清肺利咽、止血，用于治疗风热郁肺咽痛，音哑，咳嗽；外治鼻衄，创伤出血[1]。
ITS菌种鉴定方 法
利用ITS 进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。
ITS 是内源转录间隔区( Internally Transcribed Spacer)的英文缩写, 位于rRNA 编码基因18S,5. 8S和28S之间的小基因片段。
其优点有: 具有高拷贝数,整个序列的长度在600～800 bp，利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列, 能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rRNA基因(rDNA)在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。
这些rDNA高度保守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个,这使得保守区域能够很容易被扩增出来。
每个重复的rDNA 序列的存在方式为由一前一后的18S rDNA 小亚基单元(SSU) , 5.8S rDNA, 28S rDNA大亚基单元(LSU)组成,已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。
本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增, 同源序列的对比分析,结合传统鉴定方法,对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定,并对鉴定结果和方法进行了比较分析。
种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区Ⅰ和Ⅱ（分别为ITSⅠ和ITSⅡ）的片段大小上。
ITS区在核糖DNA中进化较快，可在同一属间甚至群体间发生变化。
其中ITSⅡ区在种间变异性较高（22％），种内变异性较低（＜3％）。
选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITSⅠ区、5.8SrDNA和ITSⅡ区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属的3个菌种；引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8S rDNA和28S rDNA之间的ITSⅡ区的保守顺序，可以鉴别出念珠菌属的7个菌种。
因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且具有更高的属种特异性。
1、通用引物①：ITS1 5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG一3’ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3’通用引物②ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3’ITS86 5'-GTGA ATCA TCGA ATCT TTGA AC一3’。
真菌its鉴定
真菌its鉴定真菌（Fungi）是一类特殊的生物，可以在各种环境中生存并繁殖。
它们通常以分解有机物质为生，有着重要的生态作用。
在鉴定真菌时，我们可以使用ITS（Internal Transcribed Spacer）序列来进行分析和判断。
ITS序列位于真菌的核糖体RNA基因间区域，是真菌基因组中高度变异的部分。
通过对ITS序列的测定和比对，我们可以确定真菌的物种归属和亲缘关系。
ITS序列的鉴定已经成为现代真菌分类学的重要手段之一。
ITS序列的鉴定过程通常包括以下几个步骤：第一步是样品的采集和处理。
我们可以从土壤、水体、植物组织、动物体表等不同的环境中采集样品。
采集后，我们需要将样品进行处理，提取其中的真菌DNA。
第二步是PCR扩增。
在这一步中，我们使用特定的引物对样品中的ITS序列进行扩增。
PCR扩增是一种将目标DNA序列扩大数百倍的技术，可以提高后续的测序效果。
第三步是测序和比对。
在这一步中，我们使用测序仪对PCR扩增得到的产物进行测序。
测序结果将是一系列的碱基序列，我们可以将这些序列与已知的ITS序列数据库进行比对，以确定真菌的物种归属。
第四步是数据分析和解读。
在这一步中，我们将根据比对结果来判断真菌的物种归属和亲缘关系。
通常情况下，我们会将测序结果与数据库中的参考序列进行比对，并计算相似性和进化距离等指标来评估真菌的分类位置。
通过ITS序列的鉴定，我们可以辨别出不同物种的真菌，了解其在生态系统中的分布和功能。
这对于研究真菌的多样性、生态学和进化等方面具有重要意义。
除了ITS序列，还有其他一些DNA标记物可以用于真菌的鉴定，如18S rRNA、28S rRNA等。
不同的标记物具有不同的特点和应用领域，在具体的研究中可以根据需要选择合适的标记物进行分析。
总结起来，真菌的ITS序列鉴定是一种常用且有效的方法，可以帮助我们准确地鉴定真菌的物种归属和亲缘关系。
随着测序技术的不断发展和数据库的不断完善，我们对真菌的了解也将越来越深入。
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利用ITS进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。
ITS是内源转录间隔区（In ternally Tran scribed Spacer）的英文缩写,位于rRNA 编码基因18S,5. 8S和28S之间的小基因片段。
其优点有：具有高拷贝数,整个序列的长度在600〜800 bp,利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列，能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rRNA基因（rDNA）在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。
这些rDNA高度保守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个，这使得保守区域能够很容易被扩增出来。
每个重复的rDNA序列的存在方式为由一前一后的18S rDNA小亚基单元（SSU）, 5.8S rDNA, 28S rDNA大亚基单元（LSU）组成，已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。
本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增, 同源序列的对比分析，结合传统鉴定方法，对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定，并对鉴定结果和方法进行了比较分析。
种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区I和U （分别为ITS I和ITS H）的片段大小上。
ITS 区在核糖DNA中进化较快，可在同一属间甚至群体间发生变化。
其中ITS U区在种间变异性较高（22%），种内变异性较低（V 3%）。
选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITS I区、5.8SrDNA 和ITS U
区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属的3个菌种；引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8S rDNA和28S rDNA之间的ITS H区的保守顺序，可以鉴别出念珠菌属的7个菌种。
因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且具有更高的属种特异性。
ns r nsn
1、通用引物①:
ITS1 5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG — 3' ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC 一 3' 通用引物②
ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC 一 3' ITS86 5'-GTGA ATCA TCGA ATCT TTGA AC 一 3' U 通用引物①土
1TS1 ——► 5s TCCG TAGG TGAA CCTG CGG —『 ITS i ——k 5* -TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC 3'
通用引物②
】TS1 ——► a -TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC —3k
ITS86 -------- 5F -CTGA ATCA TCGA ATCT TTGA AC-3'
2、反用体系£50ul ）
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91 fTf!变 fl.
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1 u L 上游引物（ITS4）
2 ul. 卜‘游引物（TTS8G ） 2 UL TriqNJ 0,a li I, ddIQO
30. S uL
2 uL
加完城剂后.
呵以加到一起.再分装
Accession Description Max score Total score Query covei BA000030.3Streptomyces avermitilis MA-4680 DHA, complete genome 2028397498% AL939123.1Streptomyces coelicolor A3(2) complete genome; segment 20/29 2248224898% AJ001205.3Streptomyces coelicolor A3(2) glycoger： metabo'ism cluster! 223?223798% HQ915641.1Streptomyces griseus subsp gnseus strain CGMCC 4.1419 trehaose synthase 1991199198% AP009493.1Streptomyces gnseus sjbsp gnseus HBRC133S0 ONA, complete genome 1991199198% FN554889.1Streptomyces scabiei 87.22 complete genome 2122421698% CP002475.1Streptomyces flavogriseus ATCC 33331, complete genome 1969196998% CP002993.1Streptomyces sp. SirexAA-E, complete genome 1921192198% AP010968.1Kitasatospora setae KM-60S4 DMA, complete genome 1707433197% CP003275.1Streptomyces hygroscopicus subsp.jinggangersis 5008, compete genome 2342458797% CP002994.1Streptomyces violaceusnigerlu 4113, complete genome 1919191997% CP003219.1Streptomyces cattleya DSM 46488丿complete genome 1908334697% FQB59185.1Streptomyces cattleya str. HRRL 8057 main chromcsome, comp ete genome 1908334697% CP002047.1Streptomyces bmgchenggensis BCW-1, complete genome 1969196997% AL939131.1Streptomyces coelicolor A3(2) complete genome; segment 28/29 2189218997% AJ001206.2Streptomyces coelicolor A3(2), glycogen metabolism cluster K 2189218997% "1238663,1Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 ieft chromosomal arm 2139213997% FR845719.1Streptomyces venezuelae ATCC 10712 complete genome 1905190597% FO117623.1Blastococcus saxobsidens DD2 complete genome 1212128194% CP001874.1Thermobispora bispora DSM 43833. complete genome 1225225194%。